1、资料仅供参考,不当之处，请联系改正。第六节第六节 蛋白质的测序蛋白质的测序(peptides)一、肽的定义与肽键一、肽的定义与肽键二、肽的书写二、肽的书写三、自然界中存在的小肽三、自然界中存在的小肽四、肽的理化性质四、肽的理化性质资料仅供参考,不当之处，请联系改正。蛋白质肽链结构学说的证据：蛋白质肽链结构学说的证据：肽键是一个酰胺键肽键是一个酰胺键。（1）蛋白质水解前后蛋白质水解前后的结果分析。的结果分析。（2）人工合成的多肽和天然蛋白质，都可被蛋白水解酶水解，）人工合成的多肽和天然蛋白质，都可被蛋白水解酶水解，人工合成多肽中人工合成多肽中氨基酸是肽键氨基酸是肽键连接的。连接的。（3）天然蛋白
2、质有）天然蛋白质有双缩脲反应双缩脲反应。（4）人工合成的聚合）人工合成的聚合aa的的X-光衍射谱光衍射谱和和红外光谱红外光谱与天然纤维蛋与天然纤维蛋白相似。白相似。（5）结晶牛胰岛素的成功，完全证明了蛋白质肽链结构学说的）结晶牛胰岛素的成功，完全证明了蛋白质肽链结构学说的正确性。正确性。一、蛋白质中氨基酸之间的连接键一、蛋白质中氨基酸之间的连接键是主要的是肽键是主要的是肽键 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。NH2COOH1NH2COOH2NH2C NCOOHOH21两个氨基酸分子头尾连接起来肽肽键的键的形成形成脱水CarbodiimideJuang RH(2004)BCbasics资料仅供
3、参考,不当之处，请联系改正。肽的结构与肽键肽的结构与肽键资料仅供参考,不当之处，请联系改正。氨基酸借肽键连接的分子叫氨基酸借肽键连接的分子叫肽肽，肽是一大类物质，即：，肽是一大类物质，即：1 1）两个氨基酸组成的肽叫）两个氨基酸组成的肽叫二肽二肽；2 2）三个氨基酸组成的肽叫）三个氨基酸组成的肽叫三肽三肽；3 3）多个氨基酸组成的肽叫）多个氨基酸组成的肽叫多肽多肽；4 4）氨基酸借肽键连成长链，称为）氨基酸借肽键连成长链，称为肽链肽链，肽链两端有，肽链两端有 自由自由-NH-NH2 2和和-COOH-COOH，自由，自由-NH-NH2 2端称为端称为N-N-末端末端（氨基末端），（氨基末端），
4、自由自由-COOH-COOH端称为端称为C-C-末端末端（羧基末端）；（羧基末端）；5 5）构成肽链的氨基酸已）构成肽链的氨基酸已残缺不全残缺不全，称为，称为氨基酸残基氨基酸残基；6 6）肽链中的氨基酸的排列顺序，一般）肽链中的氨基酸的排列顺序，一般-NH-NH2 2端开始，由端开始，由N N指指 向向C C，即，即多肽链有方向性多肽链有方向性，N N端为头，端为头，C C端为尾。端为尾。二、肽的定义与结构二、肽的定义与结构 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。单位小分子 N-C-C-N-C-C-N-C-C-碳为中心 N-C-C-N-C-C-N-C-C两端氨基酸 -C-C-N-C-C-N-C-
5、肽键的定位 N-C-C-N-C-C-N-C-C肽的结构分析Juang RH(2004)BCbasics资料仅供参考,不当之处，请联系改正。肽的书写写法写法：从左左右右，从N末端末端C末端末端。三字母用连线，也有用单字母的。读法读法：酰酰 酸。写法：Ser-Gly-Try-Ala-Leu 或SGTAL，名称：丝氨酰-甘氨酰-酪氨酰-丙氨酰-亮氨酸资料仅供参考,不当之处，请联系改正。p 轨轨道道电电子共振使肽子共振使肽键键具具双键双键特性特性 HCCNCO-+资料仅供参考,不当之处，请联系改正。NCCHC肽肽键键 虽虽是是单键却单键却有有双键双键性性质，不能自由旋转质，不能自由旋转O肽肽键键 周周
6、围围六六个个原子在原子在同一平面同一平面（酰氨平面）（酰氨平面）上上 相邻两个氨相邻两个氨基酸的基酸的 -carbon 在在对对角角(trans)，反式反式C肽肽键键的特的特点点肽键亚氨基在肽键亚氨基在pH 0-14内不解离。内不解离。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。Pro形成的肽链肽平面是可以形成的肽链肽平面是可以反式反式也可以也可以顺式顺式。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。两两肽肽键键 平面的交接平面的交接点为点为 -碳碳以肽以肽键键平面平面连连接成多肽接成多肽长链长链注意注意 -碳上面接有各碳上面接有各种种大小不等的基大小不等的基团团Mathews et al(2000)Bioc
