1、生物技术学院抗体工程研究所生物技术学院抗体工程研究所2009年年6月月11日日免疫学检测技术免疫学检测技术1分子诊断学分子诊断学分子诊断学是以分子生物学理论为基分子诊断学是以分子生物学理论为基础，利用础，利用基因和蛋白质分析技术和方法基因和蛋白质分析技术和方法来研究人体内源性或外源性生物大分子来研究人体内源性或外源性生物大分子体系的存在、结构或表达调控的变化，体系的存在、结构或表达调控的变化，为疾病的监测、诊断、疗效判断和预后为疾病的监测、诊断、疗效判断和预后评估、个体化治疗等提供信息和决策依评估、个体化治疗等提供信息和决策依据的一门科学。据的一门科学。随着分子诊断技术的不断发展，分子随着分子
2、诊断技术的不断发展，分子诊断已从传统的诊断已从传统的DNADNA诊断概念发展到更全诊断概念发展到更全面的面的核酸和蛋白质核酸和蛋白质诊断的新概念；分子诊断的新概念；分子诊断的内容也从早期的单一遗传性疾病诊断的内容也从早期的单一遗传性疾病的诊断发展成为覆盖临床医学、预防医的诊断发展成为覆盖临床医学、预防医学等众多领域的重要技术。学等众多领域的重要技术。2v生化产品生化产品30v免疫产品免疫产品25%v基因产品基因产品58v血液分析产品血液分析产品810v尿液分析产品尿液分析产品35%v微生物产品微生物产品23诊断试剂仅占生物技术产业的诊断试剂仅占生物技术产业的25%20052005年国内临床诊断
3、市场年国内临床诊断市场3免疫学检验项目分布情况免疫学检验项目分布情况Infectious diseasesInfectious diseasesTumor markersTumor markersSource:UBS Warburg LLC estimatesSource:UBS Warburg LLC estimates免疫学技术在临床诊断领域中的作用将越来越重要免疫学技术在临床诊断领域中的作用将越来越重要4主要内容（1 1）酶免疫分析酶免疫分析（2 2）放射免疫分析放射免疫分析（3 3）免疫荧光分析免疫荧光分析（4 4）时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析（5 5）化学发光免疫分析化学
4、发光免疫分析（6 6）金标和金标和磁性免疫层析分析磁性免疫层析分析（7 7）蛋白印迹蛋白印迹（8 8）AlphaScreenAlphaScreen分析技术分析技术 51 1、特异性特异性2 2、可见性、可见性3 3、可逆性、可逆性抗原抗体反应的特性抗原抗体反应的特性AgAb-+6(1)(1)抗原抗体的性质抗原抗体的性质(2)(2)温度温度(3)(3)酸碱度（酸碱度（PHPH）(4)(4)电解质（离子强度）电解质（离子强度）影响抗原抗体反应的因素影响抗原抗体反应的因素71 1、天然抗原天然抗原2 2、重组抗原、重组抗原3 3、合成肽、合成肽1 1、多克隆抗体多克隆抗体2 2、单克隆抗体、单克隆抗
5、体3 3、基因工程抗体、基因工程抗体抗原抗原抗体抗体抗原和抗体的类别抗原和抗体的类别Georges J.F.Khler,Csar Milstein,1984 McAb Georges J.F.Khler,Csar Milstein,1984 McAb 8标记免疫学分析技术发展历程标记免疫学分析技术发展历程4免疫荧光分析免疫荧光分析(Coons,1941)(Coons,1941)4放射免疫分析放射免疫分析(Berson(Berson和和Yalow,1960)Yalow,1960)4酶联免疫吸附分析酶联免疫吸附分析 (Engvall,1971)(Engvall,1971)4金标免疫分析金标免疫分析
6、(Faulk(Faulk和和Taylor,1971)Taylor,1971)4化学发光免疫分析化学发光免疫分析(Arakawa(Arakawa，1977)1977)4时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析(Soini(Soini和和HemmilaHemmila，1979)1979)4电化学发光免疫分析电化学发光免疫分析(Leland,1990)(Leland,1990)9免疫荧光免疫荧光放射免疫放射免疫化学发光化学发光电化学发光电化学发光 时间分辨荧光时间分辨荧光酶联免疫酶联免疫标记免疫学分析技术发展历程标记免疫学分析技术发展历程10一、酶免疫分析技术一、酶免疫分析技术酶免疫技术酶免疫技术固
7、相固相(ELISA)(ELISA)酶免疫组织化学酶免疫组织化学酶免疫测定酶免疫测定均相均相异相异相液相液相11 酶联免疫吸附测定（酶联免疫吸附测定（Enzyme Linked Immuno Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA Sorbent Assay,ELISA）基础是抗原或抗体）基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，反应完成后的固相化及抗原或抗体的酶标记，反应完成后加入酶反应底物，底物被酶催化成为有色产物加入酶反应底物，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定
