1、医学微生物学医学微生物学前言前言 核酸核酸（nucleic acid）是以核苷酸为基本组成单位是以核苷酸为基本组成单位的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基的生物信息大分子。是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础。因表达的物质基础。2医学微生物学核酸的分类：核酸的分类：nDNA q核内染色体核内染色体 DNA。q核外也有少量核外也有少量DNA，如线粒体，如线粒体DNA，叶绿体，叶绿体DNA。q质粒质粒DNA。n RNAq存在于细胞质中，如存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。等。n除上述除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只
2、含毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有，或只含有RNA。3医学微生物学主要内容主要内容2.核酸制备的基本步骤核酸制备的基本步骤3.核酸的鉴定和保存核酸的鉴定和保存4.核酸提取方法简介核酸提取方法简介4医学微生物学1.1.核酸分离与纯化的原则及要求核酸分离与纯化的原则及要求1.1 1.1 核酸分离与纯化的一般原则核酸分离与纯化的一般原则(1)保持核酸分子保持核酸分子一级结构的完整性一级结构的完整性，是核酸结，是核酸结构和功能研究的最基本要求构和功能研究的最基本要求。(2)排除其他分子的污染，保证核酸的排除其他分子的污染，保证核酸的纯度纯度。5医学微生物学1.2 核酸分离与纯化的要求核酸分离与纯化
3、的要求(1)为保证核酸的为保证核酸的完整性，完整性，（防止降解（防止降解），在实验中应注意：），在实验中应注意：尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种尽量简化步骤，缩短提取时间，减少各种有害因素对核酸的破坏。有害因素对核酸的破坏。减少化学因素对核酸的降解，减少化学因素对核酸的降解，pH4-10。化学因素？化学因素？生物因素？生物因素？物理因素？物理因素？6医学微生物学防止核酸的生物降解（细胞内或外的防止核酸的生物降解（细胞内或外的各种核酸酶水解）各种核酸酶水解）。所用器械和一些试剂需所用器械和一些试剂需高压灭菌高压灭菌，提取缓冲，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。操作温度为液中需加核酸酶抑制剂。操作
4、温度为04。qDNA酶酶需要金属离子需要金属离子Mg2+、Ca2+的激活，因此的激活，因此使用金属离子螯合剂，如使用金属离子螯合剂，如EDTA或柠檬酸盐等；或柠檬酸盐等；阴离子表面活性剂阴离子表面活性剂SDS。qRNA酶酶分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸碱、不易失活，生物降解是耐酸碱、不易失活，生物降解是RNA提取过程中提取过程中的主要危害因素。的主要危害因素。0.1%DEPC浸泡，器械浸泡，器械180干烤干烤8h。7医学微生物学减少物理因素对核酸的降解，主要减少物理因素对核酸的降解，主要是机械剪切力，其次是高温。是机械剪切力，其次是高温。n机械剪切
5、力包括强力高速的振荡、突然暴机械剪切力包括强力高速的振荡、突然暴露于低渗液、样品反复冻融等。露于低渗液、样品反复冻融等。n高温，如长时间的煮沸。高温，如长时间的煮沸。8医学微生物学(2)核酸纯度的要求：核酸纯度的要求：非核酸生物大分子非核酸生物大分子的污染降低到最低程的污染降低到最低程度，如蛋白质、多糖和脂类分子；度，如蛋白质、多糖和脂类分子；排除其它核酸分子排除其它核酸分子的污染，如制备的污染，如制备RNA时，时，DNA分子是污染物；分子是污染物；去除对后续实验有影响的物质，如有机去除对后续实验有影响的物质，如有机溶剂和过高浓度的金属离子。溶剂和过高浓度的金属离子。9医学微生物学2.核酸制备
6、的基本步骤核酸制备的基本步骤I.I.材料准备材料准备II.II.破碎细胞或包膜内容物释放破碎细胞或包膜内容物释放III.III.核酸分离核酸分离IV.IV.沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质沉淀或吸附核酸，纯化并去除杂质 V.V.核酸溶解在适量缓冲液或水中核酸溶解在适量缓冲液或水中10医学微生物学2.1 破碎细胞 (1)(1)玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆(2)(2)液氮研磨法液氮研磨法富含DNA酶的胰、脾、胸腺、淋巴；富含胶原蛋白的皮肤、肌腱；坚硬的组织如骨骼。(3)(3)高速组织捣碎机捣碎高速组织捣碎机捣碎(4)(4)超声波处理法超声波处理法(5)(5)化学处理法化学处理法(SDS(SDS、吐温
7、、吐温8080等）等）(6)(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）生化法（溶菌酶、纤维素酶等）11医学微生物学2.2 2.2 核酸分离，去除蛋白核酸分离，去除蛋白 核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力核酸与蛋白质的结合力主要是正负静电吸力(核酸与碱核酸与碱性蛋白的结合性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。、氢键和非极性的范德华力。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解同时避免核酸降解。（1）加入）加入SDS SDS除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游除有破膜和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游
