1、第 19 章在基因水平诊断疾病概述概述 几乎所有的疾病均在一定程度上与基因有某种联系，基因的改变，或是疾病发生的原因，或是疾病发生的结果，或是疾病发生时的伴随现象，而这些现象的出现是有规律的。因此，可以通过检测基因的改变来反映疾病的发生和发展，疗效和预后。临床诊断l细胞学诊断 生化学诊断 血清免疫学诊断l基因诊断 从基因水平提供更早期、更准确的诊断依据 nucleusGeneDiagnosis transcriptiontranslationFour types of diagnosisClinical manifestationBiologicalDiagnosis SerumDiagnos
2、is ClinicalDiagnosis 目前临床疾病的诊断方法目前临床疾病的诊断方法 基因诊断的特点1、属于“病因诊断”。从分子水平找到特异的致病基因。2、高灵敏度。（微量标本）3、结果稳定4、诊断感染性疾病早期、快速5、应用广、适用性强对疾病的确切诊断预警诊断、产前诊断、新生儿筛查 疾病的易感性、分期分型、疗效监测、预后判断快速诊断体外不易或不能安全培养的病原体法医学鉴定 基因诊断经历三个基本阶段基因诊断经历三个基本阶段 第一阶段：世纪年代，以DNA分子杂交为基础，通过RFLP分析进行。样品量大，过程复杂，同位素 第二阶段：以PCR为基础的一系列技术。操作方便、快捷。第三阶段：应用基因芯片
3、技术。大大提高样品处理的自动化程度和检测结果的准确性。第一节 基因诊断的理论基础 基因诊断的实质是应用分子生物学和分子遗传学理论和技术，分析受检者基因的结构和功能是否正常，从而对受检者作出诊断。一、遗传的物质基础Gene The fundamental unit of life-form for carrying,transmitting and expressing genetic information等位基因病态杂合子病态纯合子 一对染色体的两条染色单体所含基因种类、数目和位置都相同。同一位点的基因及其变异体称为等位基因。二、突 变 Mutation:The heritable alte
4、rations of genetic material caused by internal or external factors,which lead to genotype and/or phenotype change.In general,mutation includes:chromosome aberration gene mutation spontaneous，physical，chemical，biological injury Static mutation a)Point mutation:base substitution,insertion,deletionType
5、s of mutation Dynamic mutation unstable trinucleotide(or“triplet”)repeat sequences 3bp tandem repeats:CAG,CGG or CTGb)Fragment mutation:deletion,insertion,inversion,fusion75years63years44yearsDisorder Location Repeat Normal range Disease range of gene sequence repeat repeatFRAX Xq27.3 CCG*654 pre-mu
6、tation 60200 full mutation 2002000 HD 4p16.3 CAG*934 pre-mutation 36121 DM 19q13.3 CTG*535 pre-mutation 5080 full mutation 802000 *encode region，*5untranslate region，*3UTRFRAX:Fragile X syndromeHD:Huntington diseaseDM:Myotonic dystrophyDisorders caused by dynamic mutation第二节 基因诊断的基本技术基因诊断：利用分子生物学技术，
7、从DNA或RNA水平检测基因的存在、分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。核酸分子杂交和聚合酶链式反应是利用核酸的变性和复性，对核酸进行检测的两大基本技术。前者：标记的已知核酸（探针）检测微量未知核酸分子（目标）的存在；后者：体外对核酸分子进行无限扩增。（对极微量标本进行分析）（一）核酸分子杂交技术 核酸分子杂交 是指单链核酸分子（DNA或RNA）在特定条件下，与另一条互补的特异核酸链形成稳定双链的过程。主要依据：碱基互补、变性和复性 DNA与DNA杂交：A=T、GC;DNA与RNA杂交:A=U、GC;变性：在一定温度下，使核酸双链解开为两条单链；复性：随温度逐渐恢复，变性的两条单
