1、临床基因诊断实验室技术准入的缺陷分析江苏省临床检验中心 许斌我国医学实验室管理我国医学实验室管理国家实验室国家实验室认可委员会（CNAS）：依据-ISO 15189；国家认可；自愿卫生部执业认证：医疗机构临床实验室管理办法 为加强医疗机构临床实验室管理，提高临床检验水平，保证医疗质量和医为加强医疗机构临床实验室管理，提高临床检验水平，保证医疗质量和医疗安全，卫生部出台并决定自疗安全，卫生部出台并决定自2006年年6月月1日起施行。办法包括总则、日起施行。办法包括总则、医疗机构临床实验室管理的一般规定、质量管理、安全管理、监督管理、医疗机构临床实验室管理的一般规定、质量管理、安全管理、监督管理、
2、附则等六章五十六条。附则等六章五十六条。各省细则：江苏省医院检验科建设管理规范 省、市临床检验中心，强制，【体系+能力】PCR实验室技术准入依据和标准实验室技术准入依据和标准临床基因扩增检验实验室管理暂行办法临床基因扩增检验实验室管理暂行办法 卫医发卫医发200210号号临床基因扩增检验实验室工作规范临床基因扩增检验实验室工作规范 卫检字卫检字20028号号临床基因扩增检验实验室现场技术验收表临床基因扩增检验实验室现场技术验收表 十章三十八款十章三十八款1993年1995年12月（MM3-A,已批准）NAT用于传染病的规定2000年（MM1-A,已批准）NAT用于遗传病的规定2000年（MM5
3、-P,审定中）NAT用于血液病的规定2001年（MM6-P,审定中）定量NAT用于传染病的规定2001年（MM7-P,审定中）原位杂交NAT用于遗传病的规定2002年正在编写中的 MM9 NAT用于遗传病的规定 MM10 遗传病的基因型鉴定 MM11 NAT用于细菌分裂 MM12 点阵式NAT在临检中的应用方法 MM13 NAT的样品制备 MM14 NAT的质控 MM15 NAT在“人类基因组”应用中的规定物理的:分区及单向流动、专用移液器、一次性试管架、紫外灯、PCR工作罩、滤芯吸嘴。化学的：dUTP/UNG PCR产物防污染系统、DNA清洁液。方法学的：即时Taqman法，Lab-on-a
4、-chip芯片法，RT PCR一步法。制度和操作规范（维护保养、执行）两步法 RNA cDNA PCR 一步法 RNA PCR CT (I-Cycler/7000/COBAS-Taqman)Taqman 动力学(Caliper AG-9900 自动加样)Lab on a Chip封闭废液孔RTTaqTth(RT+Taq)扩增中以脱氧尿苷(dUTP)取代脱氧胸苷(dTTP)，扩增产物可被尿苷酶(UNG)消解，在经加热处理，即在脱氧尿苷处断裂，不再能作为模板被扩增。后续扩增进行之前在PCR反应体系中加入UNG处理，在预变性加热后，可能的产物污染即被消除。PCR防污染防污染UNG和和dUTP防止防止
5、“假阳性假阳性”的图解的图解这种“假阳性”是由于污染了前次PCR产物所致TAAAATTTTAAAAUUUPCRAAATUTAAAUUUAAAAAA*UNG加热加热PCR实验室分区原则实验室分区原则单一流向、明确的识别标记单一流向、明确的识别标记各区仪器设备物品配备的充分性和科学性各区仪器设备物品配备的充分性和科学性防污染防污染分区分区南 通 医 学 院 附 属 医 院临 床 基 因 诊 断 实 验 室 布 局 及 人 流、物 流平 面 示 意 图产 物 分 析 区PCR扩 增 区样 品 准 备 区试 剂 准 备 区样 品 接 收 区工作走向门门门门门 单口洗眼器900传递窗2000177010
6、502800洗涤室急诊室生化室临检室2500300026005009009009005000500050002496标本处理电脑输出PCR1缓冲PCR2缓冲缓冲PCR3PCR4缓冲3000490017006100500ABBBBBBBBA2550450015007506000750冰库库房杂物间二楼实验室设备水电分布图项目说明编号名称规格（W*D*H mm)数量 配置A中央水柜1500*750*800 20钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽（其中4组带洗眼器）B边台1500*750*800 78钢木结构，13mm黑色TRESPA板C边台2600*500*800 1钢木
7、结构，18mm黑色大理石台面，带活动盖板D采血台6100*500*800 1钢木结构，18mm黑色大理石台面E采血台10000*500*800 1钢木结构，18mm黑色大理石台面F接样台5850*500*800 1钢木结构，18mm黑色大理石台面G边台5800*750*800 1钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽H电脑台2550*750*800 1钢木结构，27mm灰色防火板台面I电脑台4500*750*800 1钢木结构，27mm灰色防火板台面J边台3000*750*800 1钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽K边台4900*750*800
