1、第七章第七章 动物染色体工程动物染色体工程（Chromosome Engineering）动物染色体工程7 动物染色体工程 染色体工程：按设计、有计划地消减、添加或代换同种与异种染色体以及染色体内部部分遗传操作的技术。可用于：遗传等基础研究、多倍体育种、人工诱导雌雄核发育、性别控制等。动物染色体工程7.1 人工诱导多倍体人工诱导多倍体 多倍体：？植物多、动物少。多倍体的优点：生长快、成活率高、抗病能力强、经济效益高等。如美洲角蛙（4n）、银鲫（天然3n）。20世纪30年代以来，陆续人工诱导成功多倍体动物。现今已成为低等经济动物育种的主要技术，且社会和经济效益明显。动物染色体工程7.1.1 人工
2、诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法 原理：染色体加倍多倍体；3n抑制受精卵第二极体放出；4n 抑制第一次卵裂。（受精？极体？卵子？卵裂？）动物染色体工程7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法 1、生物学方法：杂交（特别是种间杂交，第二极体不排出）产生异源多倍体。雌草鱼（2n=48）雄三角鲂3n杂种（3n=72）；异育银鲫与兴国红鲤杂种受精卵融合复合四倍体。动物染色体工程7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法 2、物理学方法：温度休克、水静压、高盐高碱。（1）温度休克法：略高、低于致死温度（冷05，热30 ）处理阻止第二极体排除（或第二次减分
3、）3n或4n.廉价、易操作。冷水性鱼：热休克；温水性鱼：冷休克。动物染色体工程7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法（2）水静压法：65/2，35min，抑制第二极体排出或第一次卵裂。优点：成功率高（95100%）、处理时间短、受精卵损伤小、成活率高。缺点：设备成本高。动物染色体工程7.1.1 人工诱导多倍体动物的方法人工诱导多倍体动物的方法 3、化学方法：细胞松弛素B、秋水仙素类4n；麻醉剂（N2O、CHClF2、PEG）3n。缺点：化学品价贵、有毒性、发育成没价值的嵌合体、推广难。动物染色体工程7.1.2 多倍体倍性鉴定多倍体倍性鉴定 各处理后：有多倍体、二倍体、嵌合
4、体。直接和间接鉴定染色体倍性。1、核体积测量：多倍体核大于二倍体核。如鱼类红细胞核2n:3n:4n=1:1.5:1.74。2、蛋白质电泳：有差异，但要慎用。3、生化分析：如关东银鲫的3n：红细胞少、大，血红蛋白高，丙酮酸激酶高。染色体计数：直接但费时。动物染色体工程7.1.2 多倍体倍性鉴定多倍体倍性鉴定 5、DNA含量测定：流式细胞仪测定单细胞DNA含量、显微光密度测定DNA组织切片。动物染色体工程7.1.3 多倍体动物的应用多倍体动物的应用 1、生活和生长能力：低等动物种间杂种生长快，但成活率低。人工诱导的3n种间杂种多数成活率高，生长快。2、性腺发育与应用：3n不育，能耗下降，避免繁殖、
5、肉质下降、上市延迟，价格好，生长不停滞、不死亡、养殖成本下降，经济效益高。（4n与2n杂交获3n）3、其他经济形状：多倍体肉质美、耐低氧、抗病强、对光和声感觉迟钝。动物染色体工程7.2 人工诱导雌、雄核发育人工诱导雌、雄核发育 7.2.1 人工诱导雌核发育（gynogenesis）：雌核发育：核失活或消失的精子与正常卵子受精，胚胎发育仅由母体基因（卵子）控制个体发育现象。可自然发生和人工诱导。1、精子遗传物质的失活：（1）辐射：r射线（60Co、173Cs、）X射线：穿通力强、处理大体积的精子；染色体断裂；精子存活有影响；少量精子染色体片段可能有作用。动物染色体工程7.2.1 人工诱导雌核发育
6、 紫外线：穿透力低，但安全；胸腺嘧啶二聚化，可见光下可修补复活，处理效果不很好。（2）化学物质：甲苯胺蓝、乙烯尿素、二甲基硫酸等。（3）显微手术：除去受精卵的雄原核。动物染色体工程7.2.1 人工诱导雌核发育 2、二倍体化：（1）温度和压力：第二极体、卵裂。（2）化学制剂：？3、雌核发育的意义：（1）产生单性种群：同型雌配子的品种：全为雌性（XX）后代；异型雌配子的品种（x或y）：后代为雌性（xx）或雄性（yy）。（2）同源型二倍体克隆：选择育种；基础生物学研究。动物染色体工程7.2.2 人工诱导雄核发育人工诱导雄核发育 雄核发育（androgenesis）：？二倍体雄核生殖的个体生存率很低：
7、精子基因的纯合性、卵子的损伤、阻止第一次卵裂的损伤。意义：遗传学基础理论、育种应用、核质杂种、性别控制（yy雄性）动物染色体工程7.3 动物的性别控制动物的性别控制 意义：畜牧业、家禽、水产、蚕丝等。畜牧业：母畜经济价值高。奶牛、奶羊、母鸡等；雄性肉牛、绵羊、猪生长快，肉质美，价值高。动物染色体工程7.3.1 动物的性别决定动物的性别决定 1、遗传决定 雄性异配子型：XO、XY 雌性异配子型：ZO（昆虫）、ZW（鸟）雌性单倍性型：孤雌生殖（1n）雄体，受精（2n）雌体。膜翅目：蜜蜂、马蜂、蚂蚁。2、环境决定：无性染色体，雌雄同体分化出两种性器官。位置、内环境决定。外环竟决定：蛙：雌体为xx，雄
