1、v目的基因的获取v基因表达载体的构建v将目的基因导入受体细胞v目的基因的表达和检测只有第三步只有第三步“将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞”没有发生碱基互补配对，没有发生碱基互补配对，其余三步中都涉及碱基互补配对。其余三步中都涉及碱基互补配对。非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNARNA聚合酶识别结合聚合酶识别结合启动子启动子终止子终止子1 1、编码区：、编码区：能转录相应的信使能转录相应的信使RNARNA，能编码蛋白质的序列。，能编码蛋白质的序列。2 2、非编码区、非编码区 ：调控遗传信息表达的核苷酸序列调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、启动子、终止子），不编码蛋白
2、质。终止子），不编码蛋白质。原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构（补充知识）（补充知识）真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构（补充知识）（补充知识）编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区 内含子内含子 外显子外显子 启动子启动子终止子终止子RNARNA聚合酶识别和结合聚合酶识别和结合1 1、编码区、编码区2 2、非编码区、非编码区 ：调控遗传信息表达的核苷酸序列调控遗传信息表达的核苷酸序列(启动子、启动子、终止子），不编码蛋白质。终止子），不编码蛋白质。外显子：能编码蛋白质的序列外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列非编码序列：非编码序列：包括
3、非编码区和内含子包括非编码区和内含子思考感悟思考感悟3从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产从细胞器的功能上分析，若通过基因工程生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？【提示提示】不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网不可以，糖蛋白上的糖链是在内质网和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体和高尔基体上加工完成的，而内质网和高尔基体存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞存在于真核细胞中，大肠杆菌是原核生物，细胞中不含有这两种细胞器。中不含有这两种细胞器。1获取目的基因获取目的基因限制酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装1)基因组文库(Genomic library)是
4、指将某种生物体的全部基因组DNA用限制酶或机械力切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组后，导入受体菌的群体中储存，这个群体就称为该生物基因组文库。目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。（一）从基因文库中直接获取（一）从基因文库中直接获取cDNA(互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，这个受体菌群就叫做这种生物的cDNA文库。2)cDNA文库(cDNA library)基因重组反转录酶mRNAcDNA真核细胞的一个基因的编码区转录出真核细胞的一个基因的编码区转录出mRN
5、AmRNA前体，前体，需把其中的内含子切除，外显子拼接成成熟需把其中的内含子切除，外显子拼接成成熟mRNAmRNA。所。所以，以，cDNAcDNA文库的基因中无内含子。文库的基因中无内含子。（二）利用（二）利用PCRPCR扩增目的基因扩增目的基因（体外扩增）（体外扩增）1 1、过程、过程高温变性（解旋为单链）高温变性（解旋为单链）低温退火（低温退火（引物引物与单链互补结合）与单链互补结合）适温延伸适温延伸（在（在TaqTaq酶酶的作用下合成的作用下合成 与模板互补的与模板互补的DNADNA双链）双链）重复循环重复循环(1)目的：目的：使目的基因在受体细胞中稳定使目的基因在受体细胞中稳定存在，并
6、且可以遗传给下一代，同时使目存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。2基因表达载体的构建基因表达载体的构建基基因工程的核心因工程的核心特别提醒特别提醒获取目的基因和切割载体时使用获取目的基因和切割载体时使用同一种同一种限制酶，目的限制酶，目的 是产生相同的黏性末端。是产生相同的黏性末端。获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生获取一个目的基因需限制酶剪切两次，共产生4个黏性个黏性 末端或平末端。末端或平末端。限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，限制酶切割位点的选择必须保证标记基因的完整性，以便于检测。以便于检测。双酶切：防止目的基因和载