7、hemistry(3e)p.136资料仅供参考,不当之处，请联系改正。多肽链可以看成由多肽链可以看成由C 串联串联起来的数个起来的数个酰胺平面酰胺平面组成组成氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基氨基酸残基资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1、旋光性旋光性一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。2、肽的酸碱性质肽的酸碱性质 短肽在晶体和水溶液中是以偶极离子形式存在。肽的酸碱性质主要取决于N端-NH和C端-COOH以及侧链R上可解离的基团。在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。三、肽的物理化学性质三、肽的物理化学性质资料仅供参考,不当之处，请联系改正。pH 优势离子的净电荷：优势离子的
8、净电荷：10.2 -2等电点：等电点：2.628.76.4pI3、肽的等电点：、肽的等电点：资料仅供参考,不当之处，请联系改正。l 肽的肽的-羧基，羧基，-氨基氨基和和侧链侧链R基上基上的活性基团的活性基团都能发生与都能发生与游离氨基酸游离氨基酸相似的反应。相似的反应。l 双缩脲反应双缩脲反应pNH2-CO-NH-CO-NH2(双缩脲），能与双缩脲），能与CuSO4-NaOH产生颜色反应。产生颜色反应。p凡是凡是有肽键结构有肽键结构的化合物都会发生双缩的化合物都会发生双缩脲反应，可用于定量分析。脲反应，可用于定量分析。p双缩脲反应是双缩脲反应是肽和蛋白质肽和蛋白质特有的反应，特有的反应，游离氨
9、基酸无此反应。游离氨基酸无此反应。4、肽的化学反应、肽的化学反应资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1、谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSH）三肽（三肽（Glu-Cys-Gly），广泛存在于生物细胞中，含），广泛存在于生物细胞中，含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于使其处于活性状态活性状态。四、天然存在的活性肽NH2CHHOOCH2CH2CCOHNCHCOCH2SHHNCH2COOHGluCysGlyg g-肽键肽键资料仅供参考,不当之处，请
10、联系改正。b bg g资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2.2.促甲状腺素释放激素：促甲状腺素释放激素：三肽（三肽（焦焦谷氨酰组氨酰脯谷氨酰组氨酰脯氨酸），可促进甲状腺素的释放。氨酸），可促进甲状腺素的释放。3.3.短杆菌素短杆菌素S S：环十肽环十肽，含有，含有D-D-苯丙氨酸、鸟氨酸，苯丙氨酸、鸟氨酸，对革兰氏阴性细菌有破坏作用，主要作用于细胞膜。对革兰氏阴性细菌有破坏作用，主要作用于细胞膜。4.4.青霉素：青霉素：含有含有D D半胱氨酸和半胱氨酸和D D缬氨酸的二肽衍生缬氨酸的二肽衍生物物 。主要破坏细菌的细胞壁粘肽的合成引起溶菌。主要破坏细菌的细胞壁粘肽的合成引起溶菌。资料仅供参考,
11、不当之处，请联系改正。5.5.牛催产素与加压素：牛催产素与加压素：均为九肽均为九肽7.7.脑啡肽：脑啡肽：为五肽，具有镇痛作用。为五肽，具有镇痛作用。6.舒缓激肽：舒缓激肽：促进血管舒张，促进水、钠离子的排出。促进血管舒张，促进水、钠离子的排出。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。脑啡与脑啡与其受其受体结体结合合后后可以可以产产生生镇痛镇痛效果效果麻麻啡啡可以模可以模拟脑啡拟脑啡的作用的作用，因此有因此有类类似的效用似的效用资料仅供参考,不当之处，请联系改正。H3N+CH C N CH C O CH3COO-CH2OOCH2HL-Aspartyl-L-phenylalanine methyl
