1、流式细胞术在临床上的应用流式细胞术在临床上的应用深圳市人民医院临床医学研究中心深圳市人民医院临床医学研究中心 李富荣李富荣流式细胞术的临床应用1 第一部分 流式细胞仪（FCM)）工作原理流式细胞术的临床应用2FCMFCM系统结构系统结构流体系统：样本流、鞘液流体系统：样本流、鞘液光学系统：激光光源、分光镜、滤片、光学系统：激光光源、分光镜、滤片、散射光和荧光探测器散射光和荧光探测器分选系统：压电晶体、液流成滴、加电分选系统：压电晶体、液流成滴、加电 系统、偏转系统系统、偏转系统数据处理系统：计算机工作站数据处理系统：计算机工作站流式细胞术的临床应用3FCMFCM工作原理流程：工作原理流程：样本
2、（血液实体组织）单细胞悬液荧光染料特异染色的样本上机细胞单列通过测量区1.散射光信号2.荧光信号分离、收集、分析、光信号细胞理化特性分析图加入荧光染料激光激发流式细胞术的临床应用4流式细胞仪的构造及原理流式细胞仪的构造及原理流式细胞术的临床应用5FCMFCM测量光信号获取与分析测量光信号获取与分析散射光信号前向散射光(FSC)-细胞大小侧向散射光（SSC)-细胞粒度（膜的粒度、核大小与粒度、胞质数量）FSC信号越大，表明细胞体积越大；反之，则越小。SSC信号越大，表明细胞粒度越大；反之，则越小。流式细胞术的临床应用6根据根据FSC-SSCFSC-SSC二维点图，可以容易区分二维点图，可以容易区
3、分Lym(R3)Gran(R1)Lym(R3)Gran(R1)与与Mono(R2)Mono(R2)R1R2Incident Light SourceRight Angle Light Dectector a Cell ComplexityForward Light Detector a Cell Surface AreaR3R2R1根据根据FSC-SSCFSC-SSC二维点图，可以容易的区分出二维点图，可以容易的区分出Lym(R3).Gran(R1)Lym(R3).Gran(R1)与与Mono(R2)Mono(R2)流式细胞术的临床应用7流式细胞术常用染料及检测波长流式细胞术常用染料及检测波长
4、流式细胞术的临床应用8流式细胞术的临床应用9荧光染料的发射不同波长荧光染料的发射不同波长流式细胞术的临床应用10DNA DNA 和和RNARNA荧光探针的理化特性荧光探针的理化特性荧光探针荧光探针 分子量分子量 结合方式结合方式 碱基特异性碱基特异性 激发锋（激发锋（nm)nm)发射锋发射锋(nm)(nm)P1 668 P1 668 嵌入嵌入 无无 493 630 493 630EB 394 EB 394 嵌入嵌入 无无 482 616 482 616MI 1069 MI 1069 非嵌入非嵌入 G-C 320,445 575 G-C 320,445 575 CA3 1183 CA3 1183
5、 非嵌入非嵌入 GC 320,445 575 GC 320,445 575 HO33258 624 HO33258 624 非嵌入非嵌入 AT 343 480 AT 343 480 HO33342 615 HO33342 615 非嵌入非嵌入 AT 343 455 AT 343 455DAPI 350 DAPI 350 非嵌入非嵌入 AT 540 650 AT 540 6507-AAD 1270 7-AAD 1270 嵌入嵌入 GC 540 655 GC 540 655 AO 370 AO 370 嵌入嵌入(双链）双链）无无 492 530 492 530 静电（单链）静电（单链）640 64
6、0PY 303 PY 303 嵌入嵌入(双链）双链）GCAT 549-562 565-574 GCAT 549-562 565-574 静电（单链）静电（单链）流式细胞术的临床应用11细胞周期分析细胞周期分析通过荧光探针对细胞周期进行相对通过荧光探针对细胞周期进行相对DNADNA含量的测定，可分析细含量的测定，可分析细胞周期各时期的百分比，周期动力参数及胞周期各时期的百分比，周期动力参数及DNADNA异倍体异倍体G1SG2GoM流式细胞术的临床应用12分选系统（分选系统（Sorting)Sorting)依据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群体：依据流式细胞术测定的细胞参数可分选所需细胞群
