1、DNA的损伤和修复南华大学心血管疾病研究所动脉硬化学湖南省重点实验室1DNA 的损伤和修复的损伤和修复Mutagen(诱变剂）诱变剂）完全修复完全修复DNA 损伤损伤碱基的化学反应碱基的化学反应损伤的修复损伤的修复不能有效修复不能有效修复不完全修复不完全修复凋亡畸变回复正常2v诱发DNA损伤的因素：环境因素：辐射、化学毒物、药物、病毒感染、植物和微生物代谢产物等。生理因素：机体代谢过程中产生的有毒物质、DNA复制错配、DNA本身的热不稳定性。第一节 多种因素可引起DNA损伤并具有各自的机制3v（一）辐射致DNA损伤v根据作用原理的不同：电离辐射（粒子，粒子，射线，射线等）直接作用：能量直接传递
2、给大分子而引起结构的破坏 间接作用：辐射先作用于溶剂分子而产生活性物质从 而导致细胞损伤 非电离辐射（紫外线以及能量低于紫外线的电磁辐射）一、DNA损伤的因素及其机制4返回目录返回目录返回主页返回主页5 紫外线的致损伤作用紫外线的致损伤作用6（二）自由基致DNA损伤v自由基：指能够独立存在，核外带有未配对电子的原子和分子。v自由基的产生可以是外界因素与体内物质共同作用的结果。v自由基可导致碱基、核糖、磷酸基的损伤，引起DNA的结构和功能异常。7（三）化学毒物致DNA损伤v按其作用原理可分为：碱基类似物 碱基修饰物 嵌入染料81、碱基类似物（碱基类似物（Base analog）2-氨基嘌呤氨基嘌
3、呤2-Amino purine5-溴尿嘧啶溴尿嘧啶5-Bromine Uracil OO BrNH2是指与DNA正常碱基结构类似的化合物,在DNA复制时掺入并与互补链上碱基配对,从而引起碱基对的置换.95-BrU:G:A 烯醇式烯醇式enolenolBrOHHOBr 酮式酮式KetoKetoHOAGCTTCCTATCGAAGGATAGCTBCCTATCGAAGGAT酮式5-BrU的渗入AGCTBCCTATCGAAGGATAGCTCCCTATCGAGGGAT第二轮复制ATGC 转变转变AGCTBCCTATCGAGGGATAGCTTCCTATCGAAGGAT第一轮复制酮式到稀醇式的转变烯醇式渗入为
4、烯醇式渗入为 GCAT 转变转变10 2、碱基的化学修饰剂碱基的化学修饰剂又称化学突变剂：指对又称化学突变剂：指对DNADNA链中的碱基的修饰链中的碱基的修饰,改变其配对改变其配对性质性质,进而改变进而改变DNADNA结构的化合物结构的化合物.亚硝酸（亚硝酸（nitrous acid HNOnitrous acid HNO2 2）羟氨（羟氨（hydroxylamine HAhydroxylamine HA）甲磺酸乙酯（甲磺酸乙酯（ethyl mathanesulfonateethyl mathanesulfonate EMS EMS）N-N-甲基甲基-N-N-硝基硝基-N-N-亚硝基胍亚硝基胍
5、 （N-mathyl-N-nitro-N-nitrosoguanidionN-mathyl-N-nitro-N-nitrosoguanidion NNGNNG）11 （a）亚硝酸修饰G、C、A；（b）羟基修饰C；（c）甲基磺酸乙酯修饰T（引自Russell,1992）.123 3、嵌入染料对、嵌入染料对DNADNA的损伤作用的损伤作用吖啶橙吖啶橙 (Acridine(Acridine Orange Orange AO)扁平染料分子扁平染料分子溴化乙锭溴化乙锭 (Ethidium(Ethidium Bromide Bromide EB)-ATTTTTCG-TAAAAAGC-A TTTCG-T A
6、AAGC-TAO T-AT EB TTTTCG-TA分子插入分子插入AOEB-ATTTCG-TAAAGC-ATXTTTTCG-TAX AAAAGC-XAAAAGC-结果产生移框突变结果产生移框突变13二、DNA损伤的类型DNA分子中的碱基、核糖和磷酸二酯键等均是DNA损伤作用的靶点。常见的损伤有:碱基脱落、碱基破坏、嘧啶二聚体形成、单链和双链DNA断裂、DNA交联、DNA-蛋白质交联等。14（一）碱基和核糖的破坏v由于碱基或者核糖的损伤，在DNA链上形成不稳定位点，最终可导致DNA链的断裂。1516 DNA分子上的碱基错配称点突变(point mutation)。发生在同型碱基之间，即嘌呤代替