8、离出来的功能；离出来的功能；（2）加入浓盐溶液（如加入浓盐溶液（如NaCl）核酸核酸-蛋白质加入蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；12医学微生物学（3）酚）酚/氯仿抽提氯仿抽提n酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。制作用。n氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。n在酚在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，
9、氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为防止起泡和促使为防止起泡和促使水相与有机相的分离水相与有机相的分离，再加上一定量的异戊醇（，再加上一定量的异戊醇（酚：氯：异酚：氯：异戊醇戊醇=25=25：2424：1 1）。）。13医学微生物学 (1(1）使用注意）使用注意 酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，现粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例如醌、二酸等。例如醌、二酸等。变色的酚不能用于核酸抽提变色的酚不能用于核酸抽提实验实验，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。，因为氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。(2 (2）安全操作）
10、安全操作 酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作时应作时应戴手套戴手套。使用酚时应注意使用酚时应注意14医学微生物学2.3 沉淀核酸沉淀核酸n重新调整核酸的浓度，起到重新调整核酸的浓度，起到浓缩核酸浓缩核酸的作用；的作用；n去除去除溶液中某些盐离子与溶液中某些盐离子与杂质杂质；n改变核酸的溶解缓冲液。改变核酸的溶解缓冲液。DNA纯化柱纯化柱核酸提取（离心柱型）核酸提取（离心柱型）利用硅胶膜特异利用硅胶膜特异吸附核酸吸附核酸15医学微生物学Na+Mg2+Li+2.3.1 核酸的有机溶液沉淀法核酸的有机溶液沉淀法 当核酸溶液的当核酸溶液的pH值值大于大于4时，核
11、酸分子呈时，核酸分子呈多聚阴离子状态。多聚阴离子状态。钾、钠、镁、锂及铵钾、钠、镁、锂及铵根等根等阳离子形成的盐阳离子形成的盐，通过屏蔽带通过屏蔽带负电的磷酸负电的磷酸基团基团使使DNADNA分子聚结在分子聚结在一起而不溶于许多有机一起而不溶于许多有机溶剂溶剂。16医学微生物学 核酸沉淀的盐类及浓度核酸沉淀的盐类及浓度盐盐贮存液浓度（贮存液浓度（mol/L)终浓度终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.817医学微生物学乙醇乙醇n优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含迹量乙醇易挥发除去，不影响以
12、后实验。n缺点：需要量大，一般要求低温操作。异丙醇异丙醇n优点：需体积小，速度快速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温长时间放置。n缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去。所以，最后用最后用7070乙醇漂洗数次。乙醇漂洗数次。常用的有机沉淀剂常用的有机沉淀剂18医学微生物学聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）优点：优点：可用不同浓度的可用不同浓度的PEGPEG选择沉淀不同相对分子质量选择沉淀不同相对分子质量的的DNADNA片段片段。应用。应用60006000相对分子质量的相对分子质量的PEGPEG进行进行DNADNA沉淀时，使用浓度与沉淀时，使用浓度与DNADNA
13、片段的大小成反比。片段的大小成反比。注意：注意：PEG PEG沉淀一般需加沉淀一般需加0.5mol/L0.5mol/L的的NaClNaCl或或10 mmol/L10 mmol/L的的MgClMgCl2 2。19医学微生物学精胺精胺 精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀精胺不是有机溶剂，但可快速有效沉淀DNADNA。原理是：原理是：精胺与精胺与DNADNA结合后，使结合后，使DNADNA在溶液中结构凝缩在溶液中结构凝缩而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质而发生沉淀，并可使单核苷酸和蛋白质杂质与与DNADNA分开，达到纯化分开，达到纯化DNADNA的目的。的目的。20医学微生物学 2.3.2 2.
