1、治疗性抗体研发的进展和关键技术主要内容主要内容n治疗性抗体研发概况治疗性抗体研发概况n治疗性抗体研发的主要进展治疗性抗体研发的主要进展n治疗性抗体研发中要注意的问题治疗性抗体研发中要注意的问题基因特克：Wassim NashabehTerminologies:Aggregates,main peak,fragmentsContainer Integrity TestingDi-,tri-sulfide bond formation N,O-Glycosylation,et al,mAbs,2010,2:3,285-298.CTLA-4 黑色素瘤FormulationHydrolysis(DP)
2、Formulation抗体分子结构特点：四条肽链，重链糖基化，结构上有较多二硫键通过双特异性抗体靶向效应细胞发现药物靶标的主要方法KADCYLA(T-DM1)二聚体克隆筛选是质量控制的关键步骤Assays:HPSEC,CE-SDS,SDS-PAGE,AUCVEGF 结肠癌 肺癌用抗体药物治疗的疾病用抗体药物治疗的疾病n肿瘤肿瘤n自身免疫病自身免疫病n感染性疾病感染性疾病n抗移植排斥抗移植排斥n心血管疾病心血管疾病n骨质疏松骨质疏松n罕见病罕见病n眼黄斑变性眼黄斑变性n炭疽炭疽抗体结构与功能关系抗体结构与功能关系抗体药物的作用机理抗体药物的作用机理n直接效应直接效应 诱导凋亡诱导凋亡 抑制增殖抑
3、制增殖 阻断生长因子或生长因子受体阻断生长因子或生长因子受体 干扰血管生成干扰血管生成n间接效应间接效应 依赖补体的细胞毒（依赖补体的细胞毒（CDC）依赖抗体的细胞毒（依赖抗体的细胞毒（ADCC)作为毒素、放射性同位素和细胞作为毒素、放射性同位素和细胞 毒药物的载体毒药物的载体 形成抗独特型抗体形成抗独特型抗体 通过双特异性抗体靶向效应细胞通过双特异性抗体靶向效应细胞抗体药物在临床应用中面临的挑战抗体药物在临床应用中面临的挑战n免疫原性免疫原性n杀伤靶细胞的活性弱杀伤靶细胞的活性弱n成药性问题成药性问题n新靶点新靶点抗体药物研发的主要进展抗体药物研发的主要进展n降低抗体的免疫原性降低抗体的免疫
4、原性n改变抗体的效应功能改变抗体的效应功能n提高抗体表达量提高抗体表达量n引入先进的抗体表征和质控方法引入先进的抗体表征和质控方法n改进抗体规模化生产技术改进抗体规模化生产技术n新靶点的发现新靶点的发现CDR移植移植FR移植移植SDR移植移植表面氨基酸重塑表面氨基酸重塑Phage display转基因鼠转基因鼠单细胞单细胞PCR人工设计人工设计抗体人源化和人源抗体抗体人源化和人源抗体人源抗体制备的主要技术人源抗体制备的主要技术nEB病毒转化人B细胞n人-人杂交瘤技术n抗体库技术n转基因小鼠n人工设计和合成人源抗体抗体库技术抗体库技术转基因小鼠转基因小鼠人工设计和合成人源抗体人工设计和合成人源抗
5、体Her2晶体结构晶体结构D4SDS-PAGESDS-PAGE非还原电泳非还原电泳155KDaHF人源表达抗体的纯化和功能鉴定人源表达抗体的纯化和功能鉴定HF人源抗体基因合成、构建、表达人源抗体基因合成、构建、表达人源化抗体设计、虚拟筛选人源化抗体设计、虚拟筛选抗体专家分析系统抗体专家分析系统抗原抗体复合物结构信息分析抗原抗体复合物结构信息分析HFHF人源抗体对人源抗体对Her2Her2+细胞细胞的的ADCCADCC杀伤效应分析杀伤效应分析HFHF人源抗体对人源抗体对Her2Her2靶点的特异性识别靶点的特异性识别1986199419971998200020012002200320042006
6、200720082009201020112012鼠源鼠源 嵌合嵌合 人源化人源化 人源人源FDAFDA批准的抗体药物批准的抗体药物OKT3ReoProRituxanZenapaxSimulectSynagisRemicadeHerceptinEnbrelMylotargCampathZevalinHumiraXolairBexxarRaptivaAvastinErbituxTysabriLucentisVectibixSolirisCimziaActemraStelaraSimponiIlarisArzerraNumaxProliaABThraxBenlystaYervoyPerjeta第二代
