1、10/14/2022淀粉酶活性的测定淀粉酶活性的测定实实 验验 二二学时：学时：3 310/14/2022 1 1、学习并掌握植物体内淀粉酶活性测定、学习并掌握植物体内淀粉酶活性测定 的原理和方法。的原理和方法。2 2、掌握、掌握，-两种淀粉酶的理化特性。两种淀粉酶的理化特性。一、实验一、实验目的目的：10/14/2022二、实验原理二、实验原理酶（酶（enzyme）是具有高效性与专一性的生物催化剂是具有高效性与专一性的生物催化剂（biological catalyst）。）。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。绝大多数酶的化学本质是蛋白质。特点：特点：1、酶具有高效性（、酶具有高效性（high c
2、atalytic power）2、酶具有专一性（、酶具有专一性（specifity）10/14/2022二、实验原理二、实验原理:酶活性（酶活性（emzyme activity）指酶催化特定化学反应的能力，其大小可指酶催化特定化学反应的能力，其大小可用一定条件下用一定条件下酶促反应速度酶促反应速度来表示，酶促反应来表示，酶促反应速度可用单位时间内速度可用单位时间内底物的减少量底物的减少量或或产物的增产物的增加量加量来表示。来表示。10/14/2022 二、实验原理二、实验原理:淀粉淀粉是植物生长期间以淀粉粒形式存在于是植物生长期间以淀粉粒形式存在于细胞的储存多糖。种子、块茎、块根器官含量细胞的
3、储存多糖。种子、块茎、块根器官含量丰富。丰富。天然淀粉含两种组分：直链和支链淀粉。天然淀粉含两种组分：直链和支链淀粉。多数淀粉含直链与支链淀粉的比例多数淀粉含直链与支链淀粉的比例(20(202525)：(75(758080)。10/14/2022NRERE直链淀粉直链淀粉直链淀粉的螺旋结构直链淀粉的螺旋结构0.8nm1.4nm6个残基个残基RENRE(1-6)分支点分支点支链淀粉或糖原分子示意图支链淀粉或糖原分子示意图支链淀粉或糖原分支点的结构支链淀粉或糖原分支点的结构-淀粉酶断裂淀粉酶断裂产生游离麦芽糖产生游离麦芽糖10/14/2022RENRE(1-6)分支点分支点支链淀粉或糖原分子示意图
4、支链淀粉或糖原分子示意图-淀粉酶断裂淀粉酶断裂产生游离麦芽糖产生游离麦芽糖淀粉酶能催化淀粉水解为麦芽糖。淀粉酶能催化淀粉水解为麦芽糖。10/14/2022 植物中淀粉酶有两种，各有其不同的理化特性。植物中淀粉酶有两种，各有其不同的理化特性。-淀粉酶淀粉酶耐热不耐酸，耐热不耐酸，7070加热加热15min15min仍保持仍保持活性活性,pH,pH3.63.6时钝化。时钝化。-淀粉酶淀粉酶耐酸不耐热，耐酸不耐热，7070加热加热15min15min则钝化。则钝化。据此钝化其中之一，即可测出另一种酶的活性。据此钝化其中之一，即可测出另一种酶的活性。10/14/2022 本实验采用加热法钝化本实验采用
5、加热法钝化-淀粉酶，测定淀粉酶，测定-淀粉酶的活性。具体方法是利用淀粉酶的活性。具体方法是利用3,5-3,5-二硝二硝基水杨酸比色法基水杨酸比色法来测定淀粉酶水解生成的麦来测定淀粉酶水解生成的麦芽糖的含量，以单位时间淀粉酶分解生成麦芽糖的含量，以单位时间淀粉酶分解生成麦芽糖的量来表示淀粉酶活性的大小。芽糖的量来表示淀粉酶活性的大小。10/14/2022 在碱性，加热条件下，在碱性，加热条件下，还原糖还原糖与与3,5-3,5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸(DNS)(DNS)反应，还原糖被氧化成糖酸，反应，还原糖被氧化成糖酸，DNSDNS被还原为棕红被还原为棕红色的色的3-3-氨基氨基-5-5-硝基水