8、量分析。由此进行定性或定量分析。(一一)ELISA)ELISA技术技术12来源方便，易于纯化；来源方便，易于纯化；比活性高，性质稳定；比活性高，性质稳定；与抗体或抗原交联后仍保持酶的活性；与抗体或抗原交联后仍保持酶的活性；待测物中不存在该酶及其底物、抑制剂和其它干待测物中不存在该酶及其底物、抑制剂和其它干扰因素；扰因素；酶活性和量能用简单、快速、敏感的方法测定。酶活性和量能用简单、快速、敏感的方法测定。标记用酶的要求标记用酶的要求辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶13底物为邻苯二胺底物为邻苯二胺(OPD),(OPD),橙红色橙红色 ，检，检测波长测波长492nm492nm；四
9、甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)，蓝绿色，检测蓝绿色，检测波长波长450nm450nm辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶14碱性磷酸酶碱性磷酸酶 底物为底物为PNPPNP（对硝基磷酸苯酯）（对硝基磷酸苯酯）,检测波长检测波长405nm405nm。15固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体酶作用的底物酶作用的底物 ELISAELISA的必要试剂的必要试剂 根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。16双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原双抗原夹心法测
10、抗体双抗原夹心法测抗体间接法测抗体间接法测抗体竞争法测抗体竞争法测抗体竞争法测抗原竞争法测抗原捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体BAS-ELISABAS-ELISA法法技术类型技术类型17(1)(1)双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原 此法适用于检验各种大分子抗原，例如此法适用于检验各种大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。等。酶标抗体酶标抗体样品样品底物底物酶标仪测定酶标仪测定ODOD值值终止液终止液18n在一步法测定中，如标本中受检抗原的含量很高在一步法测定中，如标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而时，过量抗原分别和固相
11、抗体及酶标抗体结合，而不再形成不再形成“夹心复合物夹心复合物”。所得结果将低于实际。所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应的含量，这种现象被称为钩状效应(hook effect)(hook effect)。n类风湿因子（类风湿因子（RFRF）的干扰。）的干扰。RFRF是一种自身抗体，是一种自身抗体，多为多为IgMIgM型，能和多种动物型，能和多种动物IgGIgG的的FcFc段结合。表现出段结合。表现出假阳性反应。假阳性反应。(1)双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原19 反应模式与双抗体夹心法类似。反应模式与双抗体夹心法类似。用特异性抗原进行包被和制备酶结用特异性抗原进行包被和制备酶
12、结合物，以检测相应的抗体。合物，以检测相应的抗体。抗抗-HBs-HBs、抗、抗-HCV-HCV、抗、抗-HIV-HIV的检测常采用本的检测常采用本法。法。(2)双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体20(3)(3)间接法测抗体间接法测抗体 一些传染病的诊断一些传染病的诊断(Torch)(Torch)。包被抗原。包被抗原利用利用酶标二抗酶标二抗建立检测相应抗体的方法。建立检测相应抗体的方法。酶标抗体酶标抗体样品样品样品稀释液样品稀释液终止液终止液底物底物2122(4)(4)竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，
13、可用此法检测特异性抗体。到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。如抗如抗-HBc-HBc等常用该方法。等常用该方法。酶标抗体酶标抗体样品样品底物底物终止液终止液23(5)(5)竞争法测抗原竞争法测抗原 其原理是标本中的抗原和一定量的酶其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素少，最后的显色也愈浅。小分子激素(T3(T3、T4)T4)、药物等、药物等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。24(6)(6)捕获包被法测抗体