14、3.2 核酸沉淀的温度和时间核酸沉淀的温度和时间 一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行在低温长时间下进行。但时间过长，易导致盐与DNA共沉淀，影响以后的实验。一般使用0冰水，10-15min，DNA样品足可达到实验要求。3.3.核酸的浓度和纯度的测定核酸的浓度和纯度的测定3.1 紫外分光光度法鉴定核酸 3.2 荧光光度法鉴定核酸21医学微生物学3.1 3.1 紫外分光光度法鉴定核酸紫外分光光度法鉴定核酸 3.1.1 3.1.1 紫外分光光度法测紫外分光光度法测DNADNA和和RNARNA的含量的含量 前提：前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其
15、他核酸污染。糖及其他核酸污染。测定浓度应大于测定浓度应大于0.25 g/ml。结论：结论：在在波长波长260nm260nm紫外光下，紫外光下，1 OD1 OD值的吸光度相值的吸光度相当于双链当于双链DNADNA浓度为浓度为50 g/ml50 g/ml；单链；单链DNADNA为为37 37 g/mlg/ml；RNARNA为为40 ug/ml40 ug/ml。22医学微生物学a a分光光度计分光光度计先用一定量的水校正零点先用一定量的水校正零点。b b吸取一定量的吸取一定量的DNADNA样品或样品或RNARNA样品，加入到盛样品，加入到盛有一定体积水的石英比色杯中。有一定体积水的石英比色杯中。c
16、c测定待测样品在测定待测样品在230nm230nm、260nm260nm和和280nm280nm的的ODOD值值d d计算浓度。计算浓度。双链DNA样品浓度(g/l)=OD260核酸稀释倍数 50/1000；RNA样品浓度(g/l)=OD260核酸稀释倍数40/1000。e e分析纯度。分析纯度。核酸定量仪可直接获得核酸定量仪可直接获得浓浓度，度，不用计算不用计算。小分子杂质小分子杂质核酸核酸蛋白质蛋白质紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤23医学微生物学A：测测DNA：纯的DNA样品OD260/OD280=1.8（1.71.9）OD260m/OD2302.
17、01)OD260/OD2801.9,RNA污染。2)OD260/OD2801.6，存在蛋白质或酚污染；3)OD260/OD2302.0 OD260/OD2302.01）OD260/OD280比值太小，蛋白质或酚的污染；2）OD260/OD280 2.0，可能被异硫氰酸胍等污染；3）OD260/OD2302.0，表明有小分子及盐存在。25医学微生物学3.2 3.2 荧光光度法鉴定核酸荧光光度法鉴定核酸 3.2.13.2.1 测定核酸含量：测定核酸含量：原理：原理：DNADNA、RNARNA在荧光染料溴乙锭在荧光染料溴乙锭(EB)(EB)嵌入碱基平面嵌入碱基平面之间后，之间后，DNADNA、RNA
18、RNA样品在紫外光激发下，可发出红样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度已知的不同浓度DNADNA溶液作标准对照，可比较出被测溶液作标准对照，可比较出被测DNADNA溶液浓度。溶液浓度。注意：注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。此法的比较主要基于目测，是估计水平。常用的荧光染料还有常用的荧光染料还有:golden view,gel red,sybr green26医学微生物学核酸鉴定实际核酸鉴定实际常用操作程序常用操作程序核酸定量仪测定浓度，核酸定量仪测定浓度，OD260/OD280及及OD260
19、/OD230比值比值。琼脂糖电泳，琼脂糖电泳，UV下观察下观察验证纯度及判断是否降解验证纯度及判断是否降解3.2.2 3.2.2 荧光光度法鉴定核酸纯度荧光光度法鉴定核酸纯度原理：原理：溴化乙锭(EB)等荧光染料示踪的核酸电泳结果。基基因因组组DNARNA27医学微生物学(1)(1)对对DNADNA DNADNA样品溶于样品溶于pH8.0pH8.0的的TETE，4 4 或或-20-20 保存保存；长期保存样品中可加入长期保存样品中可加入1 1滴氯仿。滴氯仿。(2)(2)对对RNARNA RNA RNA样品溶于样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)0.3 mol/L NaAc(pH5