7、另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.转换发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。2.颠换（二）错配（二）错配17镰形红细胞贫血病人镰形红细胞贫血病人Hb(HbS)亚基亚基N-val his leu thr pro val glu C 肽链肽链CAC GTG基因基因正常成人正常成人Hb(HbA)亚基亚基N-val his leu thr pro glu glu C 肽链肽链CTC GAG基因基因18（三）DNA链断裂v磷酸二酯键的断裂和脱氧戊糖的破坏是引起DNA链断裂的直接原因。v碱基的破坏和脱落在DNA链上形成的不稳定位点是DNA链断裂的间接原因。v单链断裂（SSB）：一条链断裂的DNA双
8、股螺旋v双链断裂（DSB）：两条链于同一处或紧密相邻处同时断裂。19（四）DNA交联v链间交联：DNA双螺旋链上一条链上的碱基和另一条链上的碱基以共价键结合v链内交联：DNA分子中同一条链内的两个碱基以共价键结合vDNA蛋白质交联：DNA和蛋白质以共价键结合20第二节 DNA损伤的修复vDNA损伤的修复：指纠正错配的碱基，清除DNA链上的损伤，恢复DNA正常结构的过程。v常见的DNA修复方式：直接修复、切除修复、错配修复和重组修复21(一）直接修复v直接修复v 细胞对DNA的某些损伤可以用很简单的方式加以修复在单一基因产物的催化下，一步反应就可以完成。这种修复方式叫直接修复。包括：酶光学复活、
9、嘌呤的直接插入、O6甲基鸟嘌呤DNA甲基转移、单链断裂重接等。221）、酶学光复活（）、酶学光复活（photo reactivation）-TT-AA-PR PR-TT-AA-TT-AA-可见光激活可见光激活识别-TT-AA-释放23烷基化碱基可以直接修复24v2 2）嘌呤的直接插入v 嘌呤插入酶嘌呤插入酶v 受损嘌呤受损嘌呤APSAPS 插入嘌呤（糖苷键）插入嘌呤（糖苷键）嘌呤插入酶嘌呤插入酶K+25v3）DNA单链断裂重接v DNA单链断裂中有一部分是通过简单的重接而修复的，只需要一种酶DNA连接酶(ligase)参加，因此也属于直接修复。v DNA连接酶能催化DNA双螺旋结构中一条链缺口
10、处的5磷酸根与相邻的一个3羟基形成磷酸二酯健。连接所需的能量ATP(如动物细胞)。2627v将损伤的部位（或连同其附近的一定部位）切除，然后用正确配对的、完好的碱基替代修复。有多种酶和基因参与v过程：识别（损伤位点）切除修复（补）连接酶和蛋白质酶和蛋白质 DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA连接酶连接酶(二)、切除修复按照产物的不同可以分：碱基切除修复、核苷酸切除修复28v1)碱基切除：v 特点是切除受损伤的碱基。主要过程是水解受损伤的碱基与脱氧核糖磷酸链之间的N糖苷键。反应由一类糖基化酶催化。v也即：糖基化酶APS内、外切酶去除残基以对侧链为模板修补DNA连接酶连接v整个修复过程可分以下几步
11、。29303132vEcoli的核苷酸切除修复机理。v在Ecoli中，UvrA，UvrB，UvrC三种蛋白必须同时存在才能发挥作用，所以也叫UvrABC切除核酸酶。vUvrA是一种腺苷三磷酸酶，是损伤识别蛋白。它与UvrB 结合成A2B1复合物，结合在损伤区，使DNA解旋、扭曲，并引起UvrB构象改变，与损伤部位形成紧密的结合。v然后UvrA与UvrBDNA复合物解离，后者成为UvrC特异结合靶。UvrB 在损伤的3侧作一内切，随而复合物构象改变，UvrC 得以在5侧作第二个切口。v解旋酶(UvrD)使寡聚核苷酸片段及UvrC从DNA链上释放，然后DNA聚合酶取代UvrB。修补缺损区；最后由连
12、接酶连接补片。2）.核苷酸切除333435v当DNA双链发生严重损伤时需要另一种机理来完成正确的修复。v一种情况是两条链同时受到损伤；另一种情况是单链损伤尚未修复时发生了复制，造成对应于损伤位置的新链缺乏正确模板；此时需要重组酶系将另一段未受损伤的双链DNA移到损伤位置附近，提供正确的模板，进行重组。这便是重组修复。（三）重组修复36 重组修复重组修复 (链转移修复链转移修复)复制后修复复制后修复 容易出错容易出错 RecA,DNApolymerae ligase二聚体后起始二聚体后起始 RecA 聚合酶、连接酶聚合酶、连接酶重组修复后的损伤位点可重组修复后的损伤位点可由其它机制进一步修复由其
13、它机制进一步修复37DNA mismatch+-A-C-DNApol(=10-8)经第二次校正经第二次校正=10-11错配修复错配修复系统系统(MRSMismatch RepairSystem)错配修复错配修复:碱基切除修复的一种特殊形式碱基切除修复的一种特殊形式.使复制的保真性提高使复制的保真性提高102103倍倍（四）、错配修复38错配修复系统（错配修复系统（Mismatch repair system）DNA polymeraseHelicase SSB 外切核酸酶外切核酸酶(和和)连接酶连接酶MCE(mismatch correct enzyme)3 subunits mutH,L,S
