1、资料仅供参考,不当之处，请联系改正。主讲人：梦还在学号：2010501304资料仅供参考,不当之处，请联系改正。荧光蛋白的过去、现在和未来1资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2008年10月8日诺贝尔化学奖揭晓2资料仅供参考,不当之处，请联系改正。3资料仅供参考,不当之处，请联系改正。居住于北美西海岸附近的水母Aequorea Victoria(a)。它的发光器官位于“伞状结构”的边缘（b和c）。荧光蛋白的始祖荧光蛋白的始祖 GFP4资料仅供参考,不当之处，请联系改正。5资料仅供参考,不当之处，请联系改正。6资料仅供参考,不当之处，请联系改正。马丁查尔非就考虑只用它的编码区域来表达。1993
2、年，他用PCR的方法扩增了GFP的编码区，将它克隆到表达载体中，紫外光或者蓝光激发后，大肠杆菌和线虫细胞内均产生了很美妙的绿色荧光。1994年在美国科学杂志上发表作为基因标识的绿色荧光蛋白一文，尽管正文只有一页，却标志绿色荧光蛋白投入实验室应用。7资料仅供参考,不当之处，请联系改正。GFP由238个氨基酸分子组成，分子量为26.9 kDa。来源于水母的野生型GFP在395 nm和475 nm分别有主要和次要的激发峰，它的发射峰在509 nm，处于可见光谱的绿色区域；来源于海肾的GFP只在498 nm有单个激发峰。GFP是典型的桶形结构，包含折叠和螺旋，将荧光基团包含在其中。严密的桶形结构保护着
3、荧光基团，防止它被周围环境淬灭。8资料仅供参考,不当之处，请联系改正。9资料仅供参考,不当之处，请联系改正。野生型GFP能发出很绚丽的荧光 1996年Remington小组最先在Science上发布了GFP的S65T突变体的晶体结构。一个月后，Phillips小组也在Nature Biotech上发布了野生型的GFP结构。正是这些晶体结构的探明，才使人们更好地了解发光基团的组成，以及与周围残基的相互作用。研究人员通过定点或随机突变，不断地改造这些残基，得到了我们今天使用的GFP衍生物。10资料仅供参考,不当之处，请联系改正。最值得赞叹的就是钱永健在1995年完成的单点突变S65T(Thr取代S
4、er65）。这个突变显著提高了GFP的光谱性质，荧光强度和光稳定性也大大增强。突变后的GFP激发峰转移至488 nm，而发射峰仍保持在509 nm，这和常用的FITC滤光片匹配，提高了GFP的应用潜力。而F64L(Leu取代Phe64)点突变则改善了GFP在37的折叠能力，综上就产生了增强型GFP，也就是我们常见的EGFP。基于等量溶解蛋白的光谱分析，由于Em(消光系数)的增加和色基构型的高效率，EGFP在488nm处激发后荧光强度为野生型GFP的35倍.11资料仅供参考,不当之处，请联系改正。总结三位科学家的杰出贡献 Osamu Shimomura是首位从水母（是首位从水母（Aequorea
5、 victoria）中分离出）中分离出GFP的科学家，是他发现了该蛋白在的科学家，是他发现了该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。紫外线下会发出明亮的绿光。Martin Chalfie则证明了则证明了GFP在作为多种生物学现象在作为多种生物学现象发光遗传标记方面的应用价值。发光遗传标记方面的应用价值。钱永健为我们阐明了钱永健为我们阐明了GFP发光的机制，并且发现了除发光的机制，并且发现了除绿色之外可用于标记的其它颜色。他对细胞生物学和神经绿色之外可用于标记的其它颜色。他对细胞生物学和神经生物学领域的贡献具有划时代的意义。他的多色荧光蛋白生物学领域的贡献具有划时代的意义。他的多色荧光蛋白标记技术让科
6、学家能够用不同颜色对多个蛋白和细胞进行标记技术让科学家能够用不同颜色对多个蛋白和细胞进行标记，从而实现了同时对多个生物学过程进行追踪。标记，从而实现了同时对多个生物学过程进行追踪。12资料仅供参考,不当之处，请联系改正。趋势 荧光蛋白的改造遵循这样一个宗旨，那就是越红越好.普遍认为，长波长光子的激发对细胞和组织的光毒性小，且自体荧光和动物组织的光吸收都是最小。这些因素意味着红色的荧光基团对比度提高（因为背景应该降低），且更适合于体内成像.于是，荧光蛋白的改造慢慢向红色偏移。最初是黄色荧光蛋白，1999年人们在银莲花中发现了橙红色的荧光蛋白同源物，称之为DsRed（发射峰在583 nm）。DsR