20、.2)或双蒸灭菌水中，或双蒸灭菌水中，-70-70 保存保存;可以沉淀形式贮于乙醇，可在可以沉淀形式贮于乙醇，可在-20-20 中长期保存中长期保存;最常用无最常用无RnaseRnase水或高压后的水或高压后的DEPCDEPC水溶解水溶解RNARNA，冻贮于，冻贮于-70-80。3.3 3.3 核酸的保存核酸的保存TE：Tris-Cl,EDTA28医学微生物学4 4、核酸提取方法简单介绍、核酸提取方法简单介绍4.1 基因组基因组DNA的提取方法的提取方法4.2 质粒的提取和纯化质粒的提取和纯化4.3 Trizol法提取总法提取总RNA29医学微生物学4.1 基因组基因组DNA的提取方法的提取方
21、法4.1.1 酚抽提法酚抽提法以含以含EDTA、SDS及及RNase的裂解缓冲液裂解细胞，的裂解缓冲液裂解细胞，经经蛋白酶蛋白酶K处理后，用处理后，用pH8.0的的Tris饱和酚饱和酚抽提。抽提。（DNA）30医学微生物学原理：原理：n在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水在正常情况下，核酸表面覆盖了一层由水分子组成的亲水n薄膜，以维持其水溶性。薄膜，以维持其水溶性。高浓度盐高浓度盐离子的加入破坏了核酸离子的加入破坏了核酸n表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环表面亲水薄膜的相对有序排列，形成了疏水环境。在此环n境中，境中，核酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和核
22、酸与硅胶膜能有效结合，而蛋白质、代谢产物和n其他污染物则不能结合。其他污染物则不能结合。特点：特点：n 不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。n 快速，简捷。快速，简捷。4.1.2 基因组基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）提取试剂盒（离心柱型）常用的试剂盒：Qiagen31医学微生物学裂解液裂解液+蛋白酶蛋白酶K裂解细胞裂解细胞缓冲液缓冲液GB+乙醇乙醇DNA柱子吸附柱子吸附缓冲液缓冲液GD去除蛋白去除蛋白漂洗液漂洗液漂洗漂洗DNA两次两次洗脱液洗脱液TE洗脱洗脱DNA离心柱型离心柱型基因组基因组DNA提取步骤提取步骤32医学微
23、生物学n甲酰胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法一致，甲酰胺解聚法：细胞裂解步骤与酚抽提法一致，但以高浓度甲酰胺裂解液裂解但以高浓度甲酰胺裂解液裂解DNA与蛋白质与蛋白质复合体，再以透析除去杂质复合体，再以透析除去杂质n玻璃棒缠绕法：将基因组玻璃棒缠绕法：将基因组DNA沉淀缠绕于带沉淀缠绕于带钩玻璃棒上带出，溶于钩玻璃棒上带出，溶于pH8.0的的TEn异丙醇沉淀法异丙醇沉淀法n玻璃珠吸附法玻璃珠吸附法4.1.3 其他的基因组其他的基因组DNA提取方法提取方法33医学微生物学n透析，沉淀，电泳，选择性沉淀透析，沉淀，电泳，选择性沉淀4.1.4 DNA4.1.4 DNA样品的进一步纯化样品的进一步纯化
24、4.1.5 DNA4.1.5 DNA片段的回收片段的回收n原则：提高回收率，去除杂质污染原则：提高回收率，去除杂质污染n从琼脂糖凝胶中回收：从琼脂糖凝胶中回收：DEAE纤维素膜插片电泳法，纤维素膜插片电泳法，电泳洗脱法电泳洗脱法 冷冻挤压法冷冻挤压法n从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡从聚丙烯酰胺凝胶中回收：压碎与浸泡34医学微生物学4.2 4.2 质粒的提取和纯化质粒的提取和纯化n质粒的结构：质粒的结构：超螺旋，半开环，线性超螺旋，半开环，线性DNAn理化性质：理化性质：与一般核酸相似，但抗切割和与一般核酸相似，但抗切割和抗变性能力更强抗变性能力更强n所有分离质粒所有分离质粒DNA的方法都包
25、括的方法都包括3个基本步骤：个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离质粒质粒DNA(有时还要求纯化质粒有时还要求纯化质粒DNA，根据实，根据实验所需验所需)。选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、选择哪一种方法主要取决于以下几个因素：质粒的大小、大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。大肠杆菌菌株、裂解后用于纯化的技术和实验要求。35医学微生物学4.2.1 4.2.1 质粒提取原理质粒提取原理4.2.2 4.2.2 质粒质粒DNADNA的纯化与回收的纯化与回收n纯化纯化qCsCL-EB法法q聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法q柱层
