1、细菌性突发公共卫生事件的实验室检验技术 根据病情的发展根据病情的发展,本菌可相继存本菌可相继存在于在于鼻咽腔鼻咽腔、肺泡灌洗液肺泡灌洗液、血液血液、淤血点淤血点及及脑脊液脑脊液等标本中，在实等标本中，在实验室检测中应取相应检材验室检测中应取相应检材 粪便、肛拭粪便、肛拭：粪便标本应尽量在病程早期和治粪便标本应尽量在病程早期和治疗前采集，同时应采集新鲜粪便，选取有脓血、疗前采集，同时应采集新鲜粪便，选取有脓血、粘液部分粘液部分3-53-5克、水样便取含絮状物的克、水样便取含絮状物的2-52-5mlml，盛盛于无菌容器中及时送检。于无菌容器中及时送检。若无法获得粪便若无法获得粪便时，可时，可用保存
2、液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门用保存液或增菌液湿润过的棉拭子插入肛门4-54-5cmcm深处（小儿深处（小儿2-32-3cmcm），），轻轻转动一圈，擦取直肠表轻轻转动一圈，擦取直肠表面的黏液后取出，盛入运送培养基或保存液中送面的黏液后取出，盛入运送培养基或保存液中送检。注意为保证多个检验项目的开展，同一病人检。注意为保证多个检验项目的开展，同一病人应至少采集应至少采集 呕吐物呕吐物：直接放入无菌容器中及时送检：直接放入无菌容器中及时送检 咽拭样品咽拭样品：采集时应将棉签檫拭咽喉及扁：采集时应将棉签檫拭咽喉及扁桃体红肿处（特别是白膜处），然后将棉桃体红肿处（特别是白膜处），然后将棉签插入签插
3、入4-5ml生理盐水中，尾部弃去生理盐水中，尾部弃去 血液血液：采集患者急性发病期（：采集患者急性发病期（3天内）和恢天内）和恢复期（复期（2周左右）各周左右）各3ml全血分离血清送检全血分离血清送检 霍乱弧菌霍乱弧菌、副溶血弧菌及其它致病性弧菌副溶血弧菌及其它致病性弧菌、金黄色葡萄球菌金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌蜡样芽胞杆菌、沙门菌沙门菌、变形杆菌变形杆菌、致泻性大肠埃希菌致泻性大肠埃希菌、空肠弯曲空肠弯曲菌菌、小肠结肠耶尔森菌小肠结肠耶尔森菌、志贺菌志贺菌、溶血性溶血性链球菌链球菌及及单核细胞增生李斯特菌单核细胞增生李斯特菌引起的食引起的食源性突发事件的样品检验源性突发事件的样品检验 竭尽
4、全力尽快找到病原体竭尽全力尽快找到病原体 快速、准确快速、准确 可与传统方法可与传统方法不一定完全相同不一定完全相同 1.样品采集样品采集 2.初步检验初步检验活菌数、直接镜检活菌数、直接镜检(涂片涂片染色染色镜检镜检)3.分离培养分离培养 (包括增菌培养和直接平板培养包括增菌培养和直接平板培养)4.初筛试验初筛试验 5.纯培养纯培养 6.全面鉴定全面鉴定 观察存在于检品中特种形态的细菌观察存在于检品中特种形态的细菌如如霍乱弧菌、弯曲菌霍乱弧菌、弯曲菌，为进一步的，为进一步的检验提供有用的信息检验提供有用的信息 病源检样因含较多病原菌而一般病源检样因含较多病原菌而一般无须做预增菌处理，但若病源
5、检无须做预增菌处理，但若病源检样为样为服过抗生素后服过抗生素后采集的检样应采集的检样应按检验项目要求而进行预增菌处按检验项目要求而进行预增菌处理以保护和放大目的病原菌理以保护和放大目的病原菌 直接插入直接插入2ml TSB管管37预增菌预增菌46h 将无须做增菌处理的病源检样按检将无须做增菌处理的病源检样按检验项目要求直接接种于各相应培养验项目要求直接接种于各相应培养基基 将将预预增菌处理后的服过抗生素后采集增菌处理后的服过抗生素后采集的病源检样按检验项目要求接种各相的病源检样按检验项目要求接种各相应应增菌液培养增菌液培养 增菌培养后接种于增菌培养后接种于各相应培养基各相应培养基 克氏克氏双糖