12、esterAspartame阿斯巴甜阿斯巴甜甜度是蔗糖的180倍 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。第四节第四节 蛋白质的结构蛋白质的结构The structure of proteins一、蛋白质的一级结构一、蛋白质的一级结构二、蛋白质的二级结构二、蛋白质的二级结构三、蛋白质的三级结构三、蛋白质的三级结构四、蛋白质的四级结构四、蛋白质的四级结构资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一级结构蛋白质的四级结构氨基酸四级结构三级结构二级结构资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一级结构（共价结构）：一级结构（共价结构）：蛋白质分子中蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序氨基酸残基的排列顺序。一、蛋白质一级
13、结构（初级结构）Primary structure（一）、一级结构的研究内容与研究意义（一）、一级结构的研究内容与研究意义研究蛋白质的一级结构是研究研究蛋白质的一级结构是研究蛋白质的结构与功能蛋白质的结构与功能的基的基础，主要研究内容：础，主要研究内容：1、氨基酸是如何连接成蛋白质，、氨基酸是如何连接成蛋白质，2、对于一定的蛋白质、对于一定的蛋白质,氨基酸的排列顺序。氨基酸的排列顺序。3、蛋白质、蛋白质r的一级结构测定过程。的一级结构测定过程。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。意意 义：义：1、研究蛋白质的一级结构是研究蛋白质结构与功能的基、研究蛋白质的一级结构是研究蛋白质结构与功能的基础，
14、这是因为础，这是因为Pr的一级结构决定了它的高级结构，从而的一级结构决定了它的高级结构，从而决定了蛋白质的生物功能决定了蛋白质的生物功能。2、一级结构的研究为、一级结构的研究为生物进化提供了依据生物进化提供了依据，不同生物的不同生物的同一种蛋白的其一级结构是不同的。同一种蛋白的其一级结构是不同的。3、一级结构的研究为一些、一级结构的研究为一些分子病的诊断分子病的诊断提供了依据。提供了依据。只有将蛋白质的一级结构研究清楚后，生化工作者才能只有将蛋白质的一级结构研究清楚后，生化工作者才能站到一个优越的地位去洞察，研究生命过程中的许多复站到一个优越的地位去洞察，研究生命过程中的许多复杂问题。杂问题。
15、资料仅供参考,不当之处，请联系改正。F.Sanger (1951,Cambridge U)Insulin 胰岛素(A,B chains)Nelson&Cox(2000)Principles of Biochemistry(3e)p.142S SSSS S+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSI C SLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT B-chain A-chain（二）、蛋白质一级结构的测定（二）、蛋白质一级结构的测定NO2O2NF资料仅供参考,不当之处，请联系改正。阶段一：测序前的准备工作阶段一：测序前的准备工作1、蛋白质一级结构的测
16、定程序(1).确定蛋白质不同确定蛋白质不同多肽链的数目多肽链的数目(2).拆分蛋白质分子的拆分蛋白质分子的多肽链多肽链，打开蛋，打开蛋白质分子中的白质分子中的二硫键二硫键(3).分离纯化分离纯化各自不同的多肽链各自不同的多肽链(4).确定各多肽链的确定各多肽链的氨基酸组成氨基酸组成分离提纯蛋白质，测定蛋白质的分子量分离提纯蛋白质，测定蛋白质的分子量资料仅供参考,不当之处，请联系改正。阶段二：多肽链的测序阶段二：多肽链的测序1、蛋白质一级结构的测定程序(1).特异性打断多肽链，产生适合测序大特异性打断多肽链，产生适合测序大小的肽段小的肽段(2).分离纯化肽段分离纯化肽段(3).确定每一肽段的氨基
