1、医疗研究生开题报告n六、已具备条件n七、可行性n八、研究主要阶段、进度和完成时间n九、经费预算n十、实验风险及前景分析医疗研究生开题报告2一、课题名称PVRL1基因SNPs与环境交互作用和非综合征型唇腭裂的关联性研究医疗研究生开题报告3二、研究目的及意义n探讨PVRL1的SNPs在NSCL/P的可能作用n探讨NSCL/P与环境因素的因果关系n揭示基因-环境交互作用研究目的：医疗研究生开题报告4n为NSCL/P基因诊断提供依据n为NSCL/P家庭提供遗传咨询n为广东人群基因数据库积累资料研究意义：医疗研究生开题报告5三、立论依据及研究现状n唇腭裂畸形是人类最常见的先天性发育缺陷之一，全世界发病率
2、约为12。我国是世界上唇腭裂的高发国家之一，发病率约1.82。医疗研究生开题报告6n非综合征型唇腭裂（NSCL/P,MIM 119530）是指不伴发其他系统、器官畸形的，不在某些综合征之列的唇裂、唇裂合并腭裂、及腭裂的总成，约占先天性唇腭裂70%。医疗研究生开题报告7n目前的研究认为NSCL/P是一类多因素复杂疾病，其发生是遗传和环境多种因素相互作用的结果，其遗传易感性和基因-环境交互作用是病因学研究的热点。医疗研究生开题报告8医疗研究生开题报告9一、环境因素n环境生物因素：孕早期微生物感染是导致NSCL/P的重要危险因素之一。nMetneki J等2005年在匈牙利的一项大规模以人群为基础的
3、病例对照研究中表明，妇女在孕早期患普通感冒及流感显著增加了子代唇腭裂患病的危险性（OR=2.3和2.8）。医疗研究生开题报告10n环境物理因素：环境物理因素主要包括电磁辐射（X-RAY、微波、无线电波、电视、手机、电脑等），噪音等。nBlaasaas KG等2002年的研究发现，孕妇每周接触50HZ电磁辐射大于24小时时，唇裂的发病风险增加（OR=1.78）。医疗研究生开题报告11n环境化学因素：包括药物、环境污染、烟酒嗜好、孕期营养等。nEricson等2001年在对1995-1998年出生的2557例婴儿进行研究，发现母亲妊娠期间服用NASID导致唇腭裂的风险增加（OR=2.51）。nCh
4、uangsuwanich等1998年在泰国的流行病学调查发现52.74%的唇裂患者母亲有孕期服药史。医疗研究生开题报告12n环境污染：Marco Vinceti等2001年在意大利北部铅污染地区进行了以人群为基础的病例对照研究，发现铅污染使唇腭裂发病风险增加（OR=2.28）。医疗研究生开题报告13n烟酒嗜好：Bailey LJ等在1995年的研究中证明孕早期吸烟，产生的CO降低了胎儿的O2供应，从而促使唇腭裂的发生。nHartsfield JK等在2001年的研究中认为烟草的复合物可能影响遗传物质的合成及应用。医疗研究生开题报告14n孕期营养：Ingrid PC等2004年的研究中认为孕期增
5、加植物蛋白、植物纤维、抗坏血酸等的摄入可降低唇腭裂发生。n张思雷等2002年在对地塞米松诱导大鼠腭裂形成的研究中认为增加VitB6促进体内氨基酸和脂肪代谢等多种生命代谢，有助于胚胎修复唇腭裂畸形，增强抵抗力，降低先天性畸形的易感性。医疗研究生开题报告15二、个体因素nShaw GM等1999年的研究中认为孕妇年龄、文化程度、剧烈妊娠反应及妊娠并发症与唇腭裂的发病相关；不同胎次唇腭裂的发生率有高度显著性差异；体重轻的新生儿唇腭裂患病率高。医疗研究生开题报告16nSpilson等2001年的研究中发现糖尿病孕妇生育唇腭裂患儿的危险性是非糖尿病孕妇的1.3倍。医疗研究生开题报告17三、遗传因素n早期
6、的遗传因素研究由于受研究方法、实验手段不够丰富所限制，学者们多通过已被证实的单基因致病的包含有唇腭裂的综合征来反推NSCL/P的易感基因。医疗研究生开题报告18n 近年来，随着人类基因组计划(HGP)的实施以及基因芯片技术的发展，对易感基因的研究及新易感基因的寻找更倾向于全基因组关联分析(GWAS)，这是发现影响复杂性疾病发生的遗传特征的一种新策略。医疗研究生开题报告19医疗研究生开题报告20医疗研究生开题报告21n另外，国内外现在多认为单纯性腭裂（cleft palate only,CPO）和唇裂伴或者不伴有腭裂（cleft lip with or without cleft palate,