7、体：电荷式分选电荷式分选稳定液流测量区液滴形成液滴充电液滴偏转分选收集逻辑电路流式细胞术的临床应用13电荷式分选电荷式分选流式细胞术的临床应用14通道式分选通道式分选稳定液流测量区逻辑电路捕获管分选收集流式细胞术的临床应用15 第二部分第二部分 流式细胞术在临床医学中的应用流式细胞术在临床医学中的应用流式细胞术的临床应用16流式细胞术的临床应用17流式临床应用流式临床应用淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析Th1/Th2 肿瘤学肿瘤学HLA-B27PNH 四聚体四聚体血小板活化血小板活化 细胞凋亡细胞凋亡 移植免疫移植免疫流式细胞术的临床应用18流式细胞术的临床应用19流式细胞术的临床应用20流式
8、细胞术的临床应用21流式细胞术的临床应用22流式细胞术的临床应用23常常用用淋淋巴巴细细胞胞亚亚群群报报告告模模式式R流式细胞术的临床应用24深圳深圳市人市人民医民医院流院流式细式细胞术胞术报告报告单模单模式式流式细胞术的临床应用25流式细胞术的临床应用26流式细胞术的临床应用27流式细胞术的临床应用28流式细胞术的临床应用29流式细胞术的临床应用30流式细胞术的临床应用31流式细胞术的临床应用32流式细胞术的临床应用33流式细胞术的临床应用34流式细胞术的临床应用35流式细胞术的临床应用36流式细胞术的临床应用37HLA-B27通过CD3PEvsSSC设门，圈定CD3阳性细胞（T淋巴细胞），
9、检测其B-27的平均荧光强度。如标本的平均荧光强度小于标准微球荧光强度则为阴性，反之为阳性。流式细胞术的临床应用38流式细胞术的临床应用39 Th1/Th2细胞流式细胞术的临床应用40流式细胞术的临床应用41流式细胞术的临床应用42流式细胞术的临床应用43流式细胞术的临床应用44流式细胞术的临床应用45流式细胞术的临床应用46 肿瘤学肿瘤学流式细胞术的临床应用47流式细胞术的临床应用48流式细胞术的临床应用49流式细胞术的临床应用50流式细胞术的临床应用51流式细胞术的临床应用52流式细胞术的临床应用53流式细胞术的临床应用54流式细胞术的临床应用55流式细胞术的临床应用56流式细胞术的临床应
10、用57流式细胞术的临床应用58流式细胞术的临床应用59 细胞凋亡细胞凋亡流式细胞术的临床应用60流式细胞术的临床应用61流式细胞术的临床应用62流式细胞术的临床应用63流式细胞术的临床应用64流式细胞术的临床应用65 移植免疫移植免疫流式细胞术的临床应用66流式细胞术的临床应用67流式细胞术的临床应用68流式细胞术的临床应用69流式细胞术的临床应用70流式细胞术的临床应用71 四聚体四聚体流式细胞术的临床应用72Tetramer-原理原理内源性抗原内源性抗原外源性抗原外源性抗原流式细胞术的临床应用73Tetramer-原理原理MHC Class I-HLA-A2流式细胞术的临床应用74Tetr
11、amer-原理原理流式细胞术的临床应用75Tetramer-原理原理国外医学免疫学分册 2001；24(2):102-105流式细胞术的临床应用76HLA Class I 限定性肿瘤抗原肽限定性肿瘤抗原肽流式细胞术的临床应用77抗原特异性抗原特异性CTL的分析方法的分析方法51Cr释放实验释放实验PCR法法酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法(ELISPOT)扩增特异T淋巴细胞受体Tetramer法法间接法需大量的特异性CTLs作为效应细胞需体外扩增，周期长，敏感性低，费时费力难以广泛应用敏感性高但只能用于已知TCR基因型的特异性CTLs检测直接法敏感性高不受TCR基因型的限制有限稀释法有限稀释法(L
12、DA)用用Tetramer法研究表明，外周血中仅有法研究表明，外周血中仅有0.2-2.5%的的CD8+细胞对细胞对CMV和和EBV特异特异流式细胞术的临床应用78Tetramer法法Doherty PC.The numbers game for virus-specific CD8+T cellsJ.Science,1998,280:227了解病毒特异性CTL和记忆性CTL方面的一项革命检测病毒特异性CD8细胞的金标准(Gold Standard)流式细胞术的临床应用79Tetramer-应用应用感染性疾病感染性疾病HIV-AIDS,EBV,CMV,HPV,HBV,HCV,Influenza,
13、Measles,Malaria,TB and RSVBreast,Prostate,Melanoma,Colon,Lung,Cervical,Ovarian and LeukemiaDiabetes,Lyme disease,Multiple sclerosis,Rheumatoid arthritis,Autoimmune vitiligoEBV and CMV 移植移植 自身免疫性疾病自身免疫性疾病肿瘤肿瘤流式细胞术的临床应用80感染性疾病感染性疾病Tetramer-应用应用-例证例证含有HIV-I型病毒包膜肽等三种抗原肽：HIV特异性CTL数量与血浆中RNA病毒量有明显的负相关，而与产毒