8、 1钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽L边台2900*750*800 1钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽M边台2800*750*800 1钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽N边台2100*750*800 1钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽O边台3800*750*800 1钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带三口水龙头/PP水槽P标本柜900*500*2000 5铝木结构，带活动层板Q边台5100*750*800 1钢木结构，13mm黑色TRESPA板，带两套三口水龙头/PP大水槽，一
9、套三口龙头/冷热水/PP水槽R器皿柜900*500*2000 3铝木结构，抗倍特层板S手推车800*450*850 15不锈钢制，双层T紧急淋浴器 1落地式，带洗眼*传递窗 685*590*800 4 机械联锁900标本室空调机房微生物室微生物室5100缺陷二、档案管理缺陷二、档案管理仪器档案仪器档案（a）制造商名称、型号、序号或其它唯一性标识；制造商名称、型号、序号或其它唯一性标识；（b）仪器使用说明书或其复印件；仪器使用说明书或其复印件；（c）校准校准/检测的日期和结果以及下次校准和检测的日期和结果以及下次校准和/或检测的日期；或检测的日期；（d）迄今所进行的维护和今后维护计划的细节；迄今
10、所进行的维护和今后维护计划的细节；（e）损坏、故障、改装或修理的历史。损坏、故障、改装或修理的历史。人员档案人员档案实验室应保存其技术人员有关资格证书（如上岗证）、培训、实验室应保存其技术人员有关资格证书（如上岗证）、培训、技能和经历等技术档案。技能和经历等技术档案。缺陷三、记录缺陷三、记录内容内容形式形式保存保存缺陷四、质量控制缺陷四、质量控制SOP文件的现行有效性文件的现行有效性仪器的标志及维护保养仪器的标志及维护保养试剂及耗品的质检试剂及耗品的质检PCR检测流程检测流程 标本采集 核酸提取 基因扩增 产物检测 采集的方法 核酸的稳定性 保存 分离方法*效率 保存 效率 检测方法*测定的线
11、性*DNA、RNA的浓度和纯度测定及保存的浓度和纯度测定及保存 此法准确、快速，且不损坏样品。可测出浓度低于此法准确、快速，且不损坏样品。可测出浓度低于2.5ug/ml的核酸。测定时将样品作适度的稀释。用紫外的核酸。测定时将样品作适度的稀释。用紫外分光光度仪检测，记录分光光度仪检测，记录280nm和和260nm处的吸光度。处的吸光度。280nm为蛋白吸收峰，为蛋白吸收峰，260nm为核酸吸收峰。其中为核酸吸收峰。其中260nm处读数用来计算样品的核酸浓度。处读数用来计算样品的核酸浓度。1 0D/A260nm=50ug/ml双链DNA 1 0D/A260nm=33ug/ml单链DNA 1 0D/
12、A260nm=40ug/ml RNADNA总产量（ug）=OD(A260nm)50ug稀释倍数样品总体积稀释倍数样品总体积DNA浓度（ug/ml）=OD值值(A260nm)50稀释倍数稀释倍数提取RNA总产量（ug）=OD值值(A260nm)40ug稀释倍数样品总体积稀释倍数样品总体积RNA浓度（ug/ml）=OD值值(A260nm)40稀释倍数稀释倍数2、琼脂糖凝胶微型电泳法、琼脂糖凝胶微型电泳法 未知浓度的微量未知浓度的微量DNA片段可与已知浓度的片段可与已知浓度的DNA同时同时电泳，根据其结合的溴乙锭荧光强度其含量。电泳时各电泳，根据其结合的溴乙锭荧光强度其含量。电泳时各DNA的体积要准
13、，否则会有误差。的体积要准，否则会有误差。5、DNA、RNA的保存的保存 4是DNA保存的最佳和最简单的条件之一。-70可能是长期保存的良好温度。但解冻时DNA可产生缺口，因此不宜反复冻融。DNA在TE缓冲液中（10mmol/L Tris-Hcl，1mmol/L EDTA，PH 8.0），4储存6个月以上，其中EDTA还可抑制微生物生长。RNA容易降解，操作和储存中要防止RNA酶的污染。所用器皿高压灭菌后用，重蒸水配制或用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的蒸馏水溶解RNA，RNA溶液中加入RNA酶抑制剂（RNasin），终浓度为2U/10l，置-20保存备用。血清标志物用于血清标志物用于疾病诊断