8、链重新形成互补双链碱基互补 根据核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本的单链核酸互补配对，判断互补的同源核酸序列存在与否。核酸探针 指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合以检测同源序列。探针标记物 放射性核素 生物素、地高辛、荧光素等制备 样品制备探针杂交检测核酸分子杂交（固相杂交）操作程序核酸分子杂交（固相杂交）操作程序制备待测核酸样品分离、变性、转移、固化DNA片段杂交加入标记核酸探针检测杂交信号标记核酸探针预杂交制备核酸探针漂洗去除未参与杂交的标记探针探针的种类(1)DNA探针 包括全基因组探针、基因
9、或基因片段探针(2)cDNA探针 用逆转录所得的cDNA克隆后制备，现广泛采用(3)RNA探针 不稳定，不易操作，少用。(4)寡核苷酸探针制备合适探针是核酸分子杂交技术用于基因诊断的关键核酸分子杂交的分类核酸分子杂交的分类液相杂交液相杂交：待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应。待测核酸样本与特异性探针同时溶于杂交液中进行杂交反应。固相杂交固相杂交：待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。待测核酸样本先结合到固相支持物上，再与溶液中的特异性探针进行杂交反应。常用固相杂交支持物：常用固相杂交支持物：硝酸纤维素膜、尼龙膜等硝酸纤维素膜、尼龙膜等 核酸分子
10、杂交的基本类型：此外，还有上述方法衍生而来的斑点杂交(dot blot)、原位杂交（in situ hybridization)等技术。分类 检测对象 探针 Southern blot DNA片段 DNA或RNA片段 Northern blot RNA片段 DNA或RNA片段 Western blot 蛋白质 标记蛋白质洗膜 Southern 印迹杂交：组织或细胞 含已知基因的重组质粒菌株 基因组DNA 质粒DNA 限制酶酶解及电泳分离 限制酶酶解及电泳分离回收含已知基因的DNA片段 转移到硝酸纤维膜或尼龙膜 标记的探针 预杂交杂交 放射自显影 总DNA目标DNA用限制酶消化不同大小的DNA片
11、断根据片段大小用凝胶电泳分离滤膜转印、变性同标记的DNA探针孵育、鉴定原位杂交 体外体外高效、快速、特异高效、快速、特异地扩增目的基因或地扩增目的基因或DNA片段。片段。原理：类似于原理：类似于DNA的体内复制的体内复制 在试管中的在试管中的DNA的体外合成。的体外合成。用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。Polymerase chain reaction,PCR 1983，PE Cetus company，Kary Mullis二、PCR 技术PCR CycleSTEPSPrimer1Prim
12、er2Geometric AmplificationAfter 30 cycles,theDNA is amplifiedover a billion fold.目的基因增加2nPCR技术在基因诊断中的应用1.采用PCR技术进行基因诊断 体内疾病相关基因缺失或突变 病原微生物基因存在与否正常异常插入 正 异 标2.PCR-限制性片段长度多态性分析 (PCR-RFLP)RFLP原理：用某种限制性内切酶消化人DNA 产生许多不同长度的限制酶切片段 当基因突变（点突变、缺失、插入等）酶切位点改变（消失、移动、新位点）限制性片断数量和长度发生改变。PCR-RFLP：PCR扩增包含待测位点的DNA片段
13、用识别该位点的限制性内切酶水解 琼脂糖电泳观察结果。DNA多态性在人群中，个体间基因组的核苷酸序列存在着差异性。TAGAGTACAG正常突变突变正常Marker3.PCR 等位基因特异性寡核苷酸探针（PCR/ASO）一对探针：针对已知突变，分别合成一对寡核苷酸探针，其中一个为野生型探针(与无突变序列互补)，另一个是突变型探针(与突变序列互补)，突变碱基及对应的正常碱基置于探针中央。一对引物，严格控制杂交条件53引物1引物2（CT）突变位点 PCR扩增目的片段，与两种特异性ASO探针杂交，据杂交信号判断为正常或异常基因，进一步明确是哪种致病基因。若不止一种突变，还可根据常见的突变体类型，合成一系