26、析法柱层析法n回收：与基因组回收：与基因组DNA类似类似36医学微生物学4.3 RNA4.3 RNA的分离和纯化的分离和纯化nRNARNA易被易被RNaseRNase水解，水解，RNaseRNase除细胞内还广泛存除细胞内还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中nRNaseRNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非分子结构中的二硫键使其生物学活性非常稳定常稳定n排除排除RNaseRNase的污染是的污染是RNARNA制备成功与否的关键制备成功与否的关键37医学微生物学4.3.1 RNA4.3.1 RNA制备的条件与环境制备的条件与环境n洁净的实验室
27、洁净的实验室n操作人员带口罩，勤换手套操作人员带口罩，勤换手套n玻璃器皿（如匀浆器）、镊子玻璃器皿（如匀浆器）、镊子180干烤干烤8 h或更长时间或更长时间n枪头、枪头、EP管管0.1%DEPC水浸泡过夜，再高水浸泡过夜，再高压；或直接购买无压；或直接购买无Rnase的枪头和的枪头和EP管管n冰上匀浆，冰上匀浆，4 离心离心38医学微生物学nTrizol的主要成分是的主要成分是苯酚苯酚。苯酚的主要作用。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制能完全抑制
28、RNA酶活性。酶活性。nTrizol中还加入了中还加入了8羟基喹啉、羟基喹啉、异硫氰酸胍异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase（RNA酶）。酶）。4.3.2 Trizol法提取总法提取总RNA39医学微生物学Trizol法提取法提取RNA步骤步骤1、每50-100mg 组织加入1ml Trizol，用匀浆器匀浆处理，室温放置5min，使其充分裂解。12,000rpm 离心5min，弃沉淀。2、加入氯仿200微升每管，剧烈振荡15s，室温放置2-3 min。12000g,4，离心15 min 3、吸取上层水相(约400微升），至另一离心管中。注：千万不要吸取
29、中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。4、每使用1ml Trizol 加入0.5 ml 异丙醇，室温10min。12000g，4，10 min,弃上清，RNA沉于管底。5、加入1 mL75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。12000g,4,5min。，尽量弃上清。6、室温晾干或真空干燥5-10min。加入20微升无Rnase 水溶解RNA 沉淀。40医学微生物学 除血红蛋白及某些组蛋白外，绝大多数除血红蛋白及某些组蛋白外，绝大多数mRNA在在其其3末端带有末端带有1个长短不一的多聚核苷酸的结构，即个长短不一的多聚核苷酸的结构，即poly（A）
30、尾巴）尾巴nolig（dT）-纤维素柱层析法纤维素柱层析法nolig（dT）-纤维素液相结合离心法纤维素液相结合离心法n其他方法：磁珠法其他方法：磁珠法 生物素标记的生物素标记的oligo（dT）结合）结合poly（A）尾，再结合亲和素标记的）尾，再结合亲和素标记的磁珠磁珠4.3.3 mRNA的分离和纯化的分离和纯化41医学微生物学找答案找答案 DNA recombination DNA recombination technique vector DNA重组技术中常用的工具酶？重组技术中常用的工具酶？DNA重组技术的基本步骤？重组技术的基本步骤？DNA重组子的筛选和鉴定的方法有哪些？重组子的
31、筛选和鉴定的方法有哪些？-互补互补第六章第六章 DNA重组技术重组技术42医学微生物学 DNADNA重组（重组（DNA recombinationDNA recombination）不同来源的不同来源的DNADNA，通过磷酸二酯键连接，通过磷酸二酯键连接而而重新组合重新组合成新的成新的DNADNA分子的过程。分子的过程。DNADNA新的新的DNA+连接组合连接组合43医学微生物学DNADNA重组技术（重组技术（DNA recombination DNA recombination techniquetechnique）又称又称分子克隆或基因工程分子克隆或基因工程：体外用限制性内切酶将不同来源的
