1、医学免疫学实验医学免疫学实验（三）（三）实验内容实验内容l1、淋巴细胞转化试验、淋巴细胞转化试验、E花环形成试验花环形成试验l2、补体结合、中和反应、免疫标记技术、补体结合、中和反应、免疫标记技术l3、录像：淋转、录像：淋转、E花环、免疫学标记技术花环、免疫学标记技术l4、操作：胶体金法检测、操作：胶体金法检测HCG淋巴细胞转化实验淋巴细胞转化实验l 是检测人外周血是检测人外周血T T淋巴细胞功能淋巴细胞功能的体外试验。的体外试验。l 原理原理:利用人外周血利用人外周血T T淋巴细胞表面的淋巴细胞表面的有丝分裂原受体有丝分裂原受体与相应丝裂原在体外结合后，可使细胞转化为淋巴母与相应丝裂原在体外
2、结合后，可使细胞转化为淋巴母细胞，细胞，表现为体积增大、胞浆丰富、并能进行有丝分表现为体积增大、胞浆丰富、并能进行有丝分裂裂。l 根据其转化的程度和转化率，可测定机体根据其转化的程度和转化率，可测定机体细胞免疫功细胞免疫功能能状态。常用的丝裂原为状态。常用的丝裂原为植物血凝素（植物血凝素（PHAPHA）。l 正常人淋巴细胞转化率约为正常人淋巴细胞转化率约为7070 淋巴细胞转化实验淋巴细胞转化实验T细胞细胞PHA淋巴母细胞淋巴母细胞（体积增大，形态不整齐，核（体积增大，形态不整齐，核大，松散，有核仁，胞浆变宽，大，松散，有核仁，胞浆变宽，出现空泡）出现空泡）刀豆素刀豆素A(ConA）美洲商陆（
3、美洲商陆（PWM）小淋巴细胞：小淋巴细胞：核质密、胞浆小、无核仁核质密、胞浆小、无核仁过过 渡渡 型：型：比小淋巴细胞略大、核质比小淋巴细胞略大、核质 略疏松，出现核仁略疏松，出现核仁淋巴母细胞：淋巴母细胞：大大4 45 5倍，核质疏松，倍，核质疏松，核仁核仁1 13 3个，核周淡染的个，核周淡染的 透明区，胞浆网状可见空泡透明区，胞浆网状可见空泡淋巴细胞分型淋巴细胞分型分裂相分裂相淋巴母细胞淋巴母细胞方法：外周血淋巴细胞方法：外周血淋巴细胞+PHA混匀，混匀，37 72小小时时取培养液涂片染色、镜检，分别计数转化细胞取培养液涂片染色、镜检，分别计数转化细胞（淋巴母细胞、过渡型母细胞和有丝分裂
4、相细胞）（淋巴母细胞、过渡型母细胞和有丝分裂相细胞）和成熟的淋巴细胞，共计数和成熟的淋巴细胞，共计数200个细胞。并计算转个细胞。并计算转化率。化率。转化率转化率转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数转化的淋巴细胞数+未转化的淋巴细胞数未转化的淋巴细胞数100%正常成人转化率为：正常成人转化率为：60%80%，50%视为降低视为降低形态学特点形态学特点1.核的大小核的大小2.核与胞浆的比例核与胞浆的比例3.核的构造及有无核仁核的构造及有无核仁淋巴细胞转化实验淋巴细胞转化实验临床应用及意义临床应用及意义1.1.用于结核病、慢性肝炎传染病的用于结核病、慢性肝炎传染病的细胞免疫功能的测定细
5、胞免疫功能的测定2.2.肿瘤病人的疗效和预后肿瘤病人的疗效和预后E E花环形成实验花环形成实验（Erythrocyte)l 检测人类外周血检测人类外周血T T细胞数量细胞数量的一种体外试验方法。的一种体外试验方法。T T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体（淋巴细胞表面具有绵羊红细胞受体（CD2/LFA-CD2/LFA-2 2），可吸附绵羊红细胞（），可吸附绵羊红细胞（SRBCSRBC）。）。l 显微镜下可见以显微镜下可见以T T细胞为中心，周围环绕绵羊红细细胞为中心，周围环绕绵羊红细胞（胞（3 3个及以上），形似花环，即为个及以上），形似花环，即为E E花环花环。一个一个E E花环形成细胞即为一个
6、花环形成细胞即为一个T T细胞细胞。l 正常人外周血中正常人外周血中E E花环形成细胞约占淋巴细胞总数花环形成细胞约占淋巴细胞总数的的60608080E玫瑰花环实验玫瑰花环实验（Erythrocyte)T cellCD2（SRBC receptor）结果判断及意义结果判断及意义结果判断：围绕结果判断：围绕3个绵羊红细胞为阳性个绵羊红细胞为阳性E花环形成率花环形成率=意义意义：花环形成的多少，可测知花环形成的多少，可测知T T细胞的细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态反映状态反映E花环形成阳性花环形成阳性T+E花环形成阴性花环形成阴性TE花环形成阳性花环