17、酸顺序确定每一肽段的氨基酸顺序(4).采用另一种特异性试剂将多肽链打断采用另一种特异性试剂将多肽链打断,重复前三步重复前三步.资料仅供参考,不当之处，请联系改正。阶段三：氨基酸顺序的拼接阶段三：氨基酸顺序的拼接1、蛋白质一级结构的测定程序(1).利用重叠拼接法拼接氨基酸顺序(2).确定多肽链之内和之间的二硫键的位置.SSSSSS+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSICSLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT B-chain A-chain+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSIC SLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVE
18、ALYLVCGERGFYTPKT B-chain A-chainCOO-FLYLVCGERGFYTPKTNH3+SFVNQHLCGHLVEA B-chain资料仅供参考,不当之处，请联系改正。N-末端分析末端分析 A.化学法化学法pDNS-Cl法：法：最常用，黄色荧光，灵敏度极高，最常用，黄色荧光，灵敏度极高，DNS-多肽水解后的多肽水解后的DNS-氨基酸不需要提取。氨基酸不需要提取。pDNFB法：法：Sanger试剂，试剂，DNP-多肽，酸水解，黄色多肽，酸水解，黄色DNP-氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层氨基酸，有机溶剂（乙酸乙酯）抽提分离，纸层析、薄层层析、液相等。析、薄层层析
19、、液相等。pPITC法：法：Edman法，逐步切下。无色法，逐步切下。无色PTH-氨基酸，氨基酸，有机溶剂抽提，层析。有机溶剂抽提，层析。2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定资料仅供参考,不当之处，请联系改正。N-末端分析末端分析 B.酶酶 法（氨肽酶法）法（氨肽酶法）从多肽链的从多肽链的N-末端末端逐个地向里切。根据逐个地向里切。根据不同的不同的反应时间反应时间测出酶水解所释放的测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线。按反应时间和残基释放量作动力学曲线。亮氨酸氨肽酶：亮氨酸氨肽酶：最常用氨肽酶氨肽酶M：较常用2、N-末端和C-末端氨基酸残基
20、的的鉴定Gly-Ser-Val资料仅供参考,不当之处，请联系改正。N-末端分析末端分析 C.常见问题及处理方法：常见问题及处理方法：2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定 经常碰到经常碰到N-末端残基末端残基的的氨基被封闭氨基被封闭。因此不能与。因此不能与Edman降解试剂发生作用。降解试剂发生作用。焦谷氨酰化、乙酰化以及某些环状肽。焦谷氨酰化、乙酰化以及某些环状肽。NHOCONHpeptideenzymeNHOCOOHNH2peptide+焦谷氨酸氨肽酶焦谷氨酸氨肽酶资料仅供参考,不当之处，请联系改正。C-末端分析末端分析 A.肼解法肼解法 无水肼无水肼NH2NH2 100 5-10h。苯
21、甲醛沉淀氨基酸的酰肼，苯甲醛沉淀氨基酸的酰肼，C端游离氨基酸留在上清中。端游离氨基酸留在上清中。Gln、Asn、Cys、Arg不能用此法。不能用此法。2、N-末端和C-末端氨基酸残基的的鉴定资料仅供参考,不当之处，请联系改正。C-末端分析末端分析 B.还原法还原法,硼氢化锂硼氢化锂(LiBH4)肽肽-COOH生成生成肽肽-CH2OH水解水解,分离分离,层析鉴定。层析鉴定。此法比较少用。此法比较少用。C.羧肽酶法，羧肽酶法，（Pro不能测）不能测）2 2、N-N-末端和末端和C-C-末端氨基酸残基的的鉴定末端氨基酸残基的的鉴定羧肽酶羧肽酶A：除：除Pro、Arg、Lys外的所有外的所有C端端a.