14、列具有正常序列和突变序列的ASO。结果判断：正常探针突变探针正常探针突变探针正常探针突变探针正常探针多种突变探针无该种突变突变基因纯合子突变基因杂合子新突变类型4.PCR产物反相点杂交原理和结果判断与PCR/ASO相同。不同：探针固定于膜上，PCR产物在液相中。ASO1ASO2NormalHeteroHomo5.PCR-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）原理：将目的基因PCR 扩增产物变性为单链如某一单链DNA分子存在单个或多个硷基变异构象改变 PAGE时迁移率与正常产物比较发生了变化。缺点：不能检测何种硷基突变及突变的具体部位单链构象多态性：在中性条件下，DNA单链由于分子内碱基相互作用
15、，形成一定的立体构象。长度相同而碱基组成或排列顺序不同的DNA单链，即有不同的构象。PCRATCGWildAmplify region of interestDenature samples in Formamide and HeatATCGMutantDNA molecules conformation depends on their sequenceRun on a Non-denaturing gel and look for mobility differencesTAGC 正常片段 突变片段 PCR扩增 变性成单链 PAGE比较 具体方法：6.PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-DG
16、GE）变性剂：尿素、甲酰胺原理：变性剂 DNA发生部分解链 电泳迁移率改变。方法：制备含变性剂(浓度从低到高)的凝胶 PCR产物电泳 当DNA泳动到变性剂浓度能使DNA发生变性的位置时，DNA双链开始分开，迁移速率 不同DNA分子的碱基组成不同，所需变性剂的浓度不同。7.扩增阻滞突变体系NN MN MM NN MN MM 250bp300bp内对照（AB）300bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12A C C1 C C1 C C1 B D D1 D D1 D D1（amplification refractory mutation system，ARMS）D1 C C1 A
17、DBDNA250bp8.甲基化特异性PCR（MS-PCR）用亚硫酸氢钠处理模板DNA，可将未甲基化的C U，而CpG岛的甲基化的C则不受影响。原理：设计两对引物：一对甲基化特异性引物：引物中的G可与模板中的C配对 一对非甲基化特异性引物：引物中的A可与模板中的U配对 NNHONH2NHNHOOCUGGACGTAGACCTGCATCT-GCGCTAGGCGGACGTAGA-CGCGATCCG GCGCATGGC AAACATAAA UUTGUATUT-GCGCTAGGC GGACGTAGA-AUGUGATUU TACACATAA 非甲基化引物甲基化引物9.定量PCR即对靶核酸分子进行定量分析。方
18、法：PCR产物直接定量，极限稀释法，靶基因与参照基因的同步扩增，竞争PCR，荧光定量PCR。左侧正常对照第225位碱基为C，而患儿为A 三、DNA序列测定 是诊断基因突变最直接的方法。指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量DNA探针以显微打印的方法有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得出样品的遗传信息。由于常用计算机硅芯片作为固相支持物，故称为DNA芯片，又称基因芯片、DNA阵列。四、基因芯片 同时检测多种突变成千上万的寡核苷酸探针有规律排列在芯片上荧光标记的被测 DNA（RNA，cDNA）与芯片上的探针杂交激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描 计算机
19、系统对每个探针上的信号作比较和检测不同的基因诊断策略致病基因检测连锁遗传标志检测基因表达定量分析表型相关的系列基因克隆第三节 基因诊断的策略 不同的疾病，其原因和发生机制不同，基因诊断策略也不同。（一）遗传病基因诊断（一）遗传病基因诊断的策略与方法的策略与方法1.1.直接策略：采用基因突变的诊断方法直 接检测致病基因。该策略的前提是基因已被克隆。2.2.间接策略：即通过检测与致病基因连锁 的遗传标记进行基因诊断。1、直接基因诊断己知的点突变：导致限制性内切酶位点改变:RFLP无限制性酶切位点改变:PCR/ASO 扩增阻滞突变体系 DNA芯片技术未知的点突变：DGGE、SSCP、DNA序列测定