14、性感染细胞的清除率无关慢性HCV感染患者的特异性CTLs数量明显少于急性HCV感染和已康复患者用黑色素瘤抗原诱导潜在的肿瘤特异性T细胞用Tetramer分离，富集GVHD(移植物抗宿主反应)：受体与供体的次要组织相容性抗原(mHags)的不同引起，在骨髓移植后早期出现(14天内)，造成骨髓移植失败-HLA-mHags肽四聚体监测mHags特异性CTL，以了解对GVHD的临床治疗效果HLA-A2/pp65 Tetramer监测肾移植患者感染CMV后的免疫应答能力 移植移植肿瘤肿瘤流式细胞术的临床应用81流式细胞术的临床应用82流式细胞术的临床应用83 第三部分第三部分 定量流式细胞术定量流式细胞
15、术流式细胞术的临床应用84 定量流式细胞术的概述定量流式细胞术的概述定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝定量流式细胞术指的是对待细胞的某种生物分子的绝对计量，而不是阳性细胞的相对百分数。对计量，而不是阳性细胞的相对百分数。原理：通过检测标准微球的荧光强度获得标准曲线，原理：通过检测标准微球的荧光强度获得标准曲线，通过标准曲线（或方程）求得待测细胞的某种生物分通过标准曲线（或方程）求得待测细胞的某种生物分子的精确数值，从而反应在某种生理、病理条件下待子的精确数值，从而反应在某种生理、病理条件下待测细胞出现的微细变化，对临床疾病的研究、诊断及测细胞出现的微细变化，对临床疾病的研究、诊断及
16、治疗等具有重要意义治疗等具有重要意义。流式细胞术的临床应用85血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量-PLATELET Calibrator Kit-PLATELET Calibrator Kit流式细胞术的临床应用86特点特点可定量与血小板相关的任何抗原(如CD41,CD61,CD42a等)免洗间接法一抗亚型为IgG1,IgG2a或IgG2b定量范围宽(500-90,000 分子/血小板)定量准确，CV值(变异系数)小血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量-PLATELET Calibrator Kit-PLATELET Calibrator Kit流式细胞术的临床应用87标准曲线标准曲线血小板
17、表面抗原定量血小板表面抗原定量-PLATELET Calibrator Kit-PLATELET Calibrator Kit流式细胞术的临床应用88结果结果血小板表面抗原定量血小板表面抗原定量-PLATELET Calibrator Kit流式细胞术的临床应用89CD41/61复合物变形与复合物变形与Firbrinogen结合，为结合，为初期血栓初期血栓形成的关键步骤形成的关键步骤PLATELET Fibrinogen Kit流式细胞术的临床应用90应用应用心血管疾病(不稳定心绞痛，心肌梗塞等)监测抗凝集治疗(如RepPro,Integrelin,Plavix,Ticlid等)检测GPIIb
18、/IIIa(CD41/CD61)受体Fibrinogen结合能力血液体外(in vitro)活化(ADP等诱导)后，检测Fibrinogen结合能力血小板活化状态(ex vivo)标本处理标本处理PLATELET Fibrinogen Kit流式细胞术的临床应用91白细胞表面抗原定量白细胞表面抗原定量-CELLQUANTTM Calibrator Kit流式细胞术的临床应用92特点特点可定量与白细胞相关的任何抗原(如CD3,CD4,CD55,CD59等)单个定量(用一个单抗，如CD28抗体定量白细胞表面CD28分子数)多参数定量(如用CD8设门来定量CD8+T细胞上CD28分子数)全血和分离的
19、细胞(如细胞株等)均可间接法一抗亚型为IgG1和IgG2a定量范围宽(1000-300,000 分子/白细胞)定量准确，CV值(变异系数)小白细胞表面抗原定量白细胞表面抗原定量-CELLQUANTTM Calibrator Kit流式细胞术的临床应用93标准曲线标准曲线白细胞表面抗原定量白细胞表面抗原定量-CELLQUANTTM Calibrator Kit流式细胞术的临床应用94结果结果白细胞表面抗原定量白细胞表面抗原定量-CELLQUANTTM Calibrator Kit流式细胞术的临床应用95Blood Dendritic Cell Enumeration KitDCDC作用作用：1.
