1、 主讲人：*参赛可修改优质的课件 质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用306医院检验科 *质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用3 0 6 医院检验科 岛津（梅里埃）MALDI TOF产品系列 Linear only MALDI-TOF Linear and reflectron MALDI-TOF PSD capability Linear and reflectron MALDI-TOF/TOF PSD&CID capability Unique instrument MALDI-ion trap-TOF reflectron only MSn capability High resol
2、ution and high mass accuracyA s s u r a n c e C o n f i d e n c e P e r f o r ma n c e布鲁克 各类现代生物质谱：离子阱离子阱MALDI TOF/TOFESI-Q-TOFFTMS布鲁克 各类现代生物质谱：离子阱MA L D I T O F/T O F E质谱仪的工作原理质谱仪的工作原理 质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按质荷比进行分离的装置。离子电离后经加速进入磁场中，其动能与加速电压及电荷z有关，即 m/z=2U/v2 其中z为离子的电荷，U为加速电压，m为离子的质量，v为离子初加速后的运动速度。具有
3、速度v的带电粒子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比（m/z）的不同实现分离。质谱仪的工作原理质谱仪是利用电磁学原理，使带电的样品离子按电离源质谱仪中产生离子的装置称为离子源(ion source)。电离源的功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。由于离子化所需要的能量随分子不同差异很大，因此，对于不同的分子应选择不同的离解方法。通常称能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，而给样品较小能量的电离方法为软电离方法。质谱技术中的几种离子源质谱技术中的几种离子源1.基质辅助激光解吸离子化(Matrix Assisted Laser Desorption Ion
4、ization，MALDI)2.电喷雾离子化(Electrospray ionization，ESI)电离源质谱仪中产生离子的装置称为离子源(i o n s o u r c eSample targetIon opticsLinear detectorLaserMALDI-TOF MALDI:线性工作原理1.Mix matrix&sample on target2.Fire laser at matrix/sample3.Ionize sample(solid to gas phase)4.Accelerate/extract ions5.Separate ions in analyzer6.
5、Record spectrum at detector Time of flight(TOF)mass analyzer(field free)02040608010010000200003000040000m/z+ve modeM+H+ionsS a mp l e t a r g e t I o n o p t i c s L i n e a r MALDI基质辅助激光解析附原理基质辅助激光解析附原理:Streptococcus pneumoniae:m/z%Intensity95176865 L327985 L296638839458725263 L346265 L3065054419 L
6、369071 S1880617703 L3559516750 L2810089 L2710618 S1910403 S15475712310 L7/L129357 L31728611019 S630005000700090001100013000880611451 S105651 L3310783 L23mass signals matching to ribosomal proteins(considering possible methionine cleavage and/or methylation)are marked in red50%of peaks unambiguously
7、represent ribosomal proteinsprotein masses obtained from the Swiss-Prot/TrEMBL Swiss-Prot/TrEMBL sequence databaseMA L D I 基质辅助激光解析附原理:S t r e p t o c o c c质谱仪的基本结构质谱仪的基本结构一、真空系统质谱仪的离子产生及经过系统必须处于高真空状态(离子源真空度应达1.310-4-310-5 pa，质量分析器中应达1.310-6 pa)。若真空度过低，则会造成离子源灯丝损坏、本底增高、副反应过多，从而使图谱复杂化、干扰离子源的调节、加速极放电等