7、形成阳性T100%临床应用：临床应用：l1 1、测定外周血中的、测定外周血中的T T细胞数，观察受检者细胞数，观察受检者的细胞免疫功能及免疫增强剂的疗效；的细胞免疫功能及免疫增强剂的疗效；l2 2、观察免疫抑制剂的效果，协助进行恶性、观察免疫抑制剂的效果，协助进行恶性肿瘤疗效的观察及预后判断等肿瘤疗效的观察及预后判断等血清学反应的分类（型）血清学反应的分类（型）l（一）凝集反应（一）凝集反应l（二）沉淀反应（二）沉淀反应l（三）补体结合试验（三）补体结合试验l（四）中和反应（四）中和反应l（五）免疫标记技术（五）免疫标记技术（三）补体结合试验（三）补体结合试验 两个系统两个系统 5 5种成分种
8、成分 待检系统：待检系统：Ag+Ab+Ag+Ab+补体补体 指示系统：指示系统：绵羊红细胞绵羊红细胞(Ag)(Ag)溶血素溶血素(Ab)(Ab)方法：方法：结果：结果：溶溶 血血阴性阴性 不溶血不溶血阳性阳性 +）（Ag(Ag(未知未知)+Ab()+Ab(已知已知)+补体补体）SRBC(Ag)SRBC(Ag)溶血素溶血素(Ab)(Ab)（原理原理:抗原抗体复合物能吸附并激活补体，使红细胞溶解，抗原抗体复合物能吸附并激活补体，使红细胞溶解，出现溶血现象。出现溶血现象。AgPatientsserum AgNo AgAg结果判定结果判定溶溶 血血阴性阴性不溶血不溶血阳性阳性中和反应中和反应 病毒或毒
9、素与相应的抗体结合后，失去对病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力，谓之易感动物的致病力，谓之中和实验中和实验中和反应中和反应 neutralizationneutralization 在在活细胞或活体活细胞或活体内测定病毒被特异性抗体内测定病毒被特异性抗体中和中和而而失失去致病力去致病力的试验。中和抗体与病毒结合后，使病毒失去的试验。中和抗体与病毒结合后，使病毒失去对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖对敏感细胞的感染能力，从而阻止病毒的繁殖 1 1、病毒中和试验、病毒中和试验 细菌毒素与抗毒素中和试验。常见用于诊细菌毒素与抗毒素中和试验。常见用于诊断风湿病抗断风湿病抗“O”
10、试验试验。2 2、毒素中和试验、毒素中和试验原理：原理：乙型溶血性链球菌能产生溶解人或动物红细胞的乙型溶血性链球菌能产生溶解人或动物红细胞的溶血素溶血素“O”，称为溶血毒素，它具有很强的抗原，称为溶血毒素，它具有很强的抗原性，能刺激机体产生相应的抗体。当该毒素与相应性，能刺激机体产生相应的抗体。当该毒素与相应抗体作用时，毒性被中和而失去溶血活性。抗体作用时，毒性被中和而失去溶血活性。常用于常用于风湿病风湿病辅助诊断辅助诊断方法：方法：病人血清病人血清+链球菌溶血素链球菌溶血素加加2%2%的兔红细胞再次混匀的兔红细胞再次混匀 观察有无溶血观察有无溶血摇晃摇晃1010分钟分钟3737水浴水浴45m
11、in45min取出放入冰箱取出放入冰箱30mi30min n阳性阳性+阴性阴性-免疫学标记技术免疫学标记技术 将已知抗体或抗原标记显示性物质，通过检测标记将已知抗体或抗原标记显示性物质，通过检测标记物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原物，反映有无抗原抗体反应，从而间接测出微量的抗原或抗体或抗体 常用的标记物：常用的标记物：酶、荧光素酶、荧光素、放射性同位素、放射性同位素、胶体金胶体金、生物素、电、生物素、电子致密物等。子致密物等。酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ELISA）(Enzyme linked lmmunosorbent Assay)【原理原理】把抗原抗体的免疫反应和酶
