1、PCRPCR反应的模板反应的模板重组质粒重组质粒DNA基因组基因组DNARNA菌落菌落图图 1 口腔腺中提取的口腔腺中提取的RNAM:DL2000 marker;1:5 L RNA;2:10 L RNA;3:15 L RNA.M 1 2 328S18S5S2022-10-234第七章 PCR技术及其应用一、一、PCR技术原理技术原理二、二、PCR技术的主要类型技术的主要类型三、三、PCR技术应用技术应用2022-10-235PCR技术简史技术简史DNADNA的复制的复制DNADNA变性与复性变性与复性聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5
2、53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3 35解链酶DNADNA解旋解链解旋解链合成引物合成引物子链延长子链延长一、一、PCR技术原理技术原理2022-10-236PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNARNA引物引物RNARNA引物引物2022-10-237PCR技术简史DNADNA的复制的复制DNADNA变性与复性变性与复性聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明A
3、TCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNADNA解旋解链解旋解链合成引物合成引物子链延长子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGACCTACC3DNADNA聚合酶聚合酶DNADNA聚合酶聚合酶2022-10-238PCRPCR技术简史技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链式反应的发明2022-10-239PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明n1971年，年，Khorana提出：经过提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用
4、变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆复该过程便可克隆tRNA基因。基因。n但由于测序和引物合成的困难，但由于测序和引物合成的困难，以及以及70年代基因工程技术的发明年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，使克隆基因成为可能，所以，Khorana设想被人们遗忘了设想被人们遗忘了2022-10-2310PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明n1985年，美国年，美国PE-Cetus公司的公司的Mullis等人发明了聚合酶链式反应。等人发明了聚合酶链式反应。n基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细
5、胞内的DNA复制。复制。n最初采用最初采用E-coli DNA聚合酶进行聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错。程耗时，费力，且易出错。n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶的应用使得的应用使得PCR能能高效率的进行高效率的进行2022-10-2311DNA polermases for PCR:Thermus aquaticus古细菌古细菌-水生栖热菌水生栖热菌最适生长温度最适生长温度70，具有，具有5 3聚合酶活性和聚合酶活性和5 3外切酶活性外切酶活性2022-10-2312()40 50 60 70 80 90 100100 80 60 40
6、202022-10-2313引物引物引物引物2022-10-23142022-10-2315PCR技术简史DNA的复制DNA变性与复性聚合酶链反应的发明n耐热耐热DNA聚合酶聚合酶的应用使得的应用使得PCR能能高效率的进行，随后高效率的进行，随后PE-Cetus公司推公司推出了第一台出了第一台PCR自动化热循环仪自动化热循环仪PCR的基本原理类似于类似于DNADNA的体内复制。首先待扩增的体内复制。首先待扩增DNADNA模板加模板加热热变性变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火退火，再
7、将温度升高使退火引物在再将温度升高使退火引物在DNADNA聚合酶作用下得聚合酶作用下得以以延伸延伸。这种热变性。这种热变性-复性复性-延伸的过程就是一延伸的过程就是一个个PCRPCR循环，循环，PCRPCR就是在合适条件下的这种循环就是在合适条件下的这种循环的不断重复。的不断重复。2022-10-23162022-10-2317PCR Cycle-Step 1-Denaturation Template DNA by Heat(95)2022-10-2318Target SequenceTarget SequencePCRPCR原理示意图原理示意图模板模板DNA的变性：模板的变性：模板DNA经