8、问题。一般质谱仪都采用机械泵预抽真空后，再用高效率扩散泵连续地运行以保持真空。图5.1 质谱仪的构成质谱仪的基本结构一、真空系统微生物鉴定方法微生物鉴定方法感官感官视觉视觉,嗅觉嗅觉,味觉味觉免疫免疫单或多克隆抗体单或多克隆抗体分子分子PCR生化生化代谢能力和耐抗生素代谢能力和耐抗生素耗时气质法（气质法（GC-MS）脂肪酸，小分子糖脂肪酸，小分子糖MALDI-TOF MSMALDI-TOF MS微生物鉴定方法感官免疫分子生化耗时气质法（G C-MS）MA L15-Oct-2211微生物鉴定新方法（微生物鉴定新方法（MALDI TOF）比现有方法鉴定更多生物多样性的病原体 分析时间仅1-2 mi
9、nutes0 3-O c t-2 2 1 1 微生物鉴定新方法（MA L D I T O F）现现代微生物分代微生物分类类学学:蛋白蛋白组组学学&基因基因组组学学 ProteinBacterial CellDNAGenomeProteomeDNA Fingerprint30005000700090001100013000Mass(m/z)2117.30102030405060708090100%IntensityVoyager Spec#1=AdvBC(32,0.5,1.0)=NF0.7BP=4423.9,21174424.29476.24861.08823.55897.86271.28054
10、.36629.07424.912271.44738.66984.68383.86786.76533.39075.23132.36137.37209.88903.38610.610110.84765.410975.24026.94535.63311.810493.93491.49611.5MassFingerprintSpeciesDefinition&DeterminationMALDI-TOF MSMALDI-TOF MS现代微生物分类学:蛋白组学&基因组学 P r o t e i n B a1313不同不同细细菌代表性指菌代表性指纹图谱纹图谱不同不同各菌种代表性峰型分布存在显著差异，有助于
11、鉴定各个菌种！各菌种代表性峰型分布存在显著差异，有助于鉴定各个菌种！4000m/z8000Burkholderia cepacia Raoultella ornithinolytica Staphylococcus aureusPantoea agglomerans Acinetobacter lwoffiEscherichia coli1 3 1 3不同细菌代表性指纹图谱不同各菌种代表性峰型分布1414肠肠杆菌杆菌 （EnterobacteriaceaeEnterobacteriaceae）MSMS图谱图谱示示:科科,属属,种特异性峰种特异性峰值值部分峰值是多数菌种共有的部分峰值是多数菌种共
12、有的（如（如 m/z 4365:m/z 4365:核糖体蛋白核糖体蛋白 L36)L36)峰值有峰值有 科科,属属,种或种或 亚种亚种-特异性特异性种种间间特异性代表峰特异性代表峰值值用来区用来区分不同菌种分不同菌种30005000700090001100013000m/zEscherichia coliH afnia alveiLeclercia adecarboxylataK lebsiella pneum oniaeProteus m irabilis Enterobacter aerogenes1 4 1 4 肠杆菌（E n t e r o b a c t e r i a c e a e
13、）MS核糖体蛋白不受生长条件影响核糖体蛋白不受生长条件影响Mass spectra of Proteus mirabilis DSM 4479 at different incubation timesNo major qualitative changes in peak patterns distinguishing family,genus and speciesDecrease of signal intensity over timePresence and absence of peaksIdentification with 99%confidence核糖体蛋白不受生长条件影响M
14、a s s s p e c t r a o f P样品SARAMIS 工作流程工作流程转移细胞到MALDI 靶板导入数据至SARAMIS4000600080001000012000m/z1c.2I45263963877748176997060097545498240868962101657453125284478114226260LIMS鉴定/比较分析基质样品S A R A MI S 工作流程转移细胞到MA L D I 靶板导入数微生物鉴定流程微生物鉴定流程生长在固体培养基上的菌落全细胞 MALDI-TOF谱图数据库中参考谱图输出可信鉴定结果找到匹配度最可信的谱图找到匹配度最可信的谱图微生物鉴
15、定流程生长在固体全细胞 MA L D I-T O F 谱图数据库18鉴鉴定定结结果界面果界面样品名称样品名称鉴定结果鉴定结果置信度置信度MS 数据数据日期日期只需数秒，全自动添加新采集数据至鉴定结果界面！只需数秒，全自动添加新采集数据至鉴定结果界面！科科属属种种型型数据数量数据数量不同颜色代表不同置信水平不同颜色代表不同置信水平 深绿深绿:99.9%浅绿浅绿:90-99.9%黄色黄色:85-90%白色白色:70-85%低于低于70%不显示置信值不显示置信值红色红色:提醒复杂的结果提醒复杂的结果匹配匹配2种或以上菌种，置信度种或以上菌种，置信度99%:鉴定混合菌鉴定混合菌1 8 鉴定结果界面样品