7、体酶切后的末端任意连接，双酶切：防止目的基因和载体酶切后的末端任意连接，如如目的基因目的基因目的基因、目的基因目的基因、目的基因载体、载体载体、载体载体等载体等。四、将目的基因导入受体细胞四、将目的基因导入受体细胞1转化：转化：_进入受体细胞内，并且在受进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和体细胞内维持稳定和_的过程。的过程。2导入植物细胞导入植物细胞(1)方法：方法：_、基因枪法、花粉管通、基因枪法、花粉管通道法。道法。(2)农杆菌特点农杆菌特点易感染双子叶植物和祼子植物。易感染双子叶植物和祼子植物。Ti质粒上的质粒上的_可转移至受体细胞，并且可转移至受体细胞，并且整合到受体细胞染色体整
8、合到受体细胞染色体DNA上。上。目的基因目的基因表达表达农杆菌转化法农杆菌转化法TDNA3导入动物细胞导入动物细胞(1)方法：方法：_注射技术。注射技术。(2)常用受体细胞：受精卵。常用受体细胞：受精卵。4导入微生物细胞导入微生物细胞(1)原核生物特点：繁殖快、多为原核生物特点：繁殖快、多为_、遗传、遗传物质相对较少等。物质相对较少等。(2)对受体细胞的常用处理方法：用对受体细胞的常用处理方法：用_处理细处理细胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中胞，使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子分子的生理状态的生理状态(这种细胞称为感受态细胞这种细胞称为感受态细胞)。显微显微单细胞单细胞Ca24目的基
9、因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定知识延伸知识延伸DNADNA分子杂交技术分子杂交技术 该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。或基因。1、用、用-珠蛋白的珠蛋白的DNA探针可以检测出的遗传病是探针可以检测出的遗传病是 A镰刀状细胞贫血症镰刀状细胞贫血症 B白血病白血病C坏血病坏血病
10、 D苯丙酮尿症苯丙酮尿症 A2、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A用于检测疾病的医疗器械用于检测疾病的医疗器械B用放射性同位素或荧光分子等标记的用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子分子C合成合成-珠蛋白的珠蛋白的DNAD合成苯丙羟化酶的合成苯丙羟化酶的DNA片段片段B1乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较乳腺生物反应器与工程菌生产药物的比较(1)含义：含义：乳腺生物反应器是指将外源基因在哺乳动物的乳乳腺生物反应器是指将外源基因在哺乳动物的乳腺
11、中、特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。腺中、特异表达，利用动物的乳腺组织生产药物蛋白。工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。到高效表达的菌类细胞株系。比较项目比较项目乳腺生物反应器乳腺生物反应器工程菌工程菌受体细胞受体细胞动物的受精卵动物的受精卵微生物细胞微生物细胞导入目的导入目的基因的方式基因的方式显微注射法显微注射法感受态细胞法感受态细胞法生产条件生产条件不需严格灭菌，温不需严格灭菌，温度等外界条件对其度等外界条件对其影响不大影响不大需严格灭菌，严格控需严格灭菌，严格控制工程菌所需的温度、制工程菌所需的温度、pH、
12、营养物质浓度等、营养物质浓度等外界条件外界条件药物提取药物提取从动物乳汁中提取从动物乳汁中提取从微生物细胞中提取从微生物细胞中提取 蛋白质工程：蛋白质工程：以蛋白质分子的结构规律及其与生以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过物功能的关系作为基础，通过基因修饰基因修饰或或基因合基因合成成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。质，以满足人类对生产和生活的需求。基因基因DNADNA氨基酸序列氨基酸序列多肽链多肽链蛋白质蛋白质三维结构三维结构预期功能预期功能生物功能生物功能mRNAmRNA转录转录翻译翻译折叠
13、折叠DNADNA合成合成分子设计分子设计预期蛋白质功能预期蛋白质功能设计预期的蛋白质设计预期的蛋白质推测应有推测应有的氨基酸序列的氨基酸序列找到对应的脱氧核苷酸序列。找到对应的脱氧核苷酸序列。2蛋白质工程与基因工程的比较蛋白质工程与基因工程的比较蛋白质工程蛋白质工程基因工程基因工程区区别别过过程程预期蛋白质功能预期蛋白质功能设计预期的蛋白设计预期的蛋白质结构质结构推测应有的氨基酸序列推测应有的氨基酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列找到相对应的脱氧核苷酸序列获取目的基因获取目的基因构建基因构建基因表达载体表达载体将目的基因导将目的基因导入受体细胞入受体细胞目的基因的目的基因的检测与鉴定检测与鉴定区区别别实实质质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造或生产人类所需的蛋白质定向改造生物的遗传特性，定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类以获得人类所需的生物类型或生物产品型或生物产品结结果果可生产自然界没有的蛋白质可生产自然界没有的蛋白质只能生产自然界已有的蛋只能生产自然界已有的蛋白质白质联系：联系：蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程。蛋白质工程是在基因工程基础上延伸出来的第二代基因工程。基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。基因工程中所利用的某些酶需要通过蛋白质工程进行修饰、改造。