8、加热至经加热至93-95左右一定时间左右一定时间后后,使模板使模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解离解离,使之使之成为单链成为单链,以便它与引物结合以便它与引物结合,为下轮反应作准备；为下轮反应作准备；PCR Cycle-Step 2 Temperature is lowered(Tm)and primers anneal to target sequences2022-10-2319Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火(复性复性)：模板：模板DN
9、ADNA经加热变性成单链后经加热变性成单链后,温度降至温度降至5555左右左右,引物与模板引物与模板DNADNA单链的互补序列配对结合；单链的互补序列配对结合；PCR Cycle-Step 3-At 72 Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated2022-10-2320Target SequenceTarget SequencePrimer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase引物的延伸：引物的延伸：DNADNA模板模板-
10、引物结引物结合物在合物在TaqDNATaqDNA聚聚合酶的作用下，合酶的作用下，以以dNTPdNTP为反应原为反应原料，靶序列为模料，靶序列为模板，按碱基配对板，按碱基配对与半保留复制原与半保留复制原理，合成一条新理，合成一条新的与模板的与模板DNA DNA 链。链。End of the 1st PCR Cycle Results in two copies of target sequence2022-10-2321Target SequenceTarget Sequence每完成一个循环每完成一个循环需需2 24 4分钟，分钟，2 23 3小时就能将小时就能将待扩目的基因扩待扩目的基因扩增
11、放大几百万倍。增放大几百万倍。2022-10-2322被扩增的被扩增的DNADNA片段片段模板模板 DNA DNA 变性变性引物与模板退火引物与模板退火引物延伸引物延伸模板模板DNADNA变性变性引物与模板退火引物与模板退火引物延伸引物延伸引物延伸引物延伸循环循环1 1循环循环2 2循环循环3 3模板模板 DNA DNA 变性变性引物与模板退火引物与模板退火2 21 12 22 22 24 42 23 38 82525次循环后，被扩增的次循环后，被扩增的DNADNA片片段的拷贝数为段的拷贝数为 2 225 25 附图附图Target AmplificationTarget Amplificat
12、ion2022-10-2323No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle=2 Amplicon2 cycle=4 Amplicon3 cycle=8 Amplicon4 cycle=16 Amplicon5 cycle=32 Amplicon6 cycle=64 Amplicon7 cycle=128 Amplicon2022-10-2324PCR反应体系反应体系缓冲溶液缓冲溶液(Mg2+是是DNA聚合酶的激活剂聚合酶的激活剂)耐热耐热DNA聚合酶聚合酶脱氧核糖三
13、磷酸核苷酸脱氧核糖三磷酸核苷酸(dNTPs)模板模板DNA或或cDNA上游引物、下游引物上游引物、下游引物2022-10-2325（1）PCR反应缓冲液反应缓冲液Mg2+是是DNA聚合酶的激活剂。聚合酶的激活剂。1.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。反应体系。Mg2+浓度过低会使浓度过低会使Taq酶活性丧失、酶活性丧失、PCR产量产量下降；下降；Mg2+过高影响反应特异性。过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。浓度。2022-10-2326（2）Taq D
14、NA聚合酶（聚合酶（thermus aquaticus)0.5-5 U/100 L 酶量增加使反应特异性下降酶量增加使反应特异性下降;酶量过少影响反应产量。酶量过少影响反应产量。2022-10-2327（3）dNTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度浓度取决于扩增片段的长度 四种四种dNTP浓度应相等浓度应相等,一般为一般为50-200 mol/L 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量降低反应产量 dNTP可与可与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度下降，浓度下降，影响影响DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。2022-10-23