32、体外用限制性内切酶将不同来源的DNADNA分分子进行特异地子进行特异地切割切割水解，获得目的基因或水解，获得目的基因或DNADNA片段与载体片段与载体连接连接，从而组成特异的一个，从而组成特异的一个新的新的DNADNA分子分子，重组的，重组的DNADNA分子通过一定的分子通过一定的方式方式导入导入相应的宿主细胞，在宿主细胞中相应的宿主细胞，在宿主细胞中进行无性繁殖，进行无性繁殖，获得大量目的基因获得大量目的基因或或DNADNA片片段的过程。段的过程。分子水平操作，细胞水平表达。分子水平操作，细胞水平表达。44医学微生物学切切接接转转分分筛筛45医学微生物学重组重组DNADNA技术的基本步骤技术
33、的基本步骤1.1.载体的选择与制备、核酸的分离载体的选择与制备、核酸的分离分分2.2.目的基因的获得目的基因的获得切切3.3.目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接接接4.4.重组重组DNADNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞转转5.5.筛选出含重组筛选出含重组DNADNA基因分子的受体细胞克隆基因分子的受体细胞克隆筛筛6.6.克隆基因的克隆基因的表达表达及表达产物的及表达产物的检测检测和分离纯化和分离纯化46医学微生物学 DNA重组技术的开创人重组技术的开创人 1.第一个实现第一个实现DNA重组的人重组的人Berg 1972年，Berg用E.coR切割SV4 0DNA和phageDNA，
34、经过连接组成重组的DNA分子。Berg是第一个实现DNA重组的人。2.第一个取得基因工程成功的人第一个取得基因工程成功的人Cohen 1973年，Cohen Group将E.coli的tetr质粒psclol和nersrR6-3质粒体外限制酶切割，连接成一个新的质粒，转化E.coli，在含四环素和新霉素的平板上筛选出了terrNer,实现了细菌遗传性状的转移。这是基因工程史上的第一个克隆化并取得成功的例子，这一年被定为基因工程诞生的元年。47医学微生物学DNA重组技术依赖于重组技术依赖于3大理论，大理论，3大技术准备：大技术准备：（一）理论上的（一）理论上的3大发现：大发现：1.20世纪世纪4
35、0年代，年代，Avery发现了生物遗传物质的化学本质是发现了生物遗传物质的化学本质是DNA。超越时代的科学成就往往不易被人们接受，Avery当时并未赢得阵阵掌声，他的论文事隔10年以后才公开发表。2.20世纪世纪50年代，年代，Watson-crick提出了提出了DNA结构的双螺旋结构的双螺旋结构模型，结构模型，搞清楚了生物遗传物质的分子机制。3.2 0 世 纪世 纪 6 0 年 代，确 定 了 遗 传 信 息 的 传 递 方 式：年 代，确 定 了 遗 传 信 息 的 传 递 方 式：DNARNAPr,破译了全部遗传密码，43。48医学微生物学 技术上的技术上的3大发明：大发明：1“基因剪刀
36、基因剪刀”限制性内切酶限制性内切酶的发明的发明 （1）20世纪4060年代，科学家们就为基因工程设计了美好的蓝图，但是面对庞大的dsDNA（104，2.2*1011公里）束手无策，无从下手把它切成单个基因片断。（2）当时的酶学知识已有相当的发展，但是没有一个已发现的酶能完成这样的使命。（3）1970年，年，Smith和和Wilcox在流感嗜血杆菌在流感嗜血杆菌（Haemophilus inffuenzae）分离纯化了）分离纯化了Hind，取得了，取得了突破，打破了基因工程的禁锢，突破，打破了基因工程的禁锢，迎来了改造生物的春天，为基因工程奠定了最为重要的技术基础。49医学微生物学 2逆转录酶逆
37、转录酶1970年年Baltimove和和Temin等同时各自发现等同时各自发现了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核了逆转录酶，打破了遗传学（生物学）中心法则，使真核基因的制备成为可能。基因的制备成为可能。（原因如下）(1)真核基因组庞大而复杂，不易制得基因图谱。HGP2005年完成，2.8万个基因，13kb/基因，104，2.2*1011公里。（2）即使有了基因图谱，因为真核基因有内含子，不能在原核表达系统剪接出mRNA，没有成熟的mRNA就不能得到相应得产物。（3）经过逆转录mRNAcDNA(complementory DNA)文库要比基因组文库小得多，所以筛选阳性克隆就方便得
38、多。有了这些理论核技术的武装，基因工程的临盆降生指日可待，Berg和Cohen两位科学的“助产士”，把基因工程接到了人间。50医学微生物学 3载体载体(“交通工具车子交通工具车子”)基因工程技术诞生的第二个基因工程技术诞生的第二个技术准备技术准备 （1）有了切割与缝合（ligase）基因DNA的工具，还得有一个车子（富康）将重组DNA送到宿主细胞中去。（2）1946年起，Lederberg就研究细菌性因子（F因子）.50-60年代相继发现了R因子（抗药因子），CoE(大肠杆菌因子)等质粒。（3）然而，直到1973年Cohen才能将质粒作为基因工程载体使用（至今一直是基因工程最重要最广泛使用的载