20、基因重排(DNA片段长度变化较大)：核酸分子杂交、多重PCR基因表达异常:mRNA分析2、间接基因诊断 检测致病基因的连锁遗传标志原理：同一染色体上位置相邻的基因或其他遗传标志通常一起遗传，形成连锁。通过对一个或几个基因或遗传标志的分析，可了解另外的基因。如可用限制性内切酶位点作为遗传标志，定位与之连锁的正常基因或致病基因，建立染色体的基因连锁图。通过分析连锁的遗传标志，可判断致病基因存在的可能性，或疾病相关基因导致疾病发生的可能性。（60%）“Am I a carrier of the gene that1.snp snp indel提取mRNA cDNA 定量PCR荧光定量PCR。21三体
21、性Down综合症PCR-限制性片段长度多态性分析主要依据：碱基互补、变性和复性主要依据：碱基互补、变性和复性这些重复序列可用限制酶切，或PCR扩增，不同个体所获酶切片段或PCR产物的长度各异。（PCR/ASO）1165bp竞争PCR，一对甲基化特异性引物：引物中的G可与模板中的C配对过去：形态学、生化学或血清学方法。MstII CCTNAGGDNA芯片技术：RNA检测与分析：RT-PCR相对定量RFLP 某一RFLP存在于致病基因染色体上，正常基因无该RFLP；或RFLP不存在于致病基因染色体上，正常基因有该RFLP。RFLP致病基因有正常基因无致病基因无正常基因有人类基因组上的人类基因组上的
22、DNADNA遗传标记遗传标记1980 限制性片段长度多态性(RFLPs)1985 短串联重复序列(short tendem repeats,STRs,mini-satellites)1990s 单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymor-phisms SNPs)Restriction Fragment Length Polymorphysm (RFLP)Most of RFLPs do not represent a mutation but a linkage markthree different molecular genotypespolymorphic si
23、te*(About 100,000 RFLPs in human genome)Eco R1 Site Southern blot 等位基因连锁的RFLP(Allele linkage-RFLP)An urgent question often in the early stages of pregnancy is:“Am I a carrier of the gene thatkilled my brother,and if so,is my baby going to be affected as well?”I 1 2II 1 2 3III 1 17 18 879bp 286 Bcl I
24、 B*B （60%）The first antenatal diagnosis for haemophilia（血友病）by chorion villus sampling(CVS)The first polymorphism found in FVIII I-1 I-2 II-1 II-2 II-3 III-1 1165bp 879bp短串联重复序列STRs (short tendem repeats,Microsatellites)人类基因的基因内或旁侧序列存在许多重复序列(如微卫星DNA、小卫星DNA)，由于重复数目不同形成多态性。己发现一些基因结构和表达异常与这些重复序列有关。主要形式
25、为：(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，(CGG)n，其中以(CA)n，(GT)n 为多见。polymorphic sequences PCR products定义:主要指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。与RFLP和STR不同,它是直接以序列的变异作为标记,而不是以片段的长度差异作为标记。单核苷酸多态性（single nucleotid polymorphism，SNP）SNPs是目前为止分布最为广泛、存在数量最多的一种遗传多态性。人类基因组DNA多态性中单核苷酸多态性占90。某些SNPs有可能直接影响蛋白质结构或表达水平，因此它们可能代表疾
26、病遗传机理中的某些作用因素。ATGGTAAGCCTGAGCTGACTTAGCGT-ATATGGTAAACCTGAGTTGACTTAGCGTCAT snp snp indelSingle nucleotide polymorphysms (SNPs)Single base-pair differences between individuals are pretty common and easy to find in contrast to RFLPs and VNTRs(there are 1,400,000 SNPs in human genome,about 1 in 1000bp)针对