15、28（4）模板）模板 单、双链单、双链DNA均可。均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制聚合酶抑制剂、剂、DNA结合蛋白类。结合蛋白类。一般一般100ng DNA模板模板/100 L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。2022-10-2329（5）引物浓度）引物浓度 0.1-1 mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性反应特异性下降。下降。PCR引物的设计一般原则引物的设计一般原则引物长度一般以引物长度一般以1530bp为宜为宜,过短则降低特异过短则降低特异性，过长则会引起引物间退
16、火而影响有效扩增。性，过长则会引起引物间退火而影响有效扩增。避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。G/C和和A/T碱基均匀分布，碱基均匀分布，G/C含量在含量在4555%之之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。免出现嘌呤或嘧啶连续排列。2022-10-2330要避免两个引物间特别是要避免两个引物间特别是3末端碱基序列互补以末端碱基序列互补以及同一引物自身及同一引物自身3末端碱基序列互补的，使它们末
17、端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。不能形成引物二聚体或发卡结构。引物引物3末端碱基一般应与模板末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并严格配对，并且且3末端为末端为G、C或或T时引物效率较高。时引物效率较高。引物引物5末端碱基可不与模板末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与匹配，可添加与模板无关的序列模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序如限制性核酸内切酶的识别序列、列、ATG起始密码子或启动子序列等起始密码子或启动子序列等)，便于克，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。引物的碱基顺序不能与非
18、扩增区有同源性。2022-10-23312022-10-2332例例 1.引物的引物的 3 末端形成杂交末端形成杂交 5 GGCTATACCGATTCGAATCA 3 3 ACTAAGCTTAGCCATATCGG 5例例 2.引物的引物的 5 末端形成杂交末端形成杂交 5 ATCGATCGATGGCATGGTAT 3 3 TATGGTACGGTAGCTAGCTA 5例例 3.引物的中间部分形成杂交引物的中间部分形成杂交 5 AACGAGCTTCGAAGGCTAA 3 3 AACGAGCTTCGATGGCTAA 5例例 4.5 CCAGAGGGAGAACTCCCTCGC 3引物设计软件：引物设计
19、软件：Primer 5,Oligo6目的基因上游引物设计目的基因上游引物设计目的基因下游引物设计目的基因下游引物设计2022-10-2341PCR一般循环参数一般循环参数(1)(1)变性变性 使双链使双链DNADNA解链为单链解链为单链,95,95 3 35 5分钟分钟(2)(2)退火退火 温度由引物长度和温度由引物长度和GC含量决定含量决定,适宜的退火温度大适宜的退火温度大约低于引物约低于引物Tm值值45-55，介于，介于45-55。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低降低温度可增加反应的灵敏性。温度可增加反应的灵敏性。Tm值值就是就是DNA熔解
20、温度，指把熔解温度，指把DNA的双螺旋结构降解一半时的温度。的双螺旋结构降解一半时的温度。Tm（）（）（）（）2022-10-2342（3 3）延伸）延伸 7272，延伸时间由扩增片段长度决定，延伸时间由扩增片段长度决定（4 4）循环次数）循环次数 主要取决于模版主要取决于模版DNADNA的浓度的浓度 一般为一般为25-3525-35次次 次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加标准的标准的PCR反应条件：反应条件：10缓冲液缓冲液 10 L4种种dNTP混合物混合物 各各200umol/L引物引物 各各10100pmol模板模板DNA 0.12gTaq DNA
21、聚合酶聚合酶 2.5UMg 2+1.5mmol/L2022-10-23432022-10-2344PCR仪仪2022-10-2345模板DNA95PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022-10-234650引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022-10-2347引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022-10-234872第1轮结束第2轮开始PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022-10-2349955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR
22、反应条件PCR过程PCR的特点2022-10-235072第2轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点2022-10-2351重复30轮后230=1,073,741,824模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增理想拷贝数=2n n 循环次数实际拷贝数=(1+x)n X 平均效率,约为0.85 n 循环次数 附图PCR反应注意的事项反应注意的事项（一）防止污染（一）防止污染试剂小量分装试剂小量分装吸头及吸头及EPEP管一次性使用管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作器皿及工作区域要分开，无菌操作（二）设立对照二）设立对照：阳性对照：阳性对照：
23、阳性模板阳性模板阴性对照：阴性对照：阴性模板阴性模板试剂对照：试剂对照：除模板外的所有组分除模板外的所有组分2022-10-2352PCR反应的特点反应的特点灵敏度高灵敏度高1.1.皮克皮克(pg=10(pg=10-12-12)量级扩增到微克量级扩增到微克(ugug=10=10-6-6)水平水平2.2.能从能从100100万个细胞中检出一个靶细胞万个细胞中检出一个靶细胞3.3.病毒检测的灵敏度可达病毒检测的灵敏度可达3 3个个RFURFU（空斑形成单位）（空斑形成单位）4.4.细菌检测的最小检出率为细菌检测的最小检出率为3 3个细菌个细菌简便、快速简便、快速1.1.一次性加好反应液，一次性加好
24、反应液，2 24 h4 h完成扩增完成扩增2.2.扩增产物一般用电泳分析扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提的粗提DNADNA2022-10-2353空斑形成单位又称蚀斑形成单位，是计量病毒（或噬菌体空斑形成单位又称蚀斑形成单位，是计量病毒（或噬菌体）的一种单位，但只限于用在有产生空斑能力的病毒。其）的一种单位，但只限于用在有产生空斑能力的病毒。其原理是：用少量有破坏宿主细胞能力的病毒去感染已形成原理是：用少量有破坏宿主细胞能力的病毒去感染已形成致密单层状态的宿主细胞群体时
25、，经过一定培养时间使每致密单层状态的宿主细胞群体时，经过一定培养时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染崩溃，形成肉眼可见的空个感染细胞周围的细胞逐渐感染崩溃，形成肉眼可见的空斑（噬菌体时可直接观察，病毒时则需借助于活体染色的斑（噬菌体时可直接观察，病毒时则需借助于活体染色的方法）。在理论上，一个病毒体就可以形成一个空斑，但方法）。在理论上，一个病毒体就可以形成一个空斑，但实际上有不同程度误差，因此不能准确的与其他计量单位实际上有不同程度误差，因此不能准确的与其他计量单位互换。用互换。用PFUPFU计量病毒的方法叫作计量病毒的方法叫作PFUPFU法。法。1、反转录、反转录PCR(RT-PCR)2、
26、反向、反向PCR 3、复合、复合PCR 4、不对称、不对称PCR 5、嵌套、嵌套PCR6、3Full RACE7、5Full RACE8、实时定量、实时定量PCR2022-10-2355二、二、PCR技术的主要类型技术的主要类型 1、反转录、反转录PCR(RT-PCR)是指以是指以mRNA在反转录酶作用下合成在反转录酶作用下合成cDNA第一链为模板进行的第一链为模板进行的PCR。用于测定基因表达的强度和鉴定已转录用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变序列是否发生突变,呈现呈现mRNA多态性多态性,克隆克隆mRNA的的5和和3末端序列末端序列,以及从非常少量以及从非常少量的的mRNA
27、样品构建大容量的样品构建大容量的cDNA文库。文库。2022-10-23562022-10-2357反转录酶具有依赖于反转录酶具有依赖于RNA的的DNA聚合酶活性和聚合酶活性和RNA酶酶H活性，活性，AMV(42)和和MMLV（37）。）。双向外切双向外切DNA-RNADNA-RNA杂合链中的杂合链中的RNARNA链链2022-10-23582022-10-235953AAAAA535335533553RT-PCR 原理原理mRNA1st cDNA反反转录酶、转录酶、下游引物、下游引物、dNTPsTaq DNA聚合酶聚合酶、上游及下游引物、上游及下游引物、dNTPs5533特异特异 PCR 产
28、物产物5533经经 30 个循环，产生个循环，产生 230 个分子拷贝个分子拷贝55332022-10-2360MLV RT催化催化的的 cDNA合成合成RT-PCR引物选择2022-10-23632、反向反向PCR(reverse PCR)是用反向引物对某个已知是用反向引物对某个已知DNA片段两侧未知片段两侧未知序列进行的序列进行的PCR。可对未知序列扩增后进行分析可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接如探索邻接已知已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的片段的序列；用于仅知部分序列的全长全长cDNA的克隆的克隆,扩增基因文库的插入扩增基因文库的插入DNA。已知序列已知序列未知序列未知序列未