7、ed的出现让研究人员认识到荧光蛋白的多样性，同时也有了更丰富的改造模板。13资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2007年莫斯科的研究人员培育出一种深红色的荧光蛋白质，这种蛋白质发出的光穿透性极强，即使蛋白质位于小动物体内深处，其发出的光也可以穿透生物体被外界看到，这使生物学家能够更方便地监视活生物体的发病和康复过程，而不用侵入式地进行研究。14资料仅供参考,不当之处，请联系改正。绿色荧光蛋白不再是孤独的，它有了橙色、红色等多种荧光蛋白的陪伴。然而，要找到个“门当户对”的伴侣也不容易。就融合应用、亮度、光稳定性而言，与EGFP相似的还真没有。而且，一些红外荧光蛋白仍保留了基本的绿色荧光组件，因
8、此不可能与EGFP一起应用于两色成像。科学家的近期目标是开发出与EGFP各方面都匹配的红色荧光蛋白。当然，红色荧光蛋白突变体的改造仍在持续。15资料仅供参考,不当之处，请联系改正。荧光蛋白已经给生物学带来了很多惊喜一、生物技术中的应用研究16资料仅供参考,不当之处，请联系改正。二、在肿瘤发病机制研究中的应用 荧光蛋白与目的基因融合，将目的基因标记为绿色、橙色或者红色，即可定量分析目的基因的表达水平，显示其在肿瘤细胞内的表达位置和量的变化，为探讨该基因在肿瘤发生、发展中的作用及其分子机制提供便利条件。17资料仅供参考,不当之处，请联系改正。图a显示的是小鼠体内两种肿瘤的全身成像结。图b显示的则是
9、将GFP标记的肿瘤移植到小鼠骨中的全身成像。18资料仅供参考,不当之处，请联系改正。图a，显示的是GFP标记的肿瘤被移植到小鼠的大肠，在蓝光下的全身成像。图b为同一个动物被剖开后的全身成像。对比a和b可见，全身成像的精确性非常好。19资料仅供参考,不当之处，请联系改正。三、在信号转导中的应用 新近研究发现，可以通过调节某些 突变GFP 来改变 FRET。把一个释放蓝色荧光的 GFP 融合到一个绿色荧光 GFP 突变体上,并在它们之间介入一个蛋白酶敏感的间隔子,这两个 GFP 恰好可以发生 FRET,当加入蛋白酶时,间隔子被切除,两个 GFP 之间的距离发生弥散性改变,FRET 被完全阻断。该实
10、验提示我们,可以通过偶联 GFP 到适当的转录因子、跨膜受体、细胞间信号转导指示分子,来动态观测活细胞的生理功能。最近,有学者用 GFP 依赖的生物传感器测量活细胞内生化动力学,通过利用带有 GFP 标记的蛋白激酶 A 转染细胞,观测有关 cAMP 的动态荧光变化。通过融合蓝色荧光 GFP 到调节亚单位或融合绿色荧光 GFP 到 PKA 的催化亚单位,设计出了 cAMP 传感器。当 cAMP 浓度很低时,两个荧光分子距离很近,并出现 FRET,如果增加 cAMP 浓度,发生 FRET 的可能性急剧下降。利用该方法,可以检测出 cAMP 的动态变化,并开创了在整体条件下,研究 cAMP 调节信号
11、转导途径的新方法。20资料仅供参考,不当之处，请联系改正。四、其他应用光伏发电 瑞典研究人员不再盯着植物作为样板，转而将目光投向拥有高超光伏转化能力的水母，开发出提升收获太阳能的技术。利用水母身上提取的GFP，该小组制作的装置可用这些“黏黏绿”将紫外光转化为自由电子。该小组制造的电池由在二氧化硅基底上被一个小缝隔开的两个简单的铝电极组成，GFP置于两电极中间并起连接作用。当把紫外光放进来的时候，GFP不断将光子抓走，并产生电子进入电路产生电流。同时，GFP非常廉价，不需要昂贵的添加剂或昂贵的加工，此外，它还能被封装成独立的不需要外光源的燃料电池。科学家相信，此能源装置缩小后可用来驱动微小的纳米
12、设备。21资料仅供参考,不当之处，请联系改正。协助HIV研究 德国的研究人员就开发出一种光转变荧光蛋白，能观察HIV在感染的细胞中如何装配及释放。这种名为EosFP的光转变蛋白发出强烈的绿色荧光，在紫外照射下会转变为红色。紫外光通过打断发色团旁边的肽骨架而改变了蛋白的发射波长。这样EosFP就称为一种极佳的失踪标记。研究人员将EosFP与HIV的结构蛋白-Gag相连，实时追踪了病毒颗粒在感染的细胞膜上如何装配并释放。细胞光敏开关 杜克大学的研究人员从拟南芥中提取了两种蛋白，进而研发出一种可对蓝光发生感应的细胞光敏开关，并成功地实现对细胞功能的调控。研究人员将提取的这两种蛋白分别与红色荧光蛋白和
13、绿色荧光蛋白融合，并把绿色荧光蛋白混合物附着在细胞膜上。接着，他们用蓝光照射细胞，发现蛋白开始相互作用，红色荧光蛋白快速移动至细胞膜，并与绿色荧光蛋白合并，发出黄光。此外，科学家还发现这种相互作用具有可逆性，在光照射下能反复触发。22资料仅供参考,不当之处，请联系改正。荧光蛋白应用在未来中亟待解决的问题n荧光信号强度的非线性性质使得定量非常困难n多数生物具有微弱的自发荧光现象,并有着类似的激发和发射波长,这个荧光背景会影响某些 GFP 的检测 n实验中发现很难建成 GFP 稳定细胞株,可能与 GFP 参与细胞凋亡过程有关23资料仅供参考,不当之处，请联系改正。荧光蛋白的下一个惊喜将会是什么 我们无法回答，但是我们期待着！24资料仅供参考,不当之处，请联系改正。25