14、、流行病调查疾病诊断、流行病调查 基因检测用于基因检测用于 疗效监控、预后判断疗效监控、预后判断 样 品 筛查检测筛查检测 筛查试剂 阳性反应 阴性反应 重复检测重复检测 原有试剂加另外一种筛查试剂 一阴一阳 均阴性反应 均阳性反应 送确认实验室进行确认 阴性报告 HIV抗体筛查试验流程图抗体筛查试验流程图 英国英国HBVHBV血清学诊断的血清学诊断的SOP(V.SOP6)SOP(V.SOP6)HBsAg AssayNegativeReaciveReport:HBsAg NegativeConfirmatory HBsAg test from clot accoring to assay an
15、d local protcal(eg neutralisation or second HBsAg)Negative ReactiveV.SOP7Repeat 1st assay from clot(if availble)Both tests Negative1st reactive2nd negativeAnti-HBc testReport HBsAg negativeAnti-HBc NegativeAnti-HBc ReactiveReport:HBsAg equivocalRequest furth sampleReport:Anti-HBc Reactive.Further te
16、st Anti-HBbc IgM,HBeAg/anti-HBe and request a further sample实验室检测抗-HCV程序抗抗-HCV EIA阴性阴性报告报告RR阳性阳性S/CO比值比值3.8或或报告报告报告报告报告报告报告报告报告报告我们如何选择合适的替代我们如何选择合适的替代终点以合理考评终点以合理考评疗效疗效?HBsAg消失-完全应答 HBV DNA清除或抑制-病毒学应答e血清转化 （HBeAg消失+抗HBe产生）-病毒学应答 ALT恢复正常-生化应答 肝脏组织学表现-组织学应答 还是联合应答？HBV DNA清除或抑制？清除或抑制？优点优点:HBV DNA抑制表示H
17、BV复制的抑制水平，与HBeAg消失和/或ALT恢复正常相关。缺点缺点:n 不可能完全清除,不能反映持续应答 n 抑制程度:105(AASLD guideline)还是104(AGA Panel recommendation*)?n 检测没有国际单位:无法采用标准化单位报告 结果（copies/mL、pg/mL、meq/mL、log drop）n 敏感性不同阻碍了对治疗效果的比较*Phair J NATURAL HISTORY,DIAGNOSTICS,AND CLINICALPROFILES OF PERSONS WITH CHRONIC HEPATITIS B核酸检测要点核酸检测要点灵敏度，
18、灵敏度，规定值，失控。规定值，失控。“即刻性即刻性”质质控：控：SI值表（即刻性质控）值表（即刻性质控）N 3 4 5 6 7 8 9 10 11 N(3s)1.15 1.49 1.75 1.94 2.10 2.22 2.32 2.41 2.48N(2s)1.15 1.46 1.67 1.82 1.94 2.03 2.11 2.18 2.23 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2.55 2.61 2.66 2.71 2.75 2.79 2.82 2.85 2.88 2.29 2.33 2.37 2.41 2.44 2.47 2.50 2.53 2.56 常用的质控规则常用的
19、质控规则1 12 2s s；一个质控结果超过一个质控结果超过X X2S2S，此为警告规则；此为警告规则；1 12.52.5s s；一个质控结果超过一个质控结果超过X X2.5S2.5S，提示存在随机误差；提示存在随机误差；1 13 3s s；一个质控结果超过一个质控结果超过X X3S3S，提示存在随机误差；提示存在随机误差；R R4s4s；同批两个结果之差超过同批两个结果之差超过4 4S S，即一个质控结果超过即一个质控结果超过X+2SX+2S，另一个结果超另一个结果超X-2SX-2S。提示存在随机提示存在随机误差；误差；2 22 2s s；两个连续质控结果同时超过两个连续质控结果同时超过X+
20、2SX+2S或或X-2SX-2S，提示存在系统误差；提示存在系统误差；4 41 1s s；一个质控品连续的四次测定结果都超过一个质控品连续的四次测定结果都超过X+1SX+1S或或X-1SX-1S，两个质控品连续两次测定都超过两个质控品连续两次测定都超过X+1SX+1S或或X-1SX-1S，提示存在系统误差；提示存在系统误差；7 7T T；七个连续的质控结果呈现出向上或向下的趋势，提示存在系统误差；七个连续的质控结果呈现出向上或向下的趋势，提示存在系统误差；1010 x x；十个连续的质控结果在平均数的一侧，提示存在系统误差。十个连续的质控结果在平均数的一侧，提示存在系统误差。质量审核型式检查（编号唯一性、项目完整性、书写完型式检查（编号唯一性、项目完整性、书写完整性）整性）仪器检查（状态、校准）仪器检查（状态、校准）试剂检查（效期）试剂检查（效期）质控检查（室内、室间）质控检查（室内、室间）异常值检查（及时与临床联系）异常值检查（及时与临床联系）