27、mRNA进行分析1)mRNA相对定量分析：斑点杂交 RT-PCR2)mRNA绝对定量分析：提取mRNA cDNA 定量PCR3)mRNA长度分析：Northern blot逆转录3.基因表达的定量分析镰状红细胞贫血：-珠蛋白基因第六密码子 GAG(Glu)GTG(Val)DNA检测与分析：l PCR-限制酶谱分析法：l 合成特异寡核苷酸探针进行Southern blotRNA检测与分析：RT-PCR产物直接测序异常血红蛋白病的基因诊断MstII CCTNAGGb bA CCT GAG GAG 1.15kb 0.2 b bS CCT GTG GAG 1.35kb 1.15kb1.35kbbA/b
28、SbAbS镰状细胞贫血：a aa a 14kbBamHI BamHI aa/aa aa/-aa/a-a-/-/-aa/aa aa/-aa/a-a-/-/-10kb a a-地中海贫血：不同数量(1-4个)-珠蛋白基因缺失1.定性分析：PCR法直接扩增1和2 基因的3端有差别，针对此可设计引物进行PCR，如有缺失，则不能扩增出产物 2.定量分析：RT-PCR定量分析mRNA的量以协助诊断PCR-ASO探针法：-地贫基因诊断的最主要途径PCR-RFLP连锁分析法：珠蛋白基因5端有HgiA I多态性位点PCR扩增包含该位点在内的110bp的珠蛋白基因片段 酶切 65+45bp。DNA芯片技术：RNA
29、检测与分析：RT-PCR相对定量-地中海贫血基因诊断DNA检测与分析-地贫分子缺陷：主要由点突变或移码突变珠蛋白链的合成明显减少或完全不合成所致。110bp65bp45bp父母患儿胎儿 基因重排：核酸分子杂交与PCR （1）Southern 印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号。（2）多重PCR 诊断方法：限制性酶切图谱直接分析法：多重PCR：如设计相应于外显子4、8、12、17、19、44、45、48、51 的9对引物，扩增该基因中9个易发生缺失的热点区。杜氏肌营养不良症 （Duchene mu
30、scular dystrophy，DMD）48,xxy,+18着丝粒探针：13（红）18（粉）；21（绿）X（黄）；Y（白）2号染色体短臂和14号染色体长臂易位（24色多重FISH)21三体性Down综合症（21号染色体涂染探针，1个中期和2个间期细胞)（二）肿瘤的分子诊断策略和方法肿瘤基因诊断的策略：1.检测肿瘤染色体易位及融合基因 2.检测肿瘤相关基因如癌基因、抑癌基因、肿瘤转移基因、肿瘤转移抑制基因 3.检测肿瘤相关病毒基因 4.检测肿瘤标记物基因或mRNA 肿瘤的发生涉及多基因、多因素、发生过程呈多阶段性、发生的分子机制十分复杂,因此对不同的肿瘤要采用不同的基因诊断策略.1.检测肿瘤染
31、色体异位及融合基因 慢粒：Ph染色体，9号染色体的原癌基因abl易位至22号染色体的bcr基因附近，产生bcr-abl融合基因。急性早幼粒：15号染色体的PML基因与17号染色体的维甲酸受体（RARa a）基因连接，形成 PML-RARa a融合基因。融合基因检测方法：PCR技术 急性骨髓白血病10、11号染色体间易位2.检测肿瘤相关基因检测肿瘤相关基因 癌基因-ras与肿瘤:p53基因与肿瘤：突变热点在第175、273、284密码子。突变后不仅自身的抑癌功能丧失，还可中和另一个野生型等位基因产物的抑癌功能（负显性作用）。此外，突变后的p53还具有癌基因功能即转化正常细胞的能力（转化效应）。如
32、原癌基因K-ras第12、13和61位密码子点突变：GGT-TGT/GTT/GAT/GCT人类免疫缺陷病毒（HIV）人类乙型、丙型肝炎病毒（HBV、HCV）EB病毒（EBV）人乳头瘤病毒（HPV）人T细胞白血病病毒（HTLV）3.检测肿瘤相关病毒基因 多种DNA或RNA病毒感染与肿瘤相关 4.检测肿瘤标记物基因或mRNA 肿瘤标志物：由肿瘤组织细胞产生，与肿瘤形成和发展相关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。基因标志：指基因突变和异常表达，能反映癌前启动阶段的变化。如胰腺癌：K-ras、p53、端粒酶。基因表型标志：基因表达和调控异常，产生胚胎性抗原。如AFP、CEA、前列腺特异性抗原（
33、PSA）、组织多肽性抗原（TPA）PCR-限制酶谱分析法：（1）Southern 印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号。10、11号染色体间易位DNA芯片技术：RNA检测与分析：RT-PCR相对定量原理：将目的基因PCR 扩增产物变性为单链如某一单链DNA分子存在单个或多个硷基变异构象改变 PAGE时迁移率与正常产物比较发生了变化。漂洗去除未参与杂交的标记探针检测方法:a.PCR-ASO b.PCR-RFLP c.PCR-SSCP d.DGGE e.5.检测表型克隆基因 用于诊断多基因、多因素的疾