22、a羧肽酶羧肽酶B：只水解只水解Arg、LysValSerGly资料仅供参考,不当之处，请联系改正。.多肽链之间的连接方式多肽链之间的连接方式 A.共价键共价键二硫键二硫键 -S-S-酰胺键酰胺键 -CO-NH-酯键酯键 -CO-O-B.非共价键非共价键氢键氢键 RH离子键离子键 R+R-疏水作用疏水作用 R R范德华力范德华力 R R3、肽链的分离、纯化与测定资料仅供参考,不当之处，请联系改正。共共价键价键或非共或非共价键价键的的键键能能键键 长长 真空中真空中 水溶液水溶液共价键离子键氢 键范德华力0.15 nm 0.25 nm0.30 nm0.35 nm90 80 4 0.190 3 1
23、0.1kcal/mole资料仅供参考,不当之处，请联系改正。.肽链的拆离方法肽链的拆离方法 A.二硫键的拆离二硫键的拆离过甲酸氧化法和巯基化合物（巯基乙醇）还原法。过甲酸氧化法和巯基化合物（巯基乙醇）还原法。B.非共价键的拆离非共价键的拆离8M 尿素尿素或或6M 盐酸胍盐酸胍使蛋白质变性，多肽链松散而使蛋白质变性，多肽链松散而成无规则的构象。成无规则的构象。C.烷基化试剂保护烷基化试剂保护 如如碘乙酸碘乙酸保护还原保护还原-SH，防止，防止重新氧化重新氧化。3 3、肽链的分离、纯化与测定、肽链的分离、纯化与测定资料仅供参考,不当之处，请联系改正。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。4 4、肽链
24、的部分水解、肽链的部分水解 拆链得到的多肽链一般是拆链得到的多肽链一般是100-1000个氨基酸个氨基酸，需要，需要将其将其切成小肽段切成小肽段，分别测定它们的顺序，最后连在一起。，分别测定它们的顺序，最后连在一起。1、裂解的部位要、裂解的部位要专一专一。2、裂解点要、裂解点要少少，切的肽段的，切的肽段的大小要合适大小要合适。3、产率要、产率要高高，要求试剂不能破坏裂解后的肽段。，要求试剂不能破坏裂解后的肽段。裂解的方法：裂解的方法：化学法，酶学法化学法，酶学法资料仅供参考,不当之处，请联系改正。、化学裂解法化学裂解法 A.溴化氰裂法：溴化氰裂法：专一裂解专一裂解Met羧基羧基所成的肽键所成的
25、肽键4 4、肽链的部分水解、肽链的部分水解资料仅供参考,不当之处，请联系改正。甲基硫氰酸甲基硫氰酸资料仅供参考,不当之处，请联系改正。、化学裂解法化学裂解法 B.羟胺断裂：羟胺断裂：专一裂解专一裂解Asn-Gly之间的肽键。之间的肽键。4、肽链的部分水解专一不很强，专一不很强，Asn-Leu,Asn-Ala键也部分裂解键也部分裂解由于由于Asn-Gly出现机率较低，所以所得片断较大。出现机率较低，所以所得片断较大。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。、酶裂解法酶裂解法 A.胰蛋白酶胰蛋白酶(trypsin)4、肽链的部分水解专一裂解专一裂解Lys、Arg的羧基的羧基参与形成的肽键。为了参与形成
26、的肽键。为了减少的作用位点，可用化学修饰将多肽链侧链保减少的作用位点，可用化学修饰将多肽链侧链保护起来，护起来，1.2环己酮封闭环己酮封闭Arg，马来酸酐封闭马来酸酐封闭Lys。氮丙啶氮丙啶形成带正电荷点，增加位点。形成带正电荷点，增加位点。B.糜蛋白酶糜蛋白酶(Chymotrypsin)断裂断裂Phe,Trp,Tyr等疏水等疏水AA的羧基的羧基所形成的肽所形成的肽键。断裂键邻近的基团，碱性：裂解能力键。断裂键邻近的基团，碱性：裂解能力，酸，酸性：裂解能力性：裂解能力资料仅供参考,不当之处，请联系改正。NH2CHCH2COHOH2CH2CNHCNH2N+H2OONH2CHCH2COHOH2CH