39、体）。这是基因工程的第二个技术准备。51医学微生物学工工 具具 酶酶常用的工具酶（常用的工具酶（tool enzymes）有）有：1.限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（resriction enzymes,restriction endonadease)2.DNA连接酶（连接酶（DNA ligase,ligase)3.逆转录酶逆转录酶(reverse transcriptase)4.DNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase,DNA pol)5.核酸酶核酸酶(nuclease)6.末端转移酶末端转移酶(terminal transferase)7.碱性磷酸酶碱性磷酸酶(BAP或或CIP
40、)以以1.和和2.最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。最为常用，最为重要。工具酶现已商品化。第一节第一节 常用工具酶常用工具酶52医学微生物学一限制性核酸内切酶一限制性核酸内切酶 （一）限制酶的概念（定义，分类，命名，限制与修饰辨正（一）限制酶的概念（定义，分类，命名，限制与修饰辨正关系）关系）1.定义定义 限制性内切酶（限制性内切酶（restriction endonuclease,restrction enzymes）：简称限制酶，）：简称限制酶，识别识别和和切割切割双链双链DNA分子特异序分子特异序列的核酸水解酶。列的核酸水解酶。具有识别和切割具有识别和切割dsDNA的功能。的功能。所
41、谓限制（所谓限制（restriction）=切割（切割（clearage）=水解水解（hydrolysis）该部位的核苷键（磷酸二酯键）该部位的核苷键（磷酸二酯键）53医学微生物学2.分类分类 限制酶都是从原核生物中发现的（限制酶都是从原核生物中发现的（400多多种种E/350M）。所有的限制酶可分成）。所有的限制酶可分成3类。类。（1）、类类 兼具限制与修饰活性，它们兼具限制与修饰活性，它们识别与切割顺序不识别与切割顺序不在一个地方在一个地方，不产生特异性的，不产生特异性的DNA片段，与基因工片段，与基因工程意义不大（有说程意义不大（有说型识别核切割的位点一致，但型识别核切割的位点一致，但罕
42、见）。罕见）。（2）类类 基因工程说到的限制酶是基因工程说到的限制酶是型酶，具有此类酶型酶，具有此类酶的微生物限制修饰系统分别由限制酶和甲基化酶的微生物限制修饰系统分别由限制酶和甲基化酶来完成。来完成。型酶分子量小，仅需型酶分子量小，仅需Mg2作为催化反作为催化反应的辅因子，应的辅因子，识别与切割位点相同，产生特异的识别与切割位点相同，产生特异的DNA片段片段。54医学微生物学3.3.命名（命名（1973年年Smith 原则、原则、类酶，类酶，斜体字母表示斜体字母表示）根据分离此酶微生物的学名，一般取根据分离此酶微生物的学名，一般取3 3个字母。个字母。第一个字母大写第一个字母大写 -该微生物
43、属名前的第一个字母该微生物属名前的第一个字母第二、三个字母小写第二、三个字母小写-该微生物种名前的该微生物种名前的2 2个字母个字母第四个字母大写第四个字母大写-有变种或株系的第一个字母有变种或株系的第一个字母罗马字母罗马字母、-从一种微生物中发现了几种限从一种微生物中发现了几种限 制酶，按发现顺序排列制酶，按发现顺序排列 如如EcoREcoR是指从大肠杆菌（是指从大肠杆菌（Escherichia coliEscherichia coli）R R株株分离得到的第一种限制酶。分离得到的第一种限制酶。55医学微生物学(二二)限制酶的识别位点限制酶的识别位点 它能识别它能识别dsDNAdsDNA的的
44、4 46bp6bp的回文序列的回文序列并水解该部分的核苷键。一般来说是并水解该部分的核苷键。一般来说是4 46bp6bp，有，有6 6个以上的，但没有个以上的，但没有4 4个以下个以下的。的。回文结构：回文结构：56医学微生物学Bam Bam HHGTCCAGGCCTAGGATCC GGGATCCCCTAGGHinHinddGTCGACCAGCTGGACCTG平端切口平端切口粘端切口粘端切口识别顺序呈二重对称，即识别顺序呈二重对称，即1800旋转对称。旋转对称。57医学微生物学GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBam HGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC GBst同