6、双糖/三糖铁三糖铁/肠道综合发酵管肠道综合发酵管1 1、管、管2 2 PCRPCR VIDASVIDAS 全面生化试验（等）噬菌体试验 血清分型 毒素或毒素基因测试毒素或毒素基因测试 霍乱弧菌肠毒素、葡萄球菌肠毒素、霍乱弧菌肠毒素、葡萄球菌肠毒素、EIECEIEC侵袭毒素、侵袭毒素、ETECETEC肠毒素按国标方法进行动肠毒素按国标方法进行动物试验或酶联免疫试验（物试验或酶联免疫试验（VIDASVIDAS等）等）毒素基因测试毒素基因测试：霍乱弧菌肠毒素、葡萄球：霍乱弧菌肠毒素、葡萄球菌肠毒素、致泻性大肠埃希菌的所有毒力菌肠毒素、致泻性大肠埃希菌的所有毒力基因均可用基因均可用PCRPCR检测，特
7、别是对致泻性大肠检测，特别是对致泻性大肠埃希菌的定论应以毒素或毒素基因为准埃希菌的定论应以毒素或毒素基因为准 疑似伤寒或副伤寒的患者应取发病一疑似伤寒或副伤寒的患者应取发病一周的血清做肥达氏反应，用作辅助诊周的血清做肥达氏反应，用作辅助诊断断 将患者急性期和恢复期的血清将患者急性期和恢复期的血清做凝集做凝集效价的对比，效价的对比，4 4倍增长可确诊倍增长可确诊 应以找到病原体或其毒素为应以找到病原体或其毒素为最终结论最终结论，在此之前所有的快速检验方法如在此之前所有的快速检验方法如PCR、VIDAS等得到的等得到的结果结果仅供参考仅供参考 应注意非病源检样与病源检样检出的应注意非病源检样与病源
8、检样检出的病原体的病原体的统一性统一性 多数患者样品中检出的多数患者样品中检出的的细的细菌在种类、生化和菌在种类、生化和/或血清型、毒素型或血清型、毒素型均一均一致致时，可报告为细菌性食源性疾病事件的时，可报告为细菌性食源性疾病事件的病原体病原体 非病源检样与病源检样检出占非病源检样与病源检样检出占但但通常通常的细菌如大肠艾希的细菌如大肠艾希菌、溶藻弧菌等，且其在种类、生化和菌、溶藻弧菌等，且其在种类、生化和/或或血清型均一致，同时本次细菌性食源性疾血清型均一致，同时本次细菌性食源性疾病事件中非患者对照标本中未检出该菌时，病事件中非患者对照标本中未检出该菌时，应做该菌的毒素、毒素基因或动物试验
9、，应做该菌的毒素、毒素基因或动物试验，阳性结果可报告为细菌性食源性疾病事件阳性结果可报告为细菌性食源性疾病事件的的 接触酶试验接触酶试验 氧化酶试验氧化酶试验 革兰阴性杆菌革兰阴性杆菌阳性反应阳性反应 弧菌科弧菌科阴性反应阴性反应肠杆菌科肠杆菌科阳性反应阳性反应葡萄球菌葡萄球菌 革兰阳性球菌革兰阳性球菌阴性反应阴性反应链球菌链球菌接触酶接触酶接触酶接触酶-+18801880年发现，至今已有年发现，至今已有26002600种种 有动力有动力（除（除鸡鸡-雏沙门菌雏沙门菌）大多产大多产H H2 2S S （除副甲伤寒除副甲伤寒沙门菌沙门菌等）等）产酸大多产气产酸大多产气（除伤寒、（除伤寒、鸡鸡-雏
10、沙门菌雏沙门菌）靛基质靛基质-、蔗糖、蔗糖-、乳糖、乳糖-甘露醇甘露醇+符合肠杆菌科特征（葡萄糖符合肠杆菌科特征（葡萄糖+、硝酸盐还原、硝酸盐还原+、氧化酶、氧化酶-）q肠道综合发酵管肠道综合发酵管1 1：甘露醇（上斜面）甘露醇（上斜面）+葡萄糖（下直面）葡萄糖（下直面）+产气产气q肠道综合发酵管肠道综合发酵管2 2：蔗糖蔗糖-、动力动力+、H H2 2S+S+、靛基质靛基质-A-F多价+O H1 H2q若生化反应符合，而血清若生化反应符合，而血清A-F多价多价-，考虑：，考虑：A A群群 甲型副伤寒沙门菌甲型副伤寒沙门菌 1,2,12:1,2,12:a a B B群群 乙型副伤寒沙门菌乙型副
11、伤寒沙门菌 1,4,5,12:1,4,5,12:b:1,2b:1,2 鼠伤寒沙门氏菌鼠伤寒沙门氏菌 1,4,5,12:1,4,5,12:i:1,2i:1,2 C C群群 丙型副伤寒沙门菌丙型副伤寒沙门菌 6,7,6,7,vi:c:1,5vi:c:1,5 猪霍乱沙门菌猪霍乱沙门菌 6,7,:6,7,:c:1,5c:1,5 D D群群 肠炎沙门菌肠炎沙门菌 1,9,12:1,9,12:g,mg,m 伤寒沙门菌伤寒沙门菌 1,9,1,9,vi:dvi:d 鸡雏沙门菌鸡雏沙门菌 1,9,12:-1,9,12:-q肠道综合发酵管肠道综合发酵管1 1：甘露醇（上斜面）甘露醇（上斜面）+/-+/-葡萄糖（下