27、2CNHCNHN+H环已二酮NH2CHCH2COHOSHH2CH2CNH+H+NH2CHCH2COHOSH2CH2CNH2资料仅供参考,不当之处，请联系改正。、酶裂解法酶裂解法 C.胃蛋白酶胃蛋白酶(Pepsin)4、肽链的部分水解断裂键两侧的殘基都是断裂键两侧的殘基都是疏水性或芳香氨基酸残基疏水性或芳香氨基酸残基。其后和前为其后和前为Pro时抑制。时抑制。D.嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶(Thermolysin)疏水、芳香氨基酸残基疏水、芳香氨基酸残基氨基端氨基端，含，含Ca，Zn。Phe,Trp,Tyr,Leu,Ile,Val,Met，羧基是，羧基是Pro,Gly时不作用。时不作用。资料仅供参
28、考,不当之处，请联系改正。、酶裂解法酶裂解法 .金黄色葡萄球菌蛋白酶（金黄色葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶），蛋白酶），4、肽链的部分水解 磷酸缓冲液磷酸缓冲液PH7.8能在能在Glu殘基和殘基和Asn殘基殘基的的羧基侧断裂肽键，羧基侧断裂肽键，NH4HCO3缓冲液缓冲液pH7.8醋酸醋酸铵缓冲液铵缓冲液PH4.0只能断只能断裂裂Glu殘基殘基的的羧基羧基侧肽键侧肽键.梭状芽孢杆菌蛋白酶（梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶）蛋白酶）专门裂解专门裂解Arg殘基的殘基的COOH所形成的肽键所形成的肽键,对不对不溶性蛋白质的长时间裂解很有效。溶性蛋白质的长时间裂解很有效。资料仅供参考,不当之处，请联系改
29、正。胰蛋白酶胰蛋白酶 Lys X,Arg X (X Pro)胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶 TyrX，TrpX,PheX (X Pro)胃蛋白酶胃蛋白酶 Phe(Trp、Try、Leu)Phe(Trp、Try、Leu)嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶 X-X-Phe,Trp,Tyr,Leu,Ile,Val,Met （Pro）Glu蛋白酶蛋白酶 GluXArg蛋白酶蛋白酶 ArgX酶法裂解总结资料仅供参考,不当之处，请联系改正。电泳法：电泳法：SDS-PAGE 根据分子量大小分离根据分子量大小分离离子交换层析法离子交换层析法:（DEAE-Cellulose、DEAE-Sephadex）根据肽段的电荷特性分离根
30、据肽段的电荷特性分离反相反相HPLC法法 根据肽段的极性分离根据肽段的极性分离凝胶过滤凝胶过滤要求：要求：SDSPAGE单带单带 HPLC单峰单峰 N端单一（常用端单一（常用DNSCl法）法）5、肽段的分离纯化资料仅供参考,不当之处，请联系改正。1）、）、Edman法法 （1）耦联）耦联 PITC HNA-B-C-D pH9，40 PTCA-B-C-D6、肽段序列测定及肽链的拼接资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（2）裂解）裂解 无水三氟乙酸（无水三氟乙酸（CF3COOH）ATZA +H2NB-C-DCF3COOH ATZ6、肽段序列测定及肽链的拼接资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（3）