6、杨酸硝基水杨酸。3-3-氨基氨基-5-5-硝基水杨酸硝基水杨酸(棕红色棕红色,A,A540540)3,5-3,5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸 (DNS)(DNS)10/14/20221、实验材料：、实验材料：萌发的小麦种子萌发的小麦种子 2、仪器：仪器：(1)可见分光光度计可见分光光度计 (2)恒温水浴锅恒温水浴锅 (3)离心机离心机 (4)刻度试管刻度试管 3、试剂：、试剂：(1)0.4M NaOH；(2)1%淀粉；淀粉；(3)3,5-二硝基水杨酸；二硝基水杨酸；(4)麦芽糖标准溶液麦芽糖标准溶液(1mg/ml)。三、实验材料、仪器和试剂：三、实验材料、仪器和试剂：10/14/2022四、实验
7、步骤四、实验步骤1.麦芽糖标准曲线的制作麦芽糖标准曲线的制作 取取5支干净的具塞刻度试管，编号，按表支干净的具塞刻度试管，编号，按表1加入试剂：加入试剂：表表1 麦芽糖标准曲线制作麦芽糖标准曲线制作试试 剂剂管管 号号12345麦芽糖标准液（麦芽糖标准液（mL）00.51.01.52.0蒸馏水（蒸馏水（mL）2.01.51.00.50麦芽糖浓度（麦芽糖浓度（mg/ml）00.250.50.751.03,5-二硝基水杨酸（二硝基水杨酸（mL）2.02.02.02.02.0沸水浴沸水浴5min，冷却，稀释至，冷却，稀释至20ml测定测定540nm处吸光度处吸光度吸光度值吸光度值010/14/202
8、2 摇匀，置沸水浴中煮沸摇匀，置沸水浴中煮沸5 min。取出后流水。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至冷却，加蒸馏水定容至20 mL。以。以1号管作为空号管作为空白调零点，在白调零点，在540 nm波长下比色测定光密度。波长下比色测定光密度。以麦芽糖浓度（以麦芽糖浓度（mg/ml）为横坐标，吸光度为纵）为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。坐标，绘制标准曲线。10/14/20222、酶液的制备、酶液的制备：称取称取2.0 g萌发的小麦种子萌发的小麦种子 于研钵中，加于研钵中，加2ml水及少许石英砂，研成匀浆水及少许石英砂，研成匀浆转入离心管转入离心管用用6ml蒸蒸馏水分三次洗涤研钵馏水分三次洗涤
9、研钵均转入离心管均转入离心管用玻璃棒搅用玻璃棒搅动动20min等重等重 4000r/min离心离心10min上清夜转上清夜转入入100ml容量瓶容量瓶定容，此提取液即为淀粉酶液。定容，此提取液即为淀粉酶液。10/14/20223、-淀粉酶活性的测定：淀粉酶活性的测定：（1）取两支试管一支对照，一支测定取两支试管一支对照，一支测定各加淀粉酶各加淀粉酶液液1ml70准确加热准确加热15min冷却冷却向向对照管加加4ml 0.4M NaOH，终止酶活性；，终止酶活性；（2）测定管和对照管于）测定管和对照管于40水浴水浴15min均加入均加入2ml 40预热的淀粉预热的淀粉立即立即40水浴保温水浴保温
10、5min取出后迅速向测定管加入取出后迅速向测定管加入4ml 0.4M NaOH；10/14/2022（3 3）取取对照管对照管和和测定管测定管中溶液各中溶液各2ml2ml,分别加入到分别加入到刻度试管中刻度试管中各加各加2ml 3,5-2ml 3,5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸沸水沸水浴浴5min5min冷却冷却稀释至稀释至20ml20ml刻度刻度混匀混匀以制作以制作麦芽糖标准曲线的麦芽糖标准曲线的1 1号试管为参比溶液，调号试管为参比溶液，调“零零”，测定测定540nm540nm处吸光度处吸光度记录结果。记录结果。10/14/2022酶酶液液钝化钝化-淀粉淀粉酶酶钝化钝化酶酶活性活性酶促酶促反