29、知序列未知序列2022-10-2364已知序列已知序列未知序列未知序列未知序列未知序列限制酶限制酶限制酶限制酶连接酶连接酶2022-10-23653、复合、复合PCR(或称多重或称多重PCR)在一个反应体系加入多对不同的在一个反应体系加入多对不同的PCRPCR引物同时扩增，引物同时扩增，获得多个获得多个PCRPCR产物，这种产物，这种PCRPCR称为复合称为复合PCRPCR。用于检测。用于检测特定基因序列的存在或缺失。特定基因序列的存在或缺失。电电泳泳2022-10-23664、不对称、不对称PCR 是指用不等量的一对引物产生大量单链是指用不等量的一对引物产生大量单链DNA的的PCR。方法：采
30、用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是其最佳比例一般是0.01 0.5M,关键是关键是限制性引物的绝对量。限制性引物的绝对量。用途：用途：制备核酸序列测定的模板制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针制备杂交探针 基因组基因组DNA结构功能的研究结构功能的研究2022-10-2367 高浓度引物低浓度引物5、嵌套、嵌套PCR(或称巢式或称巢式PCR)u是指先后用两套引物进行扩增的是指先后用两套引物进行扩增的PCRPCR。u用第一套引物扩增用第一套引物扩增15153030个循环；个循环；u再用扩增再用扩增
31、DNADNA片段内设定的第二套引物扩增片段内设定的第二套引物扩增15153030个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增。个循环，这样可使待扩增序列得到高效扩增。2022-10-23686 6、3Full RACE3Full RACE7、5Full RACE5-flanking region of chicken ovalbumin gene 8、实时荧光定量、实时荧光定量PCR(real-time PCR):美国美国PE（Perkin Elmer）公司）公司2019年研制出年研制出来的一种新的核酸定量技术。来的一种新的核酸定量技术。通过特定设计的通过特定设计的PCR仪器检测仪器检测PCR扩增过
32、程扩增过程每一轮循环产物标记的荧光信号累积数量，每一轮循环产物标记的荧光信号累积数量，从而进行实时监测整个从而进行实时监测整个PCR进程，最后通过进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析标准曲线对未知模板进行定量分析,称为实时称为实时荧光定量荧光定量PCR。以参照物为标准，对以参照物为标准，对PCR终产终产物进行分析或对物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。2022-10-2376（1）SYBR Green I 检测模式检测模式通过通过PCRPCR反应生成双链反应生成双链DNADNA，SY
33、BR Green ISYBR Green I与双链与双链DNADNA结合发出荧光，通过检测结合发出荧光，通过检测PCRPCR反应液中的荧光信号强度反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的增的目的DNADNA片段的融解温度。片段的融解温度。SYBR Green I SYBR Green I 的优点：的优点：SYBR Green I SYBR Green I 的优点是因为的优点是因为其缺点产生，由于它能所有的双链其缺点产生，由于它能所有的双链 DNADNA相结合，所以相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针
34、，通用性对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因较好，并且价格相对较低。这对科研是很有利的，因此国内外在科研中使用比较普遍。此国内外在科研中使用比较普遍。2022-10-2379（2）水解探针模式（水解探针模式（Taqman探针）探针）发射基团发射基团荧光淬灭基团荧光淬灭基团53该探针可与扩增序列内的该探针可与扩增序列内的DNA模板发生特异性杂交模板发生特异性杂交,探针探针的的5端标以荧光发射基团端标以荧光发射基团,靠近靠近3端标以荧光淬灭基团端标以荧光淬灭基团,探探针针3端被磷酸化端被磷酸化以防止探针在以防止探针在PCR扩增过程中被延伸。扩
35、增过程中被延伸。2022-10-23802022-10-2381工作原理是工作原理是利用利用Taq酶的酶的53外切酶活性。外切酶活性。在在PCR反应系统中加入一个荧光标记探针，它与引反应系统中加入一个荧光标记探针，它与引物包含序列内的物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交。模板发生特异性杂交。探针的探针的5端标记荧光发射基团端标记荧光发射基团(荧光发射峰值在荧光发射峰值在518nm处处)，3端标记荧光淬灭基团端标记荧光淬灭基团(荧光发射峰值荧光发射峰值在在582nm处处)且被磷酸化，以防止探针且被磷酸化，以防止探针3端在端在PCR扩扩增过程中被延伸。增过程中被延伸。2022-10-2382当探