7、CL/P）有不同的遗传学背景。前者倾向于单一主要基因影响（X和2号染色体）；后者受多种基因影响（1、2、4、6、9、11、14、16、19号染色体均有相关基因或位点）医疗研究生开题报告22nCLP易感基因定位及相关文献研究nCPO易感基因定位及相关文献研究医疗研究生开题报告23nPVRL1（Poliovirus Receptor Like-1）位于Chr11 q23.2区，编码细胞-细胞粘附受体，协同钙粘素调整上皮黏着连接形成的速度，并影响上皮细胞之间紧密连接的形成，对上皮粘附的发生和维持起重要作用。PVRL1基因(本课题研究基因)医疗研究生开题报告24n目前有关脊髓灰质炎病毒受体相关基因1（
8、PVRL1）多态性与人群NSCL/P的关系还不十分清楚，国内外不同研究机构对该基因研究结果报道不尽一致，甚至相互背离。这可能与基因存在种族和地区差异性、样本量、研究方法、评定原则相关。医疗研究生开题报告25n较早的对PVRL1和NSCL/P的相关性研究是2000年美国学者Suzuki Kj等在加勒比海的Margarita Island对CLPED1（MIM 225000，MIM 225060)患者研究中发现了PVRL1编码的185（TGGT-G）和323(GGTGGTT)位氨基酸突变，此后在北部委内瑞拉的NSCL/P患者中同样发现了PVRL1编码的185(TGGT-G)位氨基酸的突变；同时，他
9、们的研究还证实了该无义突变导致PVRL1编码的肽链的长度缩短，进而可能影响上皮粘附的发生。医疗研究生开题报告26n然而Scapoli L等2005年在意大利人群中并没有发现W185X的突变，但是他们发现了R199Q、R210H、R212H、D424D这些突变，正常人中这几个氨基酸均为保守序列。医疗研究生开题报告27nTseng等2006年在台湾的NSCL/P患者和PVRL1的关联研究中得出的结论是185 和323密码子，特别是W185X的突变，也是并不参与台湾人群的NSCL/P形成。医疗研究生开题报告28n赵雄等2009年在对江浙地区汉族人群的PVRL1研究中，也没有发现W185X突变或者其他
10、可信的多态性位点，得出结论是PVRL1基因exon3可能不参与江浙人群NSCL/P发病医疗研究生开题报告29n另外，Avila等2006年在挪威、菲律宾、南美人群中对PVRL1的研究中总共发现了25个与NSCL/P相关的突变位点。其中比较有意义的S112T和T131A均出现在PVRL1 V区的关键氨基酸附近，该区域之前被认为是介导细胞-细胞粘附和细胞-病毒粘附的区域；还有G361V出现在跨膜区，被认为可能影响PVRL1的结构。医疗研究生开题报告30nTongkobpetch等2008年发现，泰国CL/P 患者的PVRL1 基因第6 外显子的1183GA 具有杂合性，会导致395（V395M）位
11、的缬氨酸被甲硫氨酸取代。医疗研究生开题报告31n然而舒申友等在2010年对PVRL1的病例对照研究中，并没有发现证据表明S112T、T131A、G361V和V395M参与了广东人群的NSCL/P形成。医疗研究生开题报告32nTurhani等在2005年欧洲人群的研究中发现CLMPT1基因的内含子IVS7-10G/A，外显子Gly331Gly,Ala88Ala,Pro309Pro的突变联合PVRL1基因的Glu441-Gly442插入Glu突变同时发生的话，可能是NSCL/P的遗传因素。医疗研究生开题报告33n综上所述，国内外的研究机构对PVRL1基因的多态性与NSCL/P的发病关联性研究中存在
12、比较大的分歧，这样的结果一方面可以理解为人群的遗传背景不同，另一方面也与一些研究中的设计（例如样本量，纳入研究范围的样本）不同有关系。这样的原因导致统计强度不够，可能存在未被发现的多态性位点或者有意义的已知突变位点被误筛。医疗研究生开题报告34四、实验方法n基于以上理论，采取可信公认的研究方法，在PVRL1基因90kbp的bases中筛查可疑的多态性位点，进而对阳性位点附近序列进行测序，而后进行病例-对照研究和家系分析两种分析方法揭示PVRL1基因单个SNP位点或单倍型与NSCL/P的关系，最后揭示PVRL1基因的多态性与环境因素（流行病学调查）的交互作用与唇腭裂发病的关联，是本研究的技术路线
13、。医疗研究生开题报告35路线一n1、病例筛选：选取2008-2010年在我中心住院手术的NSCL/P患者核心家庭200个（共600个个体），另外150例NSCL/P患者（单纯患者，无父母参与）和350例健康志愿者对照组。提取外周静脉血10ml备用。n2、提取所有研究对象共1100份基因组DNA。医疗研究生开题报告36n3、从人类基因组单体型计划(HapMap Project)数据库中已有的891个已知PVRL1基因的SNPs中使用软件SNPbrowser4.0(ABI)挑选出26个Tag SNPs（每个可以代表4000bp碱基段），使用引物单碱基延伸+基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALD
14、I-TOF）的方法行SNP分型并LD检验行单体型分析。医疗研究生开题报告37单体型分析图A six-nucleotide insertion-deletion polymorphism inthe CASP8 promoter is associated with susceptibilityto multiple cancers.NATURE GENETICS VOLUME 39 NUMBER 5 MAY 2007医疗研究生开题报告38医疗研究生开题报告39医疗研究生开题报告40医疗研究生开题报告41n5、发现阳性位点之后，在阳性位点附近安排24轮DNA测序（Sanger法，每个反应扩增50
15、0个bp左右，若4轮反应则总共检测2000个bp左右片段，共700个样本），力求发现新的未被报道的突变位点。医疗研究生开题报告43n6、同样使用MALDI-TOF的方法行200个核心家系父母（共400个个体）SNP分型。而后结合前述所在家庭患儿的SNP分型进行传递不平衡检验，力求发现阳性（与NSCL/P有关联）的过传递位点。医疗研究生开题报告44n附：统计分析将使用软件：nHAPLOVIER3.32软件行等位基因的HWE检验、等位基因和单倍型的关联分析等。nPLINK软件行基因型和等位基因的关联分析。nUNPHRASED软件行病例-对照研究。医疗研究生开题报告45路线二n1、对研究对象（200
16、个核心家庭）父母进行电话调查，具体调查项目包括儿童基本情况、父母基本情况、母亲妊娠早期情况、母亲既往史等。n2、进行资料统一编码，建立数据库并录入数据。n3、分析暴露因素与NSCL/P发生的关系。医疗研究生开题报告46技术路线图医疗研究生开题报告47五、预期目标n1、揭示PVRL1基因在广东人群中的单体型。并与NSCL/P建立关联。n2、发现新的SNP位点或者突变的DNA片段。并与NSCL/P建立关联。n3、揭示广东人群唇腭裂的环境危险因素。n4、探讨环境因素和遗传因素在NSCL/P发病中的交互作用。医疗研究生开题报告48六、已具备条件n1、本研究前期标本（血样）收集已经完成。n2、2010年
17、在本中心的一个广东省自然基金课题中已经对PVRL1基因作了初步研究，但是样本量只选取了71患者和100个对照，样本量不够降低了统计检验的强度。n3、本中心对NSCL/P易感基因的研究已经积累充分经验，可提供宝贵的理论和实践指导。医疗研究生开题报告49七、可行性n1、本研究样本量较大，结果真实性和可靠性较有保证。n2、MALDI-TOF检测方法被众多SCI杂志推荐为SNP检测方法。尽管TAQMAN探针法的特异性更高，但是相对于质谱法其成本贵，通量也不如质谱。医疗研究生开题报告50八、工作主要阶段、进度和完成时间n1、实验所需血样基因组DNA已大部分提取完毕。n2、TAG SNPs已选取完毕。n3
18、、已与上海邃志生物技术公司联系，洽谈委托试验。n4、2011。3月开始实验，预期于2011。10月完成全部实验和结果分析，并撰写论文投稿。医疗研究生开题报告51九、经费预算n1、基因组DNA提取试剂盒6盒（天根生物技术公司）约合RMB 10,000。n2、SNPs质谱分析部分1100个样本量约RMB 100,000。n3、预期发现14个阳性位点，若发现一个阳性位点，于位点周围安排4轮测序，每个反应RMB 3035，则总计RMB 72,000。n总计RMB 180,000。医疗研究生开题报告52十、实验风险和前景分析n1、若是无法发现阳性SNP位点，将导致后续测序等工作无法进一步进行。若是没有发现关联的SNP位点，至少在研究中借鉴的是目前较为主流的全基因组关联分析（GWAS）方法，阴性的结果也具有可信性。可能说明该基因的多态性不参与广东人群的NSCL/P发病。医疗研究生开题报告53n2、实验所用血样已经至少经过2次冻融，基因组DNA降解程度或较高，可能会影响后续实验。医疗研究生开题报告54n3、人群选择问题，病例组是广东、福建、广西、海南人群，而对照组几乎来自全国各地，可能产生人群混杂机会较大。医疗研究生开题报告55感谢聆听！医疗研究生开题报告56