14、捕获包被法测抗体 IgM IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgMIgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgMIgM（其中（其中包括针对抗原的特异性包括针对抗原的特异性IgMIgM抗体和非特异性的抗体和非特异性的IgMIgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。酶标抗体酶标抗体特异性抗原特异性抗原样品样品终止液终止液底物底物25(7)(7)BAS-ELISABAS-ELISA法法：固相支持物；：固相支持物；：样品；：样品；：特异性：特异性IgGIgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG I
15、gG（BiotinBiotin）；）；：辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素（酶标链亲和素（AvidinAvidin）；）；：DABDAB显色液；显色液；：显色；：显色；26酶标记抗原或抗体的方法酶标记抗原或抗体的方法1.1.戊二醛法戊二醛法一步法：将一步法：将HRPHRP和抗体与戊二醛同时反应连接和抗体与戊二醛同时反应连接而成。而成。一步法操作简单，但所得产物质量不均一步法操作简单，但所得产物质量不均一，抗体活性损失大，结合物的产率低。一，抗体活性损失大，结合物的产率低。二步法：将二步法：将HRPHRP按一定比例与戊二醛反应，形按一定比例与戊二醛反应，形成成HRP-HR
16、P-戊二醛结合物，透析除去未结合的戊二戊二醛结合物，透析除去未结合的戊二醛后，再加入抗体。醛后，再加入抗体。二步法制备的结合物产量二步法制备的结合物产量虽无提高，但质量均一，活性高。虽无提高，但质量均一，活性高。27酶标记抗原或抗体的方法酶标记抗原或抗体的方法2.2.过碘酸钠法过碘酸钠法 过碘酸钠将酶分子上的糖羟基氧化成醛过碘酸钠将酶分子上的糖羟基氧化成醛基，醛基与抗体（或抗原）中的游离氨基结合基，醛基与抗体（或抗原）中的游离氨基结合形成形成SchiffsSchiffs碱，经碱，经NaBHNaBH还原生成稳定的酶结还原生成稳定的酶结合物。合物。该法快速简便、安全，酶结合物的产率高、该法快速简便
17、、安全，酶结合物的产率高、活性好，已成为目前最常用的酶标记方法活性好，已成为目前最常用的酶标记方法 。28酶标记物的纯化酶标记物的纯化硫酸铵盐析法硫酸铵盐析法Sephadex G-200Sephadex G-200凝胶过滤凝胶过滤SPASPA亲和层析亲和层析29最适工作浓度的选择（间接法）最适工作浓度的选择（间接法）酶标抗体工作浓度酶标抗体工作浓度100ng/ml人人 IgG系列稀释酶标抗体系列稀释酶标抗体OD值约为值约为1.0时的稀释度时的稀释度包被抗原工作浓度包被抗原工作浓度系列抗原稀释度包被系列抗原稀释度包被加入加入1:100稀释强阳性、稀释强阳性、弱阳性、阴性对照弱阳性、阴性对照加酶标
18、抗人加酶标抗人IgG抗体抗体强阳性强阳性OD值约为值约为0.8，阴性阴性OD值小于值小于0.130间接间接ELISAELISA法包被抗原工作浓度的选择法包被抗原工作浓度的选择参考血清参考血清各抗原稀释度的吸光度值各抗原稀释度的吸光度值1:501:1001:2001:400 1:800强阳性强阳性1.261.080.860.680.42弱阳性弱阳性0.680.410.300.220.18阴性阴性0.250.130.050.040.03稀释液稀释液0.090.020.020.020.0431双抗体夹心法工作浓度的选择双抗体夹心法工作浓度的选择(棋盘法棋盘法)包被抗体浓度包被抗体浓度酶标抗体酶标抗体
19、稀释度稀释度各抗原浓度的吸光度值各抗原浓度的吸光度值25ng/ml1.5ng/ml阴性阴性5g/ml1:20001:40001:80003g/ml1:20001:40001:80001g/ml1:20001:40001:800025ng/ml25ng/ml的抗原的抗原ODOD值约为值约为0.80.8，阴性，阴性ODOD值小于值小于0.10.132固相载体的选择固相载体的选择包被包被封闭封闭加样加样保温保温洗涤洗涤显色显色ELISAELISA技术操作要点技术操作要点33n不同批号的试剂盒不要混用。不同批号的试剂盒不要混用。n整个实验过程应尽量建立在干净无整个实验过程应尽量建立在干净无尘的环境下进
20、行。尘的环境下进行。n试剂盒与待检样本使用前必须平衡试剂盒与待检样本使用前必须平衡至室温。至室温。试剂盒试剂操作前的注意事项试剂盒试剂操作前的注意事项34 酶标板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯酶标板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。疫学活性。酶标板酶标板良好的酶标板应该是吸附良好的酶标板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。各孔之间性能相近。35 以一定浓度的人以一
21、定浓度的人IgGIgG（一般为（一般为10ng/ml10ng/ml）包被包被ELISAELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人释度的酶标抗人IgGIgG 抗体，保温后洗涤，加抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度光度0.80.8左右。计算全部左右。计算全部 读数的平均值。所读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%10%。酶标板的检定酶标板的检定36n包被液：