16、名称鉴定结果MS 数据日期只需数秒，全自SARAMIS鉴定混合菌种鉴定混合菌种A mass spectrum of a mixed sample containingPseudomonas aeruginosa and Achromobacter xylosoxidansShows peaks specific to both species300040005000600070008000900010000110001200013000Mass/Charge7291.64331.87319.65237.04973.76320.26692.27575.06618.34433.77097.7856
17、2.09086.06345.86045.05735.69402.710029.95209.06674.27487.87201.05014.67763.48880.73161.14700.96306.03787.23645.04543.14353.03344.55266.48745.86714.75676.09588.68403.99959.910123.29427.912565.810534.69215.88584.69724.211401.7S A R A MI S 鉴定混合菌种A ma s s s p e c t r u m ol 单核增生性李斯特菌单核增生性李斯特菌Listeria mo
18、nocytogenes (Lm)l 兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，自然界分布广泛，是食源性李斯兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，自然界分布广泛，是食源性李斯特病（人畜共患病）的致病原因，低温仍具有增殖能力特病（人畜共患病）的致病原因，低温仍具有增殖能力对老年人，婴儿，孕妇和免疫缺陷者的致死率是对老年人，婴儿，孕妇和免疫缺陷者的致死率是 20-30%20-30%l该菌经常存在于速食食品中该菌经常存在于速食食品中 Ex.About 2,500cases/year in USA食品安全食品安全 Tokyo Marine University,Prof Kimura and Dr.TakahashiTokyo M
19、arine University,Prof Kimura and Dr.TakahashiEatable without heated and cocked or cocked food,ex.,ham,daily product,salad,smoked food etc现有检测方法需要现有检测方法需要2 2步骤和选择培养基，耗时步骤和选择培养基，耗时6 6天天 单核增生性李斯特菌L i s t e r i a mo n o c y t o g e nYakult(养乐乐多)l乳酸菌生产质量控制乳酸菌生产质量控制l品种改良品种改良lPerformance+SARAMISY a k u l t
20、 (养乐多)乳酸菌生产质量控制Classified as genus=species=strain“Thickness”of database is important.From 2011 European society of clinical microbiology and infections disease菌种鉴定准确度菌种鉴定准确度C l a s s i f i e d a s F r o m 2 0 1 1 E u r o p e15-Oct-2223SARAMIS：Spectral ARchive And Microbial Identification System 数据库含
21、有超级谱图（SuperSpectra）和参考谱图（Reference Spectra）使用者可以创建和储存超级谱图或参考谱图 软件包可实现谱图的存储，分析和比较 使用者可以做聚类分析，创建系统树图用于菌株分型0 3-O c t-2 2 2 3 S A R A MI S：S p e c t r a l A RSARAMIS 菌种特异峰型菌种特异峰型 合成谱图包含所有在个体谱图中出现频率大于阀值的所有峰(如：在各谱图中出现 70%的)在超级谱图中，所有峰值根据他们对所代表的菌种特异性而赋予权重值 具有科、属特异性的峰值权重低，这些峰值不支持菌种鉴定 具有菌种特异性的峰值权重则会加重S A R A
22、MI S 菌种特异峰型合成谱图包含所有在个体谱图中出现SARAMIS 比较工具比较工具300040005000600070008000900010000110001200013000m/z5263777496388176879299706009481767464086754583398962102194469678837715709788831426260Cluster analysis of selected reference and sample mass spectraComparison to mass spectral patterns of reference spectra i