7、抗体药物第二代抗体药物抗抗TNF adalimuab(Humira，全人抗体），全人抗体）certolizumab（Cimzia，PEG修饰的修饰的Fab）golimumab（Simponi，全人抗体），全人抗体）抗抗CD20 ofatumumab（Arzerra，全人抗体）全人抗体）抗抗RSV motarizumab（亲和力更高）（亲和力更高）抗抗EGFR panitumumab （Vectibix，全人抗体全人抗体）抗体效应功能的改造抗体效应功能的改造n定点突变改造定点突变改造Fcn改变糖基化改变糖基化n双特异性或多特异性抗体双特异性或多特异性抗体减弱抗体的效应功能减弱抗体的效应功能nFc
8、Fc上进行定点突变上进行定点突变 Teplizumab(Leu234Ala,Leu235Ala)Teplizumab(Leu234Ala,Leu235Ala)n去糖基化去糖基化 Otelixizumab(Otelixizumab(去糖基化，去糖基化，Asn297Ala)Asn297Ala)n选择选择IgG4IgG4亚型或杂合亚型（亚型或杂合亚型（IgG2/IgG4IgG2/IgG4）nFcFc融合蛋白融合蛋白提高抗体的效应功能提高抗体的效应功能双特异性抗体双特异性抗体改变抗体改变抗体效应功能效应功能偶联细胞毒物质偶联细胞毒物质抗体抗体Fc突变突变改变抗体糖基化改变抗体糖基化细胞内抗体细胞内抗体
9、抗体融合蛋白抗体融合蛋白直接效应 诱导凋亡Terminologies:sequence polymorphism;mutation;mis-incorporation;sequence extension,insertion,deletion,and crossover.HER2 乳腺癌Basic Variants,18%MT111,MEDI565突变Met252Tyr，Ser254Thr，Thr256Glu增加抗体的半寿期S-GlutathionylationProduct RecoveryCD30 x CD16A抗CD20 ofatumumab（Arzerra，全人抗体）形成抗独特型抗体P
10、roteolytic processing(C-term)1 1 抗体抗体FcFc突变提高效应功能突变提高效应功能n突变突变Ser239AspSer239Asp，Glu330LeuGlu330Leu，ILe332GluILe332Glu提高提高ADCCADCCn突变突变Gly236AlaGly236Ala，Ser239AspSer239Asp，ILe332GluILe332Glu提高提高ADCPADCP和和ADCCADCCn杂合杂合IgGIgG亚型提高亚型提高CDCCDCn突变突变Met252TyrMet252Tyr，Ser254ThrSer254Thr，Thr256GluThr256Glu增
11、加增加抗体的半寿期抗体的半寿期2 改变抗体改变抗体Fc的糖基化的糖基化各种糖基化变化对抗体功能的影响各种糖基化变化对抗体功能的影响来自潘海报告第三代抗体药物第三代抗体药物抗抗CD20 obinutuzumab（糖基化改造，提高（糖基化改造，提高 ADCC）AME-133v(Fc改造，提高改造，提高ADCC)TRLI-05(Fc改造，提高改造，提高ADCC)Pro13192(Fc改造，提高改造，提高ADCC)抗抗RSV/F MEDI-557(Fc改造，增加半寿期改造，增加半寿期)3 3 抗体上偶联细胞毒物质抗体上偶联细胞毒物质n单单抗抗:癌癌细细胞表面胞表面过过量表达的抗原且能内吞。量表达的抗原
12、且能内吞。n偶偶联链联链:在血液中在血液中稳稳定但可以在定但可以在细细胞内胞内释释放毒素。放毒素。n毒素毒素药药物物:需要极毒的可以抑制需要极毒的可以抑制细细胞生胞生长长的化合物的化合物赖氨酸赖氨酸 偶联偶联轻重链间二硫键偶联轻重链间二硫键偶联定点偶联定点偶联KADCYLA(T-DM1)Genentech/ImmunogenADCETRIS(aCD33-vcMMAE)Seattle GeneticsThio-Mab or Ambrxs unnatural AA incoporation抗体抗体-药物偶联技术药物偶联技术FDAFDA批准的批准的ADCADC药物药物n放射性同位素，放射性同位素，B
13、exxar,Zevalinn毒素毒素n小分子药物，小分子药物，Mylotarg，T-DM1 Adcetris4 4 双特异性抗体双特异性抗体欧洲上市的双特异性抗体欧洲上市的双特异性抗体在临床试验的双特异性抗体在临床试验的双特异性抗体抗体名称抗体名称靶抗原靶抗原临床试验临床试验SAR156597IL4 x IL13Phase IAFM13CD30 x CD16APhase IFBT-A05,Bi20CD20 x CD3Phase IMT110EpCAM x CD3Phase IMT111,MEDI565CEA x CD3Phase IIMCgp100Gp100 x CD3Phase ITF2CE