12、（主要有把抗原抗体的免疫反应和酶（主要有辣根过辣根过氧化物酶氧化物酶、碱性磷酸酶等）的高效催化作用有机地结、碱性磷酸酶等）的高效催化作用有机地结合起来，合起来，并仍保持其免疫和酶的活性并仍保持其免疫和酶的活性。结合在抗原抗。结合在抗原抗体复合物上的酶在遇到相应底物时，可以催化底物体复合物上的酶在遇到相应底物时，可以催化底物水水解、氧化或还原解、氧化或还原，从而产生有色物质从而产生有色物质。颜色反应的深。颜色反应的深浅与抗体或抗原的量成正比。浅与抗体或抗原的量成正比。【方法方法】主要有间接法和双抗体夹心法。主要有间接法和双抗体夹心法。免疫荧光技术（荧光抗体技术）免疫荧光技术（荧光抗体技术）IFA
13、【原理原理】将将荧光色素荧光色素（常用（常用异硫氰酸异硫氰酸荧光素，简称荧光素，简称FITCFITC）与特异性抗体（或抗原）以共价键基团牢固结合，但与特异性抗体（或抗原）以共价键基团牢固结合，但不影响该血清抗体的免疫特性不影响该血清抗体的免疫特性。这种荧光标记的抗原。这种荧光标记的抗原抗体复合物，抗体复合物，可通过荧光灯源中产生的紫外光或蓝紫可通过荧光灯源中产生的紫外光或蓝紫光激发产生荧光光激发产生荧光，而用荧光显微镜加以观察。，而用荧光显微镜加以观察。具有具有特异、敏感、快速特异、敏感、快速的特点。的特点。【方法方法】主要有直接法和间接法。主要有直接法和间接法。免疫荧光免疫荧光核均质型核均质
14、型核仁型核仁型免疫荧光免疫荧光核膜型核膜型操作：胶体金法检测人尿液中绒毛膜促性腺操作：胶体金法检测人尿液中绒毛膜促性腺激素（激素（HCGHCG）l HCG（绒毛膜促性腺激素）是妇产科医生们所熟悉和最常使用的“妊娠试验”激素。它是由和二聚体的糖蛋白组成。但-亚单位为垂体前叶激素所共有。-亚单位是HCG所特异的。尿尿-HCG-HCGl 尿尿-HCG-HCG定性定性：孕妇孕妇阳性阳性/非孕妇女非孕妇女阴性阴性l 尿尿-HCG-HCG（HCGHCG半定量法）：半定量法）：（清晨尿（清晨尿HCGHCG水平最高，接近血水平最高，接近血清水平）清水平）非孕妇女非孕妇女 25IU/L5000IU/L,5000
15、IU/L,孕孕60-7060-70天天(8-32)(8-32)10104 4IU/LIU/L。l 正常妊娠期间血清正常妊娠期间血清HCGHCG水平：水平：原理原理l 采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，使采用胶体金标记抗体，以硝酸纤维素膜为载体，使抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，抗原抗体反应和洗涤在同一渗滤膜上，反应后根据反应后根据在膜上的颜色判断结果在膜上的颜色判断结果。l 以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，以硝酸纤维素膜为载体，利用微孔膜毛细管作用，使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析使膜一端的液体慢慢向另一端渗移，犹如层析 鼠抗人HCG单抗 胶体金颗粒 HCG分子胶
16、体金标记鼠抗人HCG单抗羊抗鼠IgGHCG 阳性标本positiveHCG 阴性标本negative试纸条失效 失效临床临床意义意义应用应用l 1 1诊断早期妊娠诊断早期妊娠l 2 2异常妊娠异常妊娠l 3 3流产诊断与治疗流产诊断与治疗l 4 4先兆流产先兆流产l 5 5肿瘤诊断与治疗监测肿瘤诊断与治疗监测l 6.6.葡萄胎、绒毛膜上皮癌葡萄胎、绒毛膜上皮癌l 器材：验孕试纸器材：验孕试纸/人人 标标1 1、标、标2 2；阳性对照、阴性对照；阳性对照、阴性对照l 方法：1.将试条有标志线的下端浸入尿液标本中，深度到达且不可超过标志线MAX；2.约5秒后取出，平放，5分钟内观察结果(时间不能小于5分钟，也不能超过15分钟)：两条红线为(+)，提示尿中含HCG。一条红线为(一)，表示不含HCG。实验报告实验报告l 胶体金法检测胶体金法检测HCG原理、结果、作图、结论。原理、结果、作图、结论。l 作图（示教）：淋转，花环作图（示教）：淋转，花环