36、针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光当探针保持完整时，淬灭基团抑制发射基团的荧光发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作发射。发射基团一旦与淬灭基团发生分离，抑制作用被解除，用被解除，518nm处的光密度增加而被荧光探测系处的光密度增加而被荧光探测系统检测到。统检测到。复性期探针与模板复性期探针与模板DNA发生杂交，延伸期发生杂交，延伸期Taq酶随酶随引物延伸沿引物延伸沿DNA模板移动，当模板移动，当Taq酶移动到探针切酶移动到探针切断断,淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。淬灭作用被解除，荧光信号释放出来。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴随一个模板每复制一次，就有一个探针被切断，
37、伴随一个荧光信号的释放。由于荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模因此用该技术可对模板进行准确定量。板进行准确定量。2022-10-2383Lymphocyte IntestineKidneyHeartGill020406080Relative ExpressionTissues Control Lps ConA实时定量实时定量PCRPCR法检测法检测Lj-HMGB2Lj-HMGB2基因在各组织中含量基因在各组织中含量2022-10-2385三、三、PCRPCR技术应用技术应用1.基础研究基础研究基
38、因或基因或 cDNA 克隆：从基因数据库中获得某一基因克隆：从基因数据库中获得某一基因或或 cDNA 核苷酸序列核苷酸序列,用用 PCR 方法扩增并克隆该基因方法扩增并克隆该基因或或 cDNA。基因表达：用基因表达：用 RT-PCRRT-PCR检测某一特定基因在转录水平检测某一特定基因在转录水平的表达。的表达。2.医学医学感染性疾病病原体的诊断：感染性疾病病原体的诊断：HIV、结核杆菌、乙肝结核杆菌、乙肝病毒等。病毒等。遗传病相关基因检测：镰刀型细胞贫血、血友病。遗传病相关基因检测：镰刀型细胞贫血、血友病。恶性肿瘤的诊断恶性肿瘤的诊断。2022-10-23863.法医学中的基因和亲子鉴定法医学
39、中的基因和亲子鉴定DNA 指纹图谱指纹图谱 19841984年英国莱斯特大学的遗传学家年英国莱斯特大学的遗传学家JefferysJefferys及其合及其合作者首次将分离的人源作者首次将分离的人源小卫星小卫星DNADNA用作基因探针，同用作基因探针，同人体核人体核DNADNA的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为极少有两个人完全相同，故称为DNADNA指纹指纹，意思是，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。它同人的指纹一样是每个人所特有的。AA
40、TG7 repeats8 repeatsAATGAATG引物引物引物引物引物引物引物引物简单序列重复简单序列重复(SSR)实验方法实验方法 现场现场 嫌疑人嫌疑人1 嫌疑人嫌疑人2 嫌疑人嫌疑人3法医鉴定法医鉴定案例一案例一亲子鉴定亲子鉴定案例二案例二4.考古学中生物种类间的亲缘关系、进化途径判定考古学中生物种类间的亲缘关系、进化途径判定5.基因动、植物的检测基因动、植物的检测转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。转基因动物的检测：检测某一基因的遗传稳定性。转基因植物的检测：玉米、大豆等。转基因植物的检测：玉米、大豆等。Human HMGB1 P09429 Mouse HMGB1 P63
41、158 Chick HMGB1 Q9PUK9 Frog HMGB1 Q7SZ42 Human HMGB2 P26583 Mouse HMGB2 P30681 Chick HMGB2 P26584 Frog HMGB2 Q32NS7 Human HMGB3 O15347 Mouse HMGB3 O54879 Chick HMGB3 P40618 Frog HMGB3 O54879 Lj HMGB1 HQ615991 Amphi HMG1/2 Q6PUE4 Sea urchin HMG1 P406449981999998979989889492560.000.050.100.150.200.250
42、.300.35物种进化图物种进化图2022-10-23941 1、要求将下面基因片段克隆至表达载体要求将下面基因片段克隆至表达载体pET-28apET-28a相应位点上，并获得此基因的表达。相应位点上，并获得此基因的表达。ATG GGT CGG CAT GCT GAT ACA GAT AAT AAT TTC TCA AAG GAATG GGT CGG CAT GCT GAT ACA GAT AAT AAT TTC TCA AAG GAC CAT GGC CAT GGT TGG TAT TTA GCT T TGG TAT TTA GCT TAT TCT ATA CCT GAC ACA GGG G
43、AA TCA CAA ATA AGA AAA TTT TCA GCA TTA GCT AGA TAT TAT TCT ATA CCT GAC ACA GGG GAA TCA CAA ATA AGA AAA TTT TCA GCA TTA GCT AGA TAT GAA TGG CAA AGA GGA AAC TAT AAA CAA GCT ACA TTC TAT CTT GGA GAG GCT ATG CAC TAT GAA TGG CAA AGA GGA AAC TAT AAA CAA GCT ACA TTC TAT CTT GGA GAG GCT ATG CAC TAT TTT GGA G