14、A x IMP288 haptenPhase IMEHD-7945AEGFR x HER3;dual IgG1Phase IMM-111HER2 x HER3Phase ICVX-241Ang2 x VEGF;dual IgG1Phase IIOzoralizumab ATN103TNF x albuminPhase II5 5 免疫细胞因子免疫细胞因子靶抗原选择靶抗原选择n针对已确认过的靶 临床确认 实验确认n寻找新的功能性靶抗原自身免疫病的治疗靶自身免疫病的治疗靶上市抗肿瘤抗体药物的靶抗原上市抗肿瘤抗体药物的靶抗原靶分子靶分子 适适 应应 症症CD20 NHL CLLHER2 乳腺癌 CD
15、52 CLL EGFR 结肠癌 VEGF 结肠癌 肺癌 CD33 AML CTLA-4 黑色素瘤 CD30 淋巴瘤 发现药物靶标的主要方法发现药物靶标的主要方法n分子流行病学调查分子流行病学调查n人类遗传学研究人类遗传学研究n人类功能基因组学人类功能基因组学n蛋白组学蛋白组学n生物信息学生物信息学n药理学药理学n模式动物模式动物候选基因候选基因可成药的候选药靶可成药的候选药靶与疾病的相关性与疾病的相关性治疗性抗体研发中要注意治疗性抗体研发中要注意的问题的问题抗体分子结构特点：抗体分子结构特点：四条肽链，重链糖基四条肽链，重链糖基化，结构上有较多二硫键化，结构上有较多二硫键LProtein ex
16、pressionSolubilitystability 抗体结构与成药性的关系抗体结构与成药性的关系Master Cell BankWorking Cell BankRaw MaterialsSmall-scale Cell CultureLarge-scale Cell CultureProduct RecoveryProduct FiltrationFormulationPool BulksSterile Filter,Fill,and Partial Stopper VialsLyophilizeCap VialsLiquid ProductsProduct InspectionCont
17、ainer Integrity TestingLabeled Final Vial ProductPackaging单抗体生产工艺和过程单抗体生产工艺和过程Drug Substance李李锋锋Drug Product从细胞表达到病人临床注射，单抗体药物可能发生多种反应变化从细胞表达到病人临床注射，单抗体药物可能发生多种反应变化细胞培养细胞培养配伍制剂配伍制剂和储藏和储藏分离纯化分离纯化临床注射和临床注射和新陈代谢新陈代谢酶糖基化酶糖基化化学糖基化化学糖基化还原反应还原反应序列变异序列变异还原反应还原反应水解反应水解反应聚合化聚合化氧化反应氧化反应异构化异构化化学糖基化化学糖基化脱氨基化脱氨基化
18、巯基半胱胺酸化巯基半胱胺酸化酶降解反应酶降解反应理化分析和质量控制对于抗体制药工业各个环节起着支持和指导的重要作用。理化分析和质量控制对于抗体制药工业各个环节起着支持和指导的重要作用。如同眼睛对人的作用一样，没有好的分析手段和方法，抗体生产过程就可能走向歧途。如同眼睛对人的作用一样，没有好的分析手段和方法，抗体生产过程就可能走向歧途。引自张伯彦报告可变区：可变区：选择选择Gln为氨基末端，减少电荷变异为氨基末端，减少电荷变异 突变突变CDR区上不稳定的点区上不稳定的点 突变某些氨基酸，避免抗体聚合突变某些氨基酸，避免抗体聚合 去除可变区上的糖基化位点去除可变区上的糖基化位点恒定区：恒定区：铰链
19、区改造避免出现半个抗体和不规则铰链区改造避免出现半个抗体和不规则 二硫键或异型结构二硫键或异型结构 提高与提高与FcRn结合，增加血清半寿期结合，增加血清半寿期影响抗体药物稳定性和效能的因素影响抗体药物稳定性和效能的因素单抗体药物产品是各种变异体的混合物单抗体药物产品是各种变异体的混合物 电荷变异体电荷变异体 by iCIEF 7.07.27.47.67.88.08.28.48.68.89.09.29.4Lower pI MarkerUpper pI MarkerMain Peak,54%Acidic Variants,28%Basic Variants,18%序列变异体序列变异体 by Tr