14、 扫描新生链中错配碱基扫描新生链中错配碱基识别新生链中非识别新生链中非 m6A 的的GATC序列序列酶切含错配碱基的新生酶切含错配碱基的新生DNA区段区段（1 1）组成）组成39 DNADNA合成过程中的甲基化变化合成过程中的甲基化变化DNA中的中的GATC(palindromic seq.)为为m6A甲基化敏感位点甲基化敏感位点平均每平均每2kb左右有一左右有一GATC seq.错配修复系统受甲基化的引导错配修复系统受甲基化的引导40 甲基化程度的差异甲基化程度的差异a、MutH/MutS 扫描识别错配扫描识别错配 碱基和邻近的碱基和邻近的GATC序列序列 切点甲基化切点甲基化GATC中中
15、G的的5侧侧 DNA helicase II,SSB,exonuclease I去除包括错去除包括错 配碱基的片段配碱基的片段 DNA polymerase III 和和 DNA ligase 填充缺口填充缺口昂贵的代价用于保证昂贵的代价用于保证DNADNA的准确性的准确性（2 2）修复过程修复过程 41（五）（五）.易错修复（易错修复（SOSSOS修复修复 SOS repairSOS repair）“SOS”是国际上通用的紧急呼救信号。SOS修复是指DNA受到严重损伤、细胞处于危急状态时所诱导的一种DNA修复方式，修复结果只是能维持基因组的完整性，提高细胞的生成率，但留下的错误较多，故又称为
16、错误倾向修复(errorprone repair)，使细胞有较高的突变率。此系统由十几个修复蛋白组成。调控蛋白LexA参与此系统的启动。42（2）SOS 修复机制修复机制 SOS 修复无模板指导的修复无模板指导的DNA复制复制 大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生大剂量的紫外线照射，大量的二聚体产生 SOS系统诱导，错误潜伏的复系统诱导，错误潜伏的复制超越二聚体而进行制超越二聚体而进行错误碱基错误碱基43 SOS 修复只是修复只是SOS反应的一部分反应的一部分 RecA在在SOS反应反应反应中起核心作用反应中起核心作用 RecA与与LexA组成组成调控环路调控环路DNA 损伤损伤 SOS Re
17、cA RecA受受LexALexA的的部分抑制部分抑制44RecA-P;三种功能三种功能a、DNA 重组活性重组活性b、与与S.S.DNA结合活性结合活性c、少数蛋白的少数蛋白的proteinase活性活性当当DNA正常复制时正常复制时（无复制受阻，无（无复制受阻，无DNA损伤，损伤，无无TT dimer）RecA-p不表现不表现proteinase活性活性45当当DNA复制受阻复制受阻/DNA damaged细胞内原少量表达的细胞内原少量表达的RecA-p与与S.S,DNA结合结合激活激活RecA-p的的proteinase活性活性修复损伤修复损伤LexA-p降解降解RecA-p高效表达高效
18、表达 SOS open46当当DNA复制度过难关后复制度过难关后SOS repair 是一种错误倾向性极强的修复机制是一种错误倾向性极强的修复机制是进化中形成的是进化中形成的“竭尽全力，治病救人竭尽全力，治病救人”的措施的措施（正常状态下，（正常状态下，SOS是关闭的）是关闭的）RecA-p很快消失很快消失LexA gene onSOS off47二、参与DNA修复的主要基因vDNA修复相关基因：直接参与DNA修复的基因 DNA修复调控相关的基因48第三节 生物标记物可作为DNA损伤和修复的参考标记v1.甲基化损伤修复相关基因的突变可作为甲基化损伤的基因型标记物。MGMT突变可以作为甲基化损伤
19、的基因型标记物。v2.切除修复相关的酶和基因可作为切除修复的生物标记物。大肠杆菌Uvr基因家族，人ecrr基因。v3.错配修复相关基因可作为检测错配修复功能的标记物。v4.DNA聚合物突变可以为碱基切除修复功能缺陷的标记物。该酶的突变导致碱基切除修复功能的缺陷。49v5.Ku蛋白和Rad52蛋白缺陷可作为重组修复缺陷的标记物。v6.微生物DNA损伤修复也有相应的生物标记物。如RecA蛋白。v7.特异的代谢酶和代谢产物也可作为生物标记物，如细胞色素P450。v8.DNA加和物也可作为修复功能的生物标记物。50返回目录返回目录返回主页返回主页51返回目录返回目录返回主页返回主页52返回目录返回目录返回主页返回主页下一页下一页53