11、应反应终止终止酶促酶促反应反应麦芽糖含量测定麦芽糖含量测定记记录录结结果果对对照照管管（A1）1ml7015min4ml NaOH2ml 淀粉淀粉405min分别取分别取2ml溶液溶液+2ml 3,5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸沸水浴沸水浴5min冷却后稀释至冷却后稀释至20ml混匀混匀测定测定540nm处吸光度处吸光度测测定定管管（A2）1ml7015min2ml 淀粉淀粉405min4ml NaOH-淀粉酶活性的测定淀粉酶活性的测定10/14/20224、淀粉酶总活力的测定、淀粉酶总活力的测定（1）取两支试管一支对照，一支测定）取两支试管一支对照，一支测定各加酶液各加酶液1ml，向对照管加向
12、对照管加4ml 0.4M NaOH，以钝化酶的活性；，以钝化酶的活性；（2）测定管和对照管于）测定管和对照管于40水浴水浴5min均加入均加入2ml 40预热的淀粉预热的淀粉立即立即40水浴保温水浴保温5min取出取出 后迅速向测定管加入后迅速向测定管加入4ml 0.4M NaOH；10/14/2022（3）取对照管和测定管中溶液各）取对照管和测定管中溶液各2ml，分别加入，分别加入到刻度试管中到刻度试管中各加各加2ml 3,5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸沸水沸水浴浴5min冷却冷却稀释至稀释至20ml刻度刻度混匀混匀以制作以制作麦芽糖标准曲线的麦芽糖标准曲线的1号试管为参比溶液，调号试管为参比
13、溶液，调“零零”，测定测定540nm处吸光度处吸光度记录结果。记录结果。10/14/2022酶酶液液钝钝化化酶酶活活性性酶酶促促反反应应终止终止酶促酶促反应反应麦芽糖含量测定麦芽糖含量测定记录记录结果结果对对照照管管(B1)1ml4 ml NaOH2ml淀粉淀粉405min分别取分别取 2ml溶液溶液+2ml 3,5-二硝基水杨酸二硝基水杨酸沸水浴沸水浴5min冷却后稀释至冷却后稀释至20ml混匀混匀测定测定540nm处吸光度处吸光度测测定定管管(B2)1ml2ml淀粉淀粉405min4ml NaOH淀粉酶总活力的测定淀粉酶总活力的测定10/14/2022 在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（在
14、标准曲线上查出相应的麦芽糖含量（mg/ml），按下列公式计算），按下列公式计算-淀粉淀粉酶和酶和-淀粉酶的活力。淀粉酶的活力。-淀粉酶活力淀粉酶活力（麦芽糖毫克数（麦芽糖毫克数/样品鲜重样品鲜重分钟）分钟）=（A2-A1）VD样品鲜重样品鲜重时间时间其中：其中：A2：为：为-淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）（测定试管中麦芽糖浓度）；（测定试管中麦芽糖浓度）；A1：为对照管中麦芽糖的浓度（：为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml）。）。V：为酶促反应体积；：为酶促反应体积；D：为稀释倍数。：为稀释倍数。五、实验结果与计算：五、实验结果与计算：10/14/2
15、022（）淀粉酶总活力）淀粉酶总活力（麦芽糖毫克数（麦芽糖毫克数/样品鲜重样品鲜重分钟）分钟）=（B2-B1）VD样品鲜重样品鲜重时间时间B2：为（：为（+）淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（）淀粉酶水解淀粉生成麦芽糖的浓度（mg/ml）；）；B1：为对照管中麦芽糖的浓度（：为对照管中麦芽糖的浓度（mg/ml）；）；V：为酶促反应体积；：为酶促反应体积；D：为稀释倍数。：为稀释倍数。-淀粉酶活力淀粉酶活力（）淀粉酶总活力）淀粉酶总活力-淀粉酶活力淀粉酶活力10/14/20221、分析本实验的误差；、分析本实验的误差；2、为什么要将、为什么要将A1、A2试管中的淀粉酶液试管中的淀粉酶液置于置于70水浴中保温水浴中保温15min？3、为什么要将各试管中的淀粉酶液和、为什么要将各试管中的淀粉酶液和1%淀粉溶液分别置于淀粉溶液分别置于40水浴中保温？水浴中保温？10/14/2022