20、树突状细胞（dendritic cell,DC）为一群非均一性专职抗原递呈细胞，与MHC二类分子结合向其它免疫活性细胞传递抗原信息。2.骨髓样DC（MDC）和淋巴样DC(PDC).在诱导和调控免疫应答方式上完全不同：首先它们表达不同的抗原识别受体并对不同的抗原起作用；表达不同的细胞因子受体并对不同的细胞因子起反应，即使受到相同的抗原刺激。骨髓样DC（MDC）与Th1效应相关,而淋巴样DC（PDC）与Th2效应有联系；已经应用的领域包括已经应用的领域包括：1）SLE病人病情和疗效观察；2）AIDS病人免疫机能分析；3）病毒性肝炎病人免疫状况研究；4）疫苗研究。流式细胞术的临床应用96特点特点简便
21、、简便、快捷、快捷、绝对计数绝对计数DC亚群数亚群数/ml流式细胞术的临床应用97流式细胞术的临床应用98最新技术最新技术计数血液中循环内皮细胞的标准方法计数血液中循环内皮细胞的标准方法流式细胞术的临床应用99循环内皮细胞循环内皮细胞(CEC)增加于增加于CELLQUANT FF-CD146急性冠状动脉综合征血小板减少性紫癜镰刀细胞贫血败血症狼疮肾病综合征器官移植排斥手术创伤癌症传统方法传统方法显微镜检，手工计数。费时，费力，无法标准化流式细胞术的临床应用100新技术新技术新标准新标准CELLQUANT FF-CD146免疫磁珠富集与3色流式细胞术结合仅需1 mL血整个过程不到1个小时灵敏度高
22、：1mL血中可检测出10个循环内皮细胞重复性好，室间差(Interlaboratory CV)小流式细胞术的临床应用101方法方法CELLQUANT FF-CD146将包被CD146单抗的铁磁性纳米颗粒(CD146FF)与1mL 血孵育富集的CD146+细胞用以下试剂染色 PI(碘化丙啶)(确定有核细胞)CD45-FITC(排除WBC(白细胞)干扰)CD146-PE单抗(识别CD146抗原的另一位点)标准浓度微球(用于绝对计数)流式分析(循环内皮细胞鉴定)有核细胞(PI+);CD45-;CD146+;前向散射角(FSC)范围宽流式细胞术的临床应用102CELLQUANT FF-CD146PI-
23、CD45 FITC流式细胞术的临床应用103CELLQUANT FF-CD146PI-CD45 FITC流式细胞术的临床应用104CELLQUANT FF-CD146流式细胞术的临床应用105CELLQUANT FF-CD146流式细胞术的临床应用106CELLQUANT FF-CD146流式细胞术的临床应用107 第四部分第四部分 在医学研究中的应用在医学研究中的应用流式细胞术的临床应用108优点：1.1.临床医师进行疾病细胞免疫研究的一种好工具临床医师进行疾病细胞免疫研究的一种好工具2.2.可同时进行临床基础研究和疾病诊断、疗效评价可同时进行临床基础研究和疾病诊断、疗效评价3.3.可与世界研究水平同步可与世界研究水平同步4.4.临床医师不需亲自参与试验过程临床医师不需亲自参与试验过程5.5.研究工作周期短研究工作周期短流式细胞术的临床应用109流式细胞术的临床应用110