22、包被液：碳酸盐缓冲溶液碳酸盐缓冲溶液(pH=9.6),PBS(pH=9.6),PBS(pH=7.4),Tris-HCl(pH=7.8)(pH=7.4),Tris-HCl(pH=7.8)n包被浓度：包被浓度：100ng/ml-20ug/ml100ng/ml-20ug/mln温度和时间：在温度和时间：在4-84-8过夜或过夜或37 237 2小时小时包包 被被37 封闭封闭(blocking)(blocking)是继包被之后用高浓度是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。的无关蛋白质溶液再包被的过程。u0.05%-0.5%0.05%-0.5%的牛血清白蛋白的牛血清白蛋白u10%10%的小
23、牛血清的小牛血清u1%1%明胶明胶u5%5%脱脂奶脱脂奶 粉粉封封 闭闭38 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。即加标本，加酶结合物，加底物。4吸头应悬空，避免因吸头碰到小孔边缘或其中吸头应悬空，避免因吸头碰到小孔边缘或其中试剂而造成污染试剂而造成污染4每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染；每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染；4酶结合物工作液和底物可用多道加液器，使加酶结合物工作液和底物可用多道加液器，使加液过程迅速完成。液过程迅速完成。加加 样样393737是实验室中常用的保温温度，也是大多是实验室中常用的保温温度，也是
24、大多数抗原抗体结合的合适温度；数抗原抗体结合的合适温度；室温较室温较3737可避免蒸发，为加速反应，可辅可避免蒸发，为加速反应，可辅以摇床振荡；以摇床振荡；抗原抗体反应在抗原抗体反应在44过夜反应更为彻底。过夜反应更为彻底。孵孵 育育40决定着实验的成败决定着实验的成败 4 ELSIAELSIA靠洗涤来分离游离的和结合的酶标记物。靠洗涤来分离游离的和结合的酶标记物。通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。吸附于固相载体的干扰物质。常用洗涤液为
25、常用洗涤液为pH7.4 PBS-Tween-20 pH7.4 PBS-Tween-20。4手工洗板时要注意防止气泡产生。手工洗板时要注意防止气泡产生。4洗板机在使用前应进行校正注液量和残留量，注洗板机在使用前应进行校正注液量和残留量，注意管道是否通畅。洗涤时，确认每孔中的洗涤液意管道是否通畅。洗涤时，确认每孔中的洗涤液都注满微孔，洗涤后，每个孔必须是干的，如果都注满微孔，洗涤后，每个孔必须是干的，如果仍有水可倒扣在无尘吸水纸上拍干。仍有水可倒扣在无尘吸水纸上拍干。洗洗 涤涤41 HRP-TMB HRP-TMB显色系统受光照的影响不显色系统受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察大，
26、可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。定的适当时间阅读结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，作用后，约约4040分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2 2小小时后即可完全消退至无色。各类酸性终止液时后即可完全消退至无色。各类酸性终止液(2mol/LH(2mol/LH2 2SOSO4)4)则会使蓝色转变成黄色，此时则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长（可用特定的波长（450nm450nm）测读吸光值。）测读吸光值。显显 色色42ELISA试剂盒试剂盒（1 1）已包被抗
27、原或抗体的固相载体；）已包被抗原或抗体的固相载体；（2 2）酶标记的抗原或抗体）酶标记的抗原或抗体(结合物结合物)；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）阴性对照品和阳性对照品）阴性对照品和阳性对照品(定性测定中定性测定中)，参考，参考标准品标准品 (定量测定中定量测定中)；（5 5）标本稀释液；）标本稀释液；（6 6）洗涤液；）洗涤液；（7 7）终止液。）终止液。43实验仪器：ELISA操作的标准化 变频振荡器变频振荡器 全自动酶联免疫分析仪全自动酶联免疫分析仪BIORAD550 BIORAD550 酶标仪酶标仪BIORAD1575BIORAD1575洗板仪洗板仪44(1)(1)在医学检