34、病，如哮喘、心血管疾病、型糖尿病、肿瘤、精神疾病等。差异显示法找出正常人与患者之间的差异序列分离、鉴定与疾病相关的多个基因，并克隆制备相应的一组探针检测与该组基因相关的多基因疾病（三）感染性疾病的基因诊断过去：形态学、生化学或血清学方法。目前：PCR法，核酸分子杂交法。特点：灵敏度高，速度快。1.一般性检出策略和方法2.完整检出策略和方法诊断的策略：1.一般性检出策略和方法 只需要确定：有否病原体感染及何种病原体感染。根据病原体特异的核酸序列设计探针或引物，进行核酸分子杂交或PCR。如：细菌感染性疾病 针对致病细菌所含质粒的特异序列，设计引物，检测引起疾病的细菌类型。采用与病毒RNA互补的cD
35、NA探针 进行斑点杂交直接检测血清中的基因组。病毒性肝炎的基因诊断 PCR方法HAV：5-NCR，3-NCR HBV：C、S、P、X区 HCV：5-NCR HDV：ORF 5 区 3端 HEV：第2、3 ORF 部分序列引物：根据肝炎病毒基因组的保守区设计方法选择：除HBV外,其余均为RNA病毒,需进行 RT-PCR扩增产物分析：电泳，RFLP，点杂交，Southern blotl 核酸分子杂交：2.完整检出策略和方法 对病原体的分型和耐药性（基因）进行检测，即设计型特异引物或探针。诊断技术：PCR结合核酸分子杂交、基因芯片、DNA测序等技术 主要目的是个人识别（如对犯罪嫌疑人的确认）和亲子鉴
36、定。微卫星DNA等重复序列在不同个体间的重复次数不同，是重要的多态性标志。这些重复序列可用限制酶切，或PCR扩增，不同个体所获酶切片段或PCR产物的长度各异。通过分子杂交，即可获得大小不等的杂交带，其数目和分子量大小具有个体特异性，犹如指纹之千差万别而被名之为DNA指纹（finger-rinting）。基因诊断法医学鉴定的应用（一）理论问题基因诊断的基础需预知基因结构或表达的变化 与疾病发生有关。（二）技术问题（三）伦理问题基因诊断技术存在的问题 根据核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理，用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待测样本的单链核酸互补配对，判断互补的同源核酸序列存在与否。核酸探
37、针 指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与待测样本中单链核酸分子互补配对结合以检测同源序列。探针标记物 放射性核素 生物素、地高辛、荧光素等 PCR扩增目的片段，与两种特异性ASO探针杂交，据杂交信号判断为正常或异常基因，进一步明确是哪种致病基因。若不止一种突变，还可根据常见的突变体类型，合成一系列具有正常序列和突变序列的ASO。人类基因组上的人类基因组上的DNADNA遗传标记遗传标记1980 限制性片段长度多态性(RFLPs)1985 短串联重复序列(short tendem repeats,STRs,mini-satellites)1990s 单核苷酸多态性 (single-nucl
38、eotide polymor-phisms SNPs)人类基因组上的人类基因组上的DNADNA遗传标记遗传标记1980 限制性片段长度多态性(RFLPs)1985 短串联重复序列(short tendem repeats,STRs,mini-satellites)1990s 单核苷酸多态性 (single-nucleotide polymor-phisms SNPs)PCR-ASO探针法：-地贫基因诊断的最主要途径PCR-RFLP连锁分析法：珠蛋白基因5端有HgiA I多态性位点PCR扩增包含该位点在内的110bp的珠蛋白基因片段 酶切 65+45bp。DNA芯片技术：RNA检测与分析：RT-
39、PCR相对定量-地中海贫血基因诊断DNA检测与分析-地贫分子缺陷：主要由点突变或移码突变珠蛋白链的合成明显减少或完全不合成所致。110bp65bp45bp父母患儿胎儿人类免疫缺陷病毒（HIV）人类乙型、丙型肝炎病毒（HBV、HCV）EB病毒（EBV）人乳头瘤病毒（HPV）人T细胞白血病病毒（HTLV）3.检测肿瘤相关病毒基因 多种DNA或RNA病毒感染与肿瘤相关 4.检测肿瘤标记物基因或mRNA 肿瘤标志物：由肿瘤组织细胞产生，与肿瘤形成和发展相关的物质，包括：肿瘤抗原，激素，酶和同工酶。基因标志：指基因突变和异常表达，能反映癌前启动阶段的变化。如胰腺癌：K-ras、p53、端粒酶。基因表型标志：基因表达和调控异常，产生胚胎性抗原。如AFP、CEA、前列腺特异性抗原（PSA）、组织多肽性抗原（TPA）