31、转化（ATZ不稳定，转化成PTH-aa)ATZPTHaa PTC肽：苯氨基硫甲酰肽;ATZ：噻唑啉酮苯胺（一氨基酸）;PTH：苯乙内酰硫脲（一氨基酸）ATZNHNCHCRCSHOHOPTC-aaPTH-aaH2O(1M HCl)6、肽段序列测定及肽链的拼接资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2）、）、用自动序列分析仪测序用自动序列分析仪测序仪器原理：仪器原理：Edman法。法。1967液相测序仪：旋反应器，适于大肽段。1971固相测序仪：表面接有丙氨基的微孔玻璃球，可耦连肽段的端。1981气相测序仪：用Polybrene反应器。6、肽段序列测定及肽链的拼接资料仅供参考,不当之处，请联系改正。资
32、料仅供参考,不当之处，请联系改正。3）、）、肽段拼接成肽链肽段拼接成肽链16肽，端端H 端端 法裂解：法裂解：ONS PS EOVE RLA HOWT6 6、肽段序列测定及肽链的拼接、肽段序列测定及肽链的拼接法裂解：法裂解：SEO WTON VERL APS HO重叠法确定序列重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS重叠法确定序列重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS重叠法确定序列重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS重叠法确定序列重叠法确定序列：HOWTONSEOVERLAPS资料仅供参考,不当之处，请联系改正。一条多肽链经两种部分水解的方法得到两套肽段，经一条多
33、肽链经两种部分水解的方法得到两套肽段，经测定各肽段的氨基酸顺序都已确定，推知整条肽链的测定各肽段的氨基酸顺序都已确定，推知整条肽链的氨基酸顺序。氨基酸顺序。1).溴化氰裂解后的肽段溴化氰裂解后的肽段(1).Trp-Ser-Arg-Glu-Hsr(2).Gly-His-Ala-Leu-Lys-Phe-Glu(3).Ala-Gly-Val-Lys-Asp-Hsr(4).Pro-Val-Lys-Ile-Phe-Hsr2).胰蛋白酶裂解后的肽段胰蛋白酶裂解后的肽段(1).Ile-Phe-Met-Trp-Ser-Arg(2).Ala-Gly-Val-Lys(3).Asp-Met-Pro-Val-Lys(
34、4).Glu-Met-Gly-His-Ala-Leu-Lys(5).Phe-Glu(3)-(4)-(1)-(2)(2)-(3)-(1)-(4)-(5)资料仅供参考,不当之处，请联系改正。根据以下实验结果根据以下实验结果,推断一条多肽链的氨基酸顺序推断一条多肽链的氨基酸顺序.1).酸水解得知氨基酸的组成酸水解得知氨基酸的组成:2Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;2Ser.2).羧肽酶羧肽酶A水解得水解得:Ala.3).胰蛋白酶水解得四肽段胰蛋白酶水解得四肽段,其氨基酸组成如下其氨基酸组成如下:(1).Ala;Arg.(2).Lys;Phe;Ser.(3).Lys.(4).Ala;Met;
35、Ser.4).溴化氰裂解得两个肽段溴化氰裂解得两个肽段,其氨基酸组成如下其氨基酸组成如下:(1).Ala;Arg;2Lys;Met;Phe;Ser.(2).Ala;Ser.5).嗜热菌蛋白酶水解得两个肽段嗜热菌蛋白酶水解得两个肽段,其氨基酸组成如下其氨基酸组成如下:(1).Ala;Arg;Ser.(2).Ala;2Lys;Met;Phe;Ser.Ala-Arg-Ser-Phe-Lys-Lys-Met-Ser-Ala资料仅供参考,不当之处，请联系改正。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。测核酸序列测核酸序列推断氨基酸序列推断氨基酸序列1）酶降解法测序）酶降解法测序2）质谱法测定（蛋白质组）质谱法