23、n the databaseS A R A MI S 比较工具3 0 0 0 4 0 0 0 5 0 0 0 6 0 0 0在在SARAMIS数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌株（基于质谱图数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌株（基于质谱图谱，基因组学，表型数据）谱，基因组学，表型数据）atypical reference isolates are over-represented in SARAMIS phylogenetic distancephylogenetic distancefrequencyfrequency自然界菌种多样性自然界菌种多样性在S A R A MI
24、 S 数据库中一个菌种的典型代表包含典型和非典型菌SARAMISSuperSpectraDatabase020406080100%Int.400060008000100001200014000m/z1713 mVsum=42832 mV Profiles 1-25 Smooth Av 3043636289724376475393914072716382526494827337820695457291660445673620567612244885310641811813258141081.Unambiguous identification with 80+%confidenceLIMS020
25、406080100%Int.400060008000100001200014000m/z1713 mVsum=42832 mV Profiles 1-25 Smooth Av 304363628972437647539391407271638252649482733782069545729166044567362056761224488531064181181325814108SARAMISReference SpectraDatabase2.Identification 离子传输率大大提高，从而提离子传输率大大提高，从而提高灵敏度。高灵敏度。增宽传输离子质量范围增宽传输离子质量范围 离子流方
26、向传统的锥式离子传输传统的锥式离子传输布鲁克公司独家专利设计：离子流方向 离子传输率大大提高，micrOTOFQ适用范围：适用范围：电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪 分子式测定和分子结构鉴定：分子式测定和分子结构鉴定：如：如：化学合成产品，配位化合物，化学合成产品，配位化合物，天然产物，代谢物，残留农药等天然产物，代谢物，残留农药等 大分子研究大分子研究如：蛋白质如：蛋白质/多肽，多糖，多聚物等多肽，多糖，多聚物等 复杂混合物分析复杂混合物分析mi c r O T O F Q 适用范围：电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪 精确质量精确质量(3ppm)micrOTOFQ：
27、独特的三维信息独特的三维信息 MS/MS提供结构信息提供结构信息电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪 SigmaFit参数（参数（同位素峰形匹配）同位素峰形匹配）精确质量(3 p p m)mi c r O T O F Q：独特的三维信息 精确质量精确质量(3ppm)micrOTOFQ：独特的三维信息独特的三维信息 MS/MS提供结构信息提供结构信息电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪电喷雾四级杆飞行时间串联质谱仪 SigmaFit参数（参数（同位素峰形匹配）同位素峰形匹配）精确质量(0 2 1 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 C 2 5 4437.0425438.
28、0372439.0397440.03690.00.40.81.2437.0427438.0376439.0400440.03590.00.40.81.2437.0396438.0351439.03750.00.40.81.2436.0398Experimental436.0400C12H22NO10S3436.0367C15H18NO10S2024602460246435436437438439440441442m/zsigma=0.0167sigma=0.0231Intensity x 104ABC鉴定化合物的有效工具鉴定化合物的有效工具-SigmaFit两种可能元素组成的确定两种可能元素组
29、成的确定4 3 7.0 4 2 5 4 3 8.0 3 7 2 4 3 9.0 3 9 7 4 4 0.0 3分子量分子量 500500DaDa未知物的元素组成预测？未知物的元素组成预测？分子量 5 0 0 D a 未知物的元素组成预测？人参提取液人参提取液（稀释倍数稀释倍数 1:100;HPLC-microTOF Q）0510152025Time min02464x10Intens.BPC 499.997-1299.991-All MS1153.598181154.600531155.601441156.598420.000.250.500.751.001.251.504x10Intens.