12、直面）葡萄糖（下直面）+不产气不产气q肠道综合发酵管肠道综合发酵管2 2：蔗糖蔗糖-、动力动力-、H2S-H2S-、靛基质靛基质+nABCD4组O抗原多价凝集血清群nO单价n型特异抗原n种特异抗原（3，4，6，7）q若生化反应符合，而血清若生化反应符合，而血清A-F多价多价-，考虑：，考虑：18851885年德国人艾希自人畜肠腔分离出（年德国人艾希自人畜肠腔分离出（E.E.colicoli），），人人类认识该菌为正常细菌类认识该菌为正常细菌 19451945年年BaryBary自病儿腹泻便中大量检出自病儿腹泻便中大量检出E.E.colicoli，并证实并证实该该E.E.colicoli是病源是
13、病源 逐渐认识逐渐认识E.E.colicoli有两类：正常有两类：正常E.E.colicoli和致泻和致泻E.E.colicoli EIECEIEC、EPECEPEC、ETECETEC 19821982年美国发现有种年美国发现有种E.E.colicoli引起出血性肠炎（引起出血性肠炎（HCHC）和和溶血性尿毒综合征（溶血性尿毒综合征（HUSHUS）19871987年年levinelevine提出提出EHECEHEC概念，指出概念，指出SLTSLT毒素是病因毒素是病因 19961996年日本年日本90009000名儿童暴发，名儿童暴发，1111人死亡，人死亡，E.E.colicoli O157O
14、157：H7H7 1999年我国暴发？年我国暴发？q该菌1926年被确认为是人兽共患病菌，但很快受到重视：分布广泛分布广泛，在全世界的土壤、水中都有存在，温带比热带更多见易感动物多易感动物多，除人类外，迄今已从42种哺乳动物，22种禽类、鱼类、甲壳动物中分离出来，其中易感性最高的是牛、兔、犬、猫低温下可生长低温下可生长，虽然此菌属于中温型，但其生长温度宽，为145在46的低温下也可繁殖。因此，放在冰箱中的食品，或经冷藏运输的食品，如有此菌存在，它们都可生长繁殖并使人致病q1988年世界卫生组织证实为食物中毒病原菌：此菌可以通过水源、食品原料、厨房食物水源、食品原料、厨房食物制作中任何一个环节的
15、污染传播给人类。主要的食品有4种：牛乳和乳制品：肉类，特别是牛肉及其制品；蔬菜、沙拉等食品；海产品 本菌为革兰氏本菌为革兰氏阳性阳性杆菌，菌体杆菌，菌体短小短小，直或，直或稍弯稍弯 在在22222525环境可形成环境可形成4 4根鞭毛，故在根鞭毛，故在2525幼肉汤培养物中幼肉汤培养物中运动活泼运动活泼，3737基本基本无动力无动力。幼龄培养物为革兰氏阳性，衰老培养物可幼龄培养物为革兰氏阳性，衰老培养物可转为革兰阴性，呈两极着色，易误认为双转为革兰阴性，呈两极着色，易误认为双球菌。球菌。q本菌营养要求本菌营养要求不高不高，在，在20-2520-25培养有动力，培养有动力，穿刺培养，穿刺培养，2
16、-52-5天可见天可见倒立伞状倒立伞状生长生长q该菌的生长范围为该菌的生长范围为2-422-42（故可用故可用44冷增冷增菌菌以抑制其它杂菌的干扰），最适培养温度为以抑制其它杂菌的干扰），最适培养温度为35-3735-37q初期在初期在5%5%羊血琼脂平板上菌落细小、露滴状、羊血琼脂平板上菌落细小、露滴状、光滑、透明，后变灰暗。单核细胞增生李斯特光滑、透明，后变灰暗。单核细胞增生李斯特菌菌、绵羊李斯特菌绵羊李斯特菌、西尔李斯特菌西尔李斯特菌在血平板上在血平板上的菌落有的菌落有狭窄的狭窄的-溶血环溶血环 1673年：年：显微镜发明 1880年：年：人工培养基发明 1914年：年：干燥培养基发明
17、1970年以前：年以前：忙于分离各种细菌，采用生化及血清学鉴定 1970年以后：年以后：电脑化+细菌数值分类鉴定的应用 1980年：年：微量快速生化的应用及全自动鉴定系统的产生 1985年以后：年以后：各种免疫及核酸技术的广泛应用O157：H7墨绿色菌落墨绿色菌落。VITEK定向試驗標記定向試驗標記樣本碼樣本碼 卡片碼卡片碼載有底物載有底物的小孔的小孔批號批號卡片卡片名稱名稱VITEK 样本肉汤於样本肉汤於SPR内流动内流动不断的清洗不断的清洗标致著的抗体标致著的抗体跟目标微生物跟目标微生物抗原结合抗原结合免疫夹心形成免疫夹心形成仪器阅读仪器阅读最终萤光值最终萤光值Antibodiescoat