36、测定（蛋白质组）p177书书3）根据核苷酸序列的推定法）根据核苷酸序列的推定法7 7、其它测序方法、其它测序方法资料仅供参考,不当之处，请联系改正。气质联用液质联用资料仅供参考,不当之处，请联系改正。对角线电泳法对角线电泳法 胃蛋白酶酶解蛋白质；胃蛋白酶酶解蛋白质；第一向电泳；第一向电泳；过甲酸氧化过甲酸氧化SS生成生成-SO3-后；后；第二向电泳；第二向电泳；分离出含二硫键的两条短肽，分离出含二硫键的两条短肽，测序测序 与拼接出的肽链比较，定出与拼接出的肽链比较，定出二硫键的位置。二硫键的位置。8 8、二硫键位置的确定、二硫键位置的确定+-资料仅供参考,不当之处，请联系改正。2、酰胺的确定酰
37、胺的确定 Asp Asn、Glu-Gln 酶解肽链，产生含单个酶解肽链，产生含单个Asx或或Glx的肽，用电泳法确定是的肽，用电泳法确定是Asp还是还是Asn 举例：举例：Leu-Glx-Pro-Val肽在肽在pH=6.0 时，电荷量是时，电荷量是 Leu+Pro0 Val-此肽除此肽除Glx外，净电荷为外，净电荷为0，可根据此肽的电泳行为确，可根据此肽的电泳行为确定是定是Glu或是或是Gln。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。3、糖、脂、磷酸基位置的确定糖、脂、磷酸基位置的确定糖类通过糖类通过Asn、Ser与蛋白质连接，与蛋白质连接，-N-糖苷糖苷 -O-糖苷糖苷脂类：脂类：Ser、Thr
38、、Cys磷酸：磷酸：Ser、Thr、His经验性序列：经验性序列：Lys(Arg)-Ser-Asn-Ser(PO4)Arg-Thr-Leu-Ser(PO4)Lys(Arg)Ala-Ser(PO4)资料仅供参考,不当之处，请联系改正。（三）、多肽与蛋白质的人工合成（三）、多肽与蛋白质的人工合成氨基酸两个功能性基因氨基酸两个功能性基因(氨基与羧基氨基与羧基)，在合成特定，在合成特定的肽键时就存在一问题，要求把另外的基团进行掩的肽键时就存在一问题，要求把另外的基团进行掩蔽，即相应蔽，即相应基团的保护基团的保护。1、基团的保护、基团的保护资料仅供参考,不当之处，请联系改正。Strategy for M
39、aking a Specific Peptide BondNHCHCOOHR1NH2CHCR2Z(保护基)OY(保护基)+NHCHCR1NHCHCR2ZOYONH2CHCR1NHCHCOOHR2O缩合剂缩合剂除除 去去保护基保护基资料仅供参考,不当之处，请联系改正。氨基保护：氨基保护：苄氧酰基（苄氧酰基（CBZ）、）、叔丁氧甲酰基（叔丁氧甲酰基（BOC）、）、对甲苯磺酰基（对甲苯磺酰基（Tosyl）。）。CH2OCOCCH3H3CCH3OCOSH3COO羧基保护：羧基保护：苄酯苄酯(OBzl)、叔丁酯叔丁酯(Obut)（成盐、成酯）（成盐、成酯）CH2OCCH3H3CCH3O资料仅供参考,不当
40、之处，请联系改正。羧基活化：羧基活化：酰氯法（酰氯法（PCl5）、叠氮法、）、叠氮法、混合酸酐法、活化酯法。混合酸酐法、活化酯法。2、基团的活化、基团的活化在正常条件下，羧基和氨基之间形成的肽键是不会自在正常条件下，羧基和氨基之间形成的肽键是不会自发发生的，通常把发发生的，通常把羧基活化羧基活化。RCXOR1CXOHNHR2R1COHNR2HX+资料仅供参考,不当之处，请联系改正。缩合剂：缩合剂：DCC（二环己基碳二亚胺）直接接肽（二环己基碳二亚胺）直接接肽资料仅供参考,不当之处，请联系改正。资料仅供参考,不当之处，请联系改正。支持介质：支持介质：聚苯乙烯树脂聚苯乙烯树脂合成方向：合成方向：C端端 N端。端。合成程序：合成程序：右图右图3、多肽的固相合成、多肽的固相合成 断裂与去断裂与去保护保护挂接挂接去保护去保护中和中和缩合缩合