30、115411561158 m/z人参提取液（稀释倍数 1:1 0 0;H P L C-mi c r o当设置误差范围当设置误差范围 5 ppm时：时：171个可能的分子式个可能的分子式Generate Molecular Formula当设置误差范围 5 p p m时：1 7 1 个可能的分子式G e n e16个个可能的分子式可能的分子式当设置误差范围当设置误差范围 3ppm 时：时：Generate Molecular Formula1 6 个可能的分子式当设置误差范围 3 p p m 时：G e n eC55H93O25用用SigmaTM参数比较同位素参数比较同位素峰形匹配，选择峰形匹配
31、，选择Sigma值最值最小的分子式，即该化合物的小的分子式，即该化合物的分子式为：分子式为：Generate Molecular FormulaC 5 5 H 9 3 O 2 5 用S i g ma T M参数比较同位素峰形匹配，选SigmaTM参数用于参数用于比较同位素峰形匹配比较同位素峰形匹配1153.601141154.604561155.607421156.61021C55H93O25,1153.601153.595271154.598681155.601701156.60459C62H89O20,1153.5905001000150020002500Intens.0500100015
32、00200025001153115411551156115711581159m/zC55H93O25C62H89O20SigmaTM=0.0171 SigmaTM=0.0540 S i g ma T M参数用于比较同位素峰形匹配1 1 5 3.6 0 1 1 4质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用-教学-课件未知多肽测序测定未知多肽测序测定 GluFib:MS/MS of m/z=785.8(+2)333.1898480.2559684.3445813.3868942.42871056.47041171.49911285.5426N+0.0006D+0.0017N-0.0012E-0.000
33、7E-0.0003G-0.0001F-0.0012F-0.0023SA-0.0007V+0.0014G-0.0014+MS,2.8-3.4min#(85-103)024684x10Intens.200400600800100012001400m/zMass DistanceRMS 误差误差:0.00097 Da未知多肽测序测定 G l u F i b:MS/MS o f m/z 动态范围的实际意义动态范围的实际意义m/z 855.xxxTIMED D=150ppm 高质量准确度测定与液质联用高质量准确度测定与液质联用常规高分辨质谱仪在液质常规高分辨质谱仪在液质联用时面临的挑战联用时面临的挑战
34、动态范围的实际意义m/z 8 5 5.x x x T I ME D =LC/MS高质量准确度测定高质量准确度测定在法医药物监测中的应用在法医药物监测中的应用Dept.of Forensic MedicineUniversity of Helsinki,FinlandRapid Commun.Mass Spectrum 2006;20:1161-1167L C/MS R a p i d C o mmu n.Ma s s S p e c t r尿样尿样 法医毒理分析法医毒理分析总离子流色谱图 TIC 尿样 法医毒理分析总离子流色谱图 T I C 准确质量动态范围准确质量动态范围forensic s
35、creening:positive hits317.257.507.758.008.258.508.759.009.259.50Time min0.00.51.01.55x10Intens.EIC 264.196+All MSEIC 250.18+All MS250.1794251.1844252.17441.+MS,8.8-9.4min02000400060008000Intens.249.5250.0250.5251.0251.5252.0m/zerror:2.98 ppmsigma:0.0165 264.1959265.19923.+MS,9.1-9.8min0.00.51.01.52.
36、06x10Intens.264.00264.50265.00265.50266.00m/zerror:0.19 ppmsigma:0.0084 Signal intensity:8 x103Signal intensity:2 x106 准确质量动态范围f o r e n s i c s c r e e n i n g:p布鲁克集团公司布鲁克集团公司Affiliated Companies红外光谱分析仪红外光谱分析仪傅立叶拉曼分析仪红外光谱生命科学解决方案 Bruker BioSciencesNASDAQ:BRKRX射线分析仪射线分析仪 用于材料研究的X射线分析仪 用于蛋白结构分析的荧光仪生物质谱仪生物质谱仪飞行时间质谱 离子经质谱 四极杆/飞行时间串联质谱 傅立叶回旋变换质谱核磁共振生命科学仪器核磁共振生命科学仪器电子顺磁共振仪 核磁共振仪布鲁克集团公司A f f i l i a t e d C o mp a n i e sB r质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用-教学-课件质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用-教学-课件丰收：土地、种子、气候.质谱仪细菌鉴定：细菌纯培养、完善的数据库.（耐药性检测、混合菌检测）科研：科研设计、大量典型的样品.种类型号众多的质谱仪，每种有其特定的用途。丰收：土地、种子、气候.质谱技术在微生物鉴定和生物医学中的应用-教学-课件 再见！再见！