44、AT ATA GAT ACT CCA TAT CAT C TTT GGA GAT ATA GAT ACT CCA TAT CAT CAA GCT TAA GCT TAT GTT ACT GCC GTT GAT AGC GCA GGAAT GTT ACT GCC GTT GAT AGC GCA GGA CAT GTT AAG TTT GAG ACT TTT GCA GAG GAA AGA AAA GAA CAG TAT AAA ATA AAC ACA GCA CAT GTT AAG TTT GAG ACT TTT GCA GAG GAA AGA AAA GAA CAG TAT AAA ATA A
45、AC ACA GCA GGT TGC AAA ACT AAT GAG GCT TTT TAT ACT GAT ATC TTA AAA AAC AAA GAT TTT AAT GCA GGT TGC AAA ACT AAT GAG GCT TTT TAT ACT GAT ATC TTA AAA AAC AAA GAT TTT AAT GCA TGG TCA AAA GAA TAT GCA AGA GGT TTT GCT AAA ACA GGA AAA TCA ATA TAC TAT AGT TAA TGG TCA AAA GAA TAT GCA AGA GGT TTT GCT AAA ACA G
46、GA AAA TCA ATA TAC TAT AGT TAA 2 2、限制性核酸内切酶识别的碱基序列如下：、限制性核酸内切酶识别的碱基序列如下：BamHI:GGATCC,EcoRI:GAATTC,NcoI:CCATGG,HindIII:AAGCTTBamHI:GGATCC,EcoRI:GAATTC,NcoI:CCATGG,HindIII:AAGCTT3 3、保护性碱基情况：、保护性碱基情况：BamHI:CGCGGATCCGCG,EcoRI:CCGGAATTCCGG,NcoI:CATGCCATGGCATG,HindIII:CCCAAGCTTGGGBamHI:CGCGGATCCGCG,EcoRI:
47、CCGGAATTCCGG,NcoI:CATGCCATGGCATG,HindIII:CCCAAGCTTGGG回答如下问题：回答如下问题：1、设计、设计1对对PCR引物，写出引物，写出F和和R 的引物序列，并简述的引物序列，并简述PCR引物设计的基本原则。引物设计的基本原则。2、如果用琼脂糖凝胶电泳检测、如果用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，应该用多大浓度的琼脂糖凝胶比较合适？产物，应该用多大浓度的琼脂糖凝胶比较合适？3、如果没有得到、如果没有得到PCR产物，可能存在哪些问题，如何解决？产物，可能存在哪些问题，如何解决？4、如果、如果PCR产物在琼脂糖凝胶电泳时呈现片状，可能存在哪些问题，如何解决？
48、产物在琼脂糖凝胶电泳时呈现片状，可能存在哪些问题，如何解决？5、如果、如果PCR产物在琼脂糖凝胶电泳时，其特异性不够，可能存在哪些问题，如何解决？产物在琼脂糖凝胶电泳时，其特异性不够，可能存在哪些问题，如何解决？在进行在进行PCR时，遇到一些问题时的解决办法：时，遇到一些问题时的解决办法：1没有得到所希望的没有得到所希望的PCR产物产物 确证是否加入酶，检查酶是否有活性；确证是否加入酶，检查酶是否有活性；DNA解链是否充分；解链是否充分；人工合成的引物是否正确；人工合成的引物是否正确；在未加在未加 Taq DNA聚合酶以前，将反应系统在聚合酶以前，将反应系统在95保温保温510分钟，使蛋白酶及
49、核酸酶失活。分钟，使蛋白酶及核酸酶失活。2PCR产物在凝胶电泳中呈片状产物在凝胶电泳中呈片状 减少减少Taq DNA聚合酶的浓度；聚合酶的浓度；增加退火温度；增加退火温度；降低降低Mg2+浓度；浓度；减少退火时间及延伸时间；减少退火时间及延伸时间；减少周期次数；减少周期次数；从凝胶中回收与所希望的从凝胶中回收与所希望的DNA片段大小相同的片段大小相同的DNA，进，进 行再次行再次PCR扩增。扩增。2022-10-23953凝胶电泳中出现引物二聚体区带凝胶电泳中出现引物二聚体区带 检查引物的检查引物的 3端是否互补；端是否互补；设计较长的引物；设计较长的引物；增加靶目标增加靶目标DNA的量；的量
50、；降低引物浓度；降低引物浓度；减少周期次数；减少周期次数；增加退火温度；增加退火温度；4PCR产物特异性不够产物特异性不够 增加退火温度；增加退火温度；减少退火时间及延伸时间；减少退火时间及延伸时间；降低引物和降低引物和 Taq DNA聚合酶的浓度聚合酶的浓度 改变改变Mg2+浓度。浓度。2022-10-2396本章重点掌握的掌握的内容概念：概念：RT-PCR、复合、复合PCR、反向、反向PCR、不对称不对称PCR、嵌套、嵌套PCR、3RACE、5RACE、实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术的基本原理技术的基本原理PCR引物设计的一般原则引物设计的一般原则实时荧光定量实时荧光定量PCR技