20、yptic Peptide Map Clone#M83R 体积变异体体积变异体 by SEC 二聚体二聚体 n 脱氨基化脱氨基化(32)n Met 氧化氧化(22)n 糖基化（糖基化（22)n 高甘露糖化高甘露糖化,G0,G1,G1,G2（5）n 唾液酸化（唾液酸化（5）n C-端端Lys（2）n 2644552=9600n(9600)2 108 约约1亿个亿个可能的可能的变异变异体！体！美国美国FDA：Steven Kozlowski 基因特克：基因特克：Wassim NashabehOODDDGGKKpyro-EODGGDODpyro-EAmidation(C-term)*Di-,tri-
21、sulfide bond formation N,O-GlycosylationC-mannosylation(W)Proteolytic processing(C-term)Sequence Variants Oxidation(M,W,H,F,Y)S-CysteinylationDisulfide scramblingS-GlutathionylationThioether formationReduction Deamidation(NG,NT,NS)Isomerization(DG,DS,DD)TransaminationGlycation(K)Hydrolysis(DP)1。影响抗体
22、。影响抗体质质量的蛋白表达后修量的蛋白表达后修饰细饰细胞内胞内细细胞外都有胞外都有发发生；生；2。质质控的目控的目标标是降低或避免在生是降低或避免在生产过产过程中不希望看到的程中不希望看到的 PTM和序列和序列变变异异发发生的生的现现象。象。克隆筛选是质量控制的关键步骤克隆筛选是质量控制的关键步骤mAb Variants and Characterization Methodologies1.Size Variants(体体积变积变异体）异体）n Terminologies:Aggregates,main peak,fragmentsn Assays:HPSEC,CE-SDS,SDS-PAGE
23、,AUC2.Charge Variants（电电荷荷变变异体）异体）n Terminologies:Acidic peak,main peak,and basic peak variantsn Assays:HPIEC,iCIEF,pH-IEC3.Sequence Variants（序列（序列变变异体）异体）:caused by unintended amino acid substitutionsn Terminologies:sequence polymorphism;mutation;mis-incorporation;sequence extension,insertion,delet
24、ion,and crossover.n Assays:Multiple proteolysis peptide mapping methods with LC-UV-MS/MS data analysis4.Structural Variants（高（高级结级结构构变变异体）异体）n Terminologies:high order structure(HOS);tertiary structural isomer.n Assays:HDX-MS,hydroxyl radical oxidation foot-printing,other emerging techniques.46Yang,
25、Y.,et al,mAbs,2010,2:3,285-298.Comparison of peptide map UV profiles from the top four clone-derived mAb samples quickly detected two sequence variants(N1:M83R at 5%and N2:P274T at 42%protein levels)from two clones among the four.UV肽图对比方式可以发现高含量的序列变异体肽图对比方式可以发现高含量的序列变异体肽图对比方式可以发现序列变异体肽图对比方式可以发现序列变异体谢谢观看谢谢观看谢谢观看谢谢观看
