1、实验二实验二 水中总大肠菌群的测水中总大肠菌群的测定发酵法定发酵法 1.掌握发酵法测定大肠菌群数的基本原掌握发酵法测定大肠菌群数的基本原 理及意义理及意义实验目的和要求实验目的和要求 原理：原理：根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸根据大肠菌群细菌能发酵乳糖、产酸产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈产气以及具备革兰氏染色阴性，无芽孢，呈杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求杆状等有关特性，通过三个步骤进行检验求得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可得水样中的总大肠菌群数。试验结果以最可能数（能数（most probable number），简称），简称MPN表示。表示。意义：意义：常用于推断样品
2、是否被人、畜粪常用于推断样品是否被人、畜粪便污染以及污染程度和存在肠道致病菌便污染以及污染程度和存在肠道致病菌的可能性。的可能性。2.掌握发酵法测定水中总大肠菌群的掌握发酵法测定水中总大肠菌群的 试验的具体操作过程及方法试验的具体操作过程及方法初发酵初发酵 复发酵复发酵 平板分离平板分离 实验步骤实验步骤1.乳糖蛋白冻培养基制备：第乳糖蛋白冻培养基制备：第1组组3倍的：倍的：250 ml，1倍的：取倍的：取150 ml 3倍的稀释成倍的稀释成1倍的倍的调调PH1倍的倍的一、培养基的制备及灭菌一、培养基的制备及灭菌不需加热不需加热2.乳糖蛋白冻培养基分装乳糖蛋白冻培养基分装(12个组个组)杜氏小
3、管杜氏小管杜氏小管杜氏小管杜氏小管杜氏小管杜氏小管杜氏小管5 ml 3倍倍10 ml 1倍倍10 ml 1倍倍10 ml 1倍倍3.配置伊红美蓝琼脂培养基配置伊红美蓝琼脂培养基1300 ml，每组分每组分100 ml，第，第1组组灭菌完，灭菌完，55oC时加伊红、美蓝时加伊红、美蓝乳糖也要加乳糖也要加倒平板倒平板4-5个个100 ml2 ml 伊红伊红1 ml 美蓝美蓝3.准备其他要灭菌的准备其他要灭菌的:4.灭菌灭菌:115 OC，20 min水源水源水水90 ml无菌水无菌水9 ml无菌水无菌水二、水样的采集和制备二、水样的采集和制备1.采样瓶采样瓶2.采集湖水水面下采集湖水水面下10 c
4、m的水样的水样3.将湖水自来水将湖水自来水1：1混匀，混匀，作为实验的原液作为实验的原液200 ml原液原液三、水样的稀释三、水样的稀释1 ml水源水水源水200 ml原液原液10 ml90 ml无菌水无菌水9 ml无菌水无菌水原液原液10-110-2四、大肠菌群的测定四、大肠菌群的测定原液原液10-110-210 ml杜氏小管杜氏小管杜氏小杜氏小管管杜氏小管杜氏小管杜氏小管杜氏小管5 ml 3倍倍10 ml 1倍倍10 ml 1倍倍10 ml 1倍倍1 ml1 ml1 ml3724h五、观察大肠菌群的初发酵结果五、观察大肠菌群的初发酵结果1.培养基变为黄色，杜氏管中有气泡培养基变为黄色，杜氏
5、管中有气泡2.培养基仍为紫色，杜氏管中没有气泡气泡培养基仍为紫色，杜氏管中没有气泡气泡杜氏小管杜氏小管第一区划线第一区划线灭菌接种环灭菌接种环第二区划线第二区划线灭菌接种环灭菌接种环第三区划线第三区划线灭菌接种环灭菌接种环37，24h六、大肠菌群的平板分离六、大肠菌群的平板分离平板划线平板划线杜氏小管杜氏小管七、革兰氏染色七、革兰氏染色1.涂片涂片2.干燥干燥3.固定固定4.染色染色：结晶紫，：结晶紫，1min,水洗水洗 5.媒染：典液，媒染：典液，1min,水洗水洗6.脱色：脱色：95%乙醇，乙醇，30 s，水洗，水洗7.复染：沙黄复染液，复染：沙黄复染液，1 min。或石碳酸复红，。或石碳酸复红，10 s8.水洗、待干、镜检水洗、待干、镜检:紫色或红色紫色或红色9.染色标本的保存与封片染色标本的保存与封片八、复发酵八、复发酵九、大肠菌群测定的结果分析与报告九、大肠菌群测定的结果分析与报告实验报告实验报告1.实验目的实验目的2.实验原理实验原理3.实验步骤实验步骤4.实验结果实验结果5.讨论讨论