45、功异源酶：同功异源酶：来源不同的限制酶，能识别和切割同一位点，这来源不同的限制酶，能识别和切割同一位点，这些酶称同功异源酶。些酶称同功异源酶。58医学微生物学 GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC GATCTAG GATCT A同尾酶：同尾酶：有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割切割DNADNA后产生相同的粘性末端，称为同尾酶。后产生相同的粘性末端，称为同尾酶。59医学微生物学（三）限制性内切酶的活力单位和（三）限制性内切酶的活力单位和星号活力星号活力 1.酶活力单位酶活力单位 在合适温度、在合适温度
46、、pH值和离子强度等条件下，值和离子强度等条件下，1小时内完小时内完全消化全消化1g特异特异DNA底物所需的酶量，定义为一个活力底物所需的酶量，定义为一个活力单位单位。2.星号活性星号活性 限制性内切酶在非标准反应条件下，对识别序列的特限制性内切酶在非标准反应条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列，一般在酶的右上角加一般在酶的右上角加“*”表示表示 克隆过程中需同时进行双酶切时，应选用二种酶都能克隆过程中需同时进行双酶切时，应选用二种酶都能接受的反应缓冲体系，否则可能影响酶的特异性接受的反应缓冲体系，否则可能影响酶的特异
47、性60医学微生物学（四（四)注意事项注意事项 底物底物DNADNA不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚不能含有痕量的酚、氯仿和乙醚溶液中不能含溶液中不能含SDSSDS和过量的盐，和过量的盐，EDTA EDTA的含量不的含量不能大于能大于10mmol/L10mmol/L反应缓冲体系中一般可加入反应缓冲体系中一般可加入2-2-巯基乙醇或二硫巯基乙醇或二硫苏糖醇，防止含巯基酶的氧化失活苏糖醇，防止含巯基酶的氧化失活加入牛血清白蛋白稳定酶活性加入牛血清白蛋白稳定酶活性操作时应注意混匀反应体系操作时应注意混匀反应体系61医学微生物学(六六)甲基化酶甲基化酶1.1.细菌的限制修饰系统细菌的限制修饰系统 限制（降解
48、）外来限制（降解）外来DNADNA，并通过对自身，并通过对自身DNADNA的修饰而的修饰而起保护作用。起保护作用。2.2.甲基化酶的应用甲基化酶的应用 当制备克隆用双链当制备克隆用双链cDNAcDNA时，外源时，外源DNADNA片段可用片段可用EcoR EcoR 甲基化酶处理，使双链甲基化酶处理，使双链cDNAcDNA内部内部 EcoR EcoR 位点因甲位点因甲基化受到保护而不被切割基化受到保护而不被切割 62医学微生物学二二DNA连接酶：连接酶：DNA连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用连接酶是基因工程第二位重要的工具酶，常用T4DNA ligase.（一）功能：（一）功能：催化有互补
49、顺序的催化有互补顺序的两个两个dsDNA分子的粘性末端或平头末端分子的粘性末端或平头末端3OH、5P连接作用（只能作用于双链连接作用（只能作用于双链DNA分子内或两个双链分子内或两个双链DNA分子间，分子间，不能将二个单链不能将二个单链DNA分子连接分子连接。)（二）来源（二）来源 噬菌体噬菌体T4感染感染Ecoli分离的一种单链多肽酶、分离的一种单链多肽酶、MW.68KD。（三）催化反应：（三）催化反应：（1）需要）需要ATP、Mg2+作辅助因子；作辅助因子；（2）最适）最适pH值为值为7.2-7.4。（3）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量）对粘性末端催化活性大于平头末端（酶量1：100
50、）63医学微生物学三、分子克隆中常用的其他酶三、分子克隆中常用的其他酶1.1.逆转录酶逆转录酶2.Taq DNA2.Taq DNA聚合酶聚合酶（目的（目的DNADNA片段片段33端加端加A A，用于，用于A AT T克隆）克隆）3.T3.T4 4多核苷酸激酶多核苷酸激酶4.4.末端转移酶（脱氧核苷酸末端转移酶）末端转移酶（脱氧核苷酸末端转移酶）5.5.碱性磷酸酶碱性磷酸酶6.DNA6.DNA聚合酶聚合酶7.Klenow7.Klenow片段（片段（DNADNA聚合酶聚合酶大片段）大片段）64医学微生物学一、载体（一、载体（vectorvector）的概念）的概念 携带靶携带靶DNADNA（目的（