8、体为xy。蝌蚪在20时，雌雄各半；30 时全为雄体。动物染色体工程7.3.2 动物性别控制的途径与方法动物性别控制的途径与方法 1、分离X、Y精子：直接、经济。（1）X、Y精子的差异：X精子的 DNA含量多；X精子的头部较大；X精子重密度大；X精子膜负电荷较多；Y精子速度快；Y精子上有特异DNA。（2）精子分离：都不很成熟。离心法；免疫法（Y精子有H-Y抗原）；流式细胞分类器（DNA含量）。动物染色体工程7.3.2 动物性别控制的途径与方法动物性别控制的途径与方法 2、鉴定胚胎性别：核型分析（100%准）生化微量分析（X、Y相连的酶活力）免疫学方法（H-Y抗原与其单抗）分子生物学方法（Y染色体
9、的特异标记的DNA序列探针与胚胎细胞DNA杂交）动物染色体工程7.3 动物性别控制的途径与方法动物性别控制的途径与方法 3、控制发育条件：（1）温度：鳄鱼（无性染色体）：30时全为雌体；32时有雌雄体；34 以上全为雄体。（2）性激素：如鱼类，甲基睾丸酮使（遗传）雌体发育为雄体；雌二醇使（遗传）雄体发育为雌体。动物染色体工程7.3 动物性别控制的途径与方法动物性别控制的途径与方法 4、受精条件：（1）pH 动物阴道pH 影响X、Y精子的移动速度。pH偏酸时，Y精子的速度慢，X精子的速度快先达卵子而受精。如用凝胶pH剂人为改变动物阴道pH,可控制性别。（2）激素 在精液中加入生物组织（睾丸、胎盘
10、、脑垂体）制剂或激素，控制性别。5、性反转法：性激素；性激素+交配技术筛选（性反转的假雄性（XX）与雌体交配全为雌鱼）。6、雌、雄核发育。动物染色体工程7.4 动物染色体结构的改造动物染色体结构的改造 7.4.1 染色体片段的删除和重组 使动物携带特定染色体区片段的缺失突变，利于系统的基因定位和功能分析。1、放射线诱导染色体缺失突变：放射线处理ES细胞，使染色体产生缺失、易位、倒位、复制与基因内的点突变，再植入囊胚内，产生带突变的个体，进行功能的研究。已成为功能基因组学的研究热点。2、Cre 2 loxP介导染色体重组：Cre 2 loxP（源于cause recombination,重组酶）
11、介导两个loxP间（的序列删除）重组，导致染色体倒位、删除、易位，实现染色体的定点操作。动物染色体工程7.4.2 染色体的易位染色体的易位 1、雄性（ZZ）家蚕出丝率高于雌蚕(ZW)20%。2、辐射诱导发生第10号染色体向W染色体易位，产生两个易位品系：一个片段有基因w2,另一个有基因 w3。w2、w3为隐性基因，纯合体的卵为（淡）杏黄褐色，同时存在时为黑卵。3、两个品系互交：黑雄卵、杏（淡）黄卵雌卵。光电选卵机选雌卵孵化，降低成本。动物染色体工程7.5 人工染色体人工染色体 染色体的三个关键（基本）序列：自主复制序列（ARS）复制起点确保自我复制；端粒序列（TEL）端粒结束复制、确保独立和稳
12、定性；着丝粒序列（CEN）确保平均分配。人造微小染色体（artificial minichromosome）：染色体的三个关键序列拼接而成的小染色体。广泛应用于大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗、染色体结构与功能关系等方面。如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）、哺乳动物人工染色体动物染色体工程7.5.1 酵母人工染色体酵母人工染色体 1983年首次构建 YAC(含染色体三要素和外源DNA，55kb)；1987年构建并证明载体YAC：能克隆大片段人体DNA分子，可用于构建高等生物的完整基因组文库，载体容量提高10倍，达1051010bp。在人类基因组计划研
13、究中发挥了重要作用。动物染色体工程7.5.1 酵母人工染色体酵母人工染色体 1、大片段DNA的获取：提取染色体DNA、酶切、电泳、切割回收电泳条带。2、YAC重组体的构建：提取YAC质粒、酶解、获取YAC载体左右臂（带选择标记）、与大片段DNA连接YAC重组体。3、YAC重组体对酵母的转化：4、YAC基因库的鉴定：探针杂交、Southern转移 5、目的基因YAC克隆的筛选鉴定：PCR 6、目的基因YAC克隆的鉴定：探针目的基因某段序列。动物染色体工程7.5.2 细菌人工染色体 BAC载体：环状质粒。YAC（容量最大的）载体的缺点：插入的片段大，稳定性差；易缺失，文库不稳定；易重排，造成序列错误；文库中嵌合严重（两个、两个以上染色体的DNA），影响基因的分离和分析；难以从酵母中分离。BAC克服了YAC的缺点，广泛用于300bp以下的 DNA克隆。动物染色体工程7.5.3 人工染色体的应用人工染色体的应用 1、物理图谱和定位克隆 2、基因功能鉴定和转基因研究 3、染色体结构与功能关系研究 4、基因治疗 动物染色体工程7.6 结语结语 1、多倍体动物 2、动物雌雄核发育 3、动物性别控制 4、人工染色体动物染色体工程