18、ed on theSPR wall,specificallycapture themicroorganismbeing detectedOrganismbeing detectedOther organismsSampledispensedintothe stripAb conjugated to alkaline phosphatase4 methylumbelliferylphosphateResidueafterwashingAg to be detectedBound Ab免疫浓缩前免疫浓缩前40 分钟分钟免疫浓缩後免疫浓缩後 成品培养基成品培养基手工手工/自动自动鉴定系统鉴定系统全自
19、动全自动检测系统检测系统 糖苷酶糖苷酶 色原（荧光）色原（荧光）糖苷结合物糖苷结合物 糖苷糖苷+色原（荧光）色原（荧光）氨基肽酶氨基肽酶 色原（荧光）色原（荧光）氨基酸结合物氨基酸结合物 氨基酸氨基酸+色原（荧光）色原（荧光）常用呈色的色原有：常用呈色的色原有：、萘酚，邻位或对位萘酚，邻位或对位硝基酚，对硝基苯胺，酚酞，硝基酚，对硝基苯胺，酚酞，2-2-氨氨4-4-硝基苯硝基苯 常用的荧光物有：常用的荧光物有：4-4-甲基伞形酮（甲基伞形酮（4 4MUMU），），7 7氨基氨基4 4甲基伞形酮香豆素甲基伞形酮香豆素 q细菌的致病作用是否发生与细菌的致病作用是否发生与3 3要素：要素：毒力、毒力
20、、侵入数量、侵入部位侵入数量、侵入部位有关有关q毒力：毒力：毒素、侵袭力毒素、侵袭力毒素毒素：来源、理化性质、作用分成内毒素来源、理化性质、作用分成内毒素（G-G-产生）、外毒素（产生）、外毒素（G+G+产生）产生）2 2类类侵袭力侵袭力：突破机体屏障、在体内定居、繁殖、突破机体屏障、在体内定居、繁殖、扩散的能力，扩散的能力，菌毛、侵袭性酶菌毛、侵袭性酶 直接检出细菌的毒素，常比细菌培养更可靠。直接检出细菌的毒素，常比细菌培养更可靠。难辨梭菌难辨梭菌 产毒素埃希氏菌产毒素埃希氏菌（ETECETEC）LT LT（热敏毒素）与热敏毒素）与STST（耐热毒素）耐热毒素）肠出血性大肠埃希氏菌（肠出血性
21、大肠埃希氏菌（EHECEHEC）VT/SLT VT/SLT 金黄色葡萄球菌多种肠毒素金黄色葡萄球菌多种肠毒素 霍乱弧菌肠毒素霍乱弧菌肠毒素 副溶血弧菌副溶血弧菌TDHTDHDNA RNA 蛋白质抗体反应代谢反应脂肪酸特征 易污染（多次开关管）假阳性率高，杂带多，肉眼难判断 灵敏度还不高 后续步骤复杂（电泳、EB）时间较长 定量检测，准确性高 特异性强，灵敏度高 操作快速，实时观测 多个通道，提高效率 技术简单，易于掌握 电脑操作，数据管理 不在乎定量，在乎实时 不在乎高通量，在乎多重PCR1-1S.epidermidis(医护人员的手)S.epidermidis(医护材料)S.epidermi
22、dis(病儿)医原性感染源的追踪医原性感染源的追踪E：肺炎克雷白阳性，SHV以及相应的23S RNA阳性；F：为混合细菌感染图像，肠致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、铜绿假单胞菌菌以及肺炎克雷白杆菌均呈阳性；G:混合细菌感染图像，肠出血性大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌阳性；H：混合细菌感染图像，大肠杆菌、球菌、铜绿假单胞菌阳性E F G H1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12ABCDEFGHIJKLMNOPQRPCECltstbfpAeaeAPCstx1stx2EC-hlyACadCPCECinvAipaHSACoAfhmBPCSpyspeBSlySpnpbp2bPlyPCPAOprIOprLPCLMLspphlyOVCctxAtcpAPCVPToxRVC-hlyAYEystPCPCCJcadFNCKPSHVNCPCLP16SNCCPcpANCPCBCnprBG4500m