28、测中的应用在医学检测中的应用病原体及其抗体的检测病原体及其抗体的检测蛋白质的检测蛋白质的检测非肽类激素的检测非肽类激素的检测药物的检测药物的检测毒品检测毒品检测45(2)(2)在食品检测中的应用在食品检测中的应用食品微生物的检测食品微生物的检测食品毒素的检测食品毒素的检测食品中残留农药的检测食品中残留农药的检测食品中残留抗生素的检测食品中残留抗生素的检测转基因食品的检测转基因食品的检测46v与放射免疫测定相比，标记物比较稳定，无与放射免疫测定相比，标记物比较稳定，无放射性的危害。放射性的危害。v与免疫荧光技术相比，结果判定更加客观。与免疫荧光技术相比，结果判定更加客观。v操作简单，易自动化。操
29、作简单，易自动化。v酶标仪普及、价格低廉。酶标仪普及、价格低廉。47vO.DO.D值仅在低浓度范围与酶活性呈线性值仅在低浓度范围与酶活性呈线性关系，关系，HookHook效应严重。效应严重。v酶的活性容易失活，使酶的活性容易失活，使ELISAELISA的灵敏度的灵敏度不高。不高。vELISAELISA的大分子标记容易影响被标记物的大分子标记容易影响被标记物的空间结构，使得的空间结构，使得ELISAELISA的灵敏度进一步的灵敏度进一步提高受到限制。提高受到限制。48 免疫组化技术又称免疫细胞化学，以免疫组化技术又称免疫细胞化学，以酶标记抗体（或抗原）用于免疫学检测，通酶标记抗体（或抗原）用于免
30、疫学检测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对细胞和过相应底物被酶解后的显色反应，对细胞和组织标本中的抗原抗体复合物进行定位、组织标本中的抗原抗体复合物进行定位、定性分析和鉴定。它把免疫反应的特异性、定性分析和鉴定。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原。平检测各种抗原。(二二)酶免疫组织化学技术酶免疫组织化学技术49直接法直接法间接法间接法酶桥法酶桥法 PAPPAP法法APAAPAPAAP法法 亲和素生物素方法亲和素生物素方法 主要类型主要类型5
31、0主要类型主要类型 直接法间接法直接法间接法 酶桥法酶桥法PAPPAP法法 5180%80%甲醇甲醇+0.3%H2O2+0.3%H2O2处理切片处理切片151530min30min，封闭内源，封闭内源性过氧化酶的活性；性过氧化酶的活性；0.05%Tween-20/PBS 0.05%Tween-20/PBS 洗涤；洗涤；0.10.11%BSA1%BSA湿盒内孵育湿盒内孵育151525min25min；加第一抗体（加第一抗体（505080l80l），湿盒内孵育），湿盒内孵育1 12h2h；0.05%Tween-20/PBS 0.05%Tween-20/PBS 洗涤；洗涤；加加HRPHRP酶标记二抗
32、酶标记二抗,湿盒内孵育湿盒内孵育454560min60min；PBSPBS漂洗漂洗3 3次；次；0.010.010.05%DAB0.05%DAB显色显色101015min15min（暗处）。（暗处）。实验步骤实验步骤5253 放射免疫分析放射免疫分析(Radioimmunoassay(Radioimmunoassay，RIA)1959RIA)1959年由年由BersonBerson和和YalowYalow创建，是以放创建，是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法，射性核素为标记物的标记免疫分析法，RIARIA将放射性核素分析的高灵敏度与抗原抗体反将放射性核素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相
33、结合，应的特异性相结合，用于测定标本中抗原用于测定标本中抗原或抗体的量。或抗体的量。二、放射免疫分析二、放射免疫分析 Rosalyn Yalow,1977 Rosalyn Yalow,197754放射免疫分析放射免疫分析(RIA)(RIA)+Prior to TestLabeled Ag+Test+PatientssampleLabeledAg+55 1968 1968年年MilesMiles和和HalesHales应用放射性核应用放射性核素标记的抗胰岛素抗体检测牛血清中胰素标记的抗胰岛素抗体检测牛血清中胰岛素获得成功。为了区别于经典的放射岛素获得成功。为了区别于经典的放射免疫测定免疫测定(R
34、IA)(RIA)，他们将其命名为免疫，他们将其命名为免疫放射分析放射分析(immunoradiometric assay(immunoradiometric assay，IRMA)IRMA)。免疫放射分析免疫放射分析56SolidPhaseAgImmobilizedAg in PatientssampleLabeledAb免疫免疫放射放射分析分析(IRMA)(IRMA)57高比活度高比活度适宜的半衰期适宜的半衰期对抗原和抗体损害小对抗原和抗体损害小容易标记容易标记放射性核素的选择原则放射性核素的选择原则58放射性核素放射性核素1414C C 和和3 3H H：半衰期长：半衰期长(5730(57
35、30年和年和12.2612.26年年 )，需在，需在真空条件下标记，真空条件下标记，射线测定需要液体闪烁技术，射线测定需要液体闪烁技术，一般实验室不易开展，放射性废物处理困难，应一般实验室不易开展，放射性废物处理困难，应用受限制。用受限制。131131I I和和125125I I ：125125I I化学性质活泼，易标记，含有化学性质活泼，易标记，含有酪氨酸的蛋白质和多肽均可标记酪氨酸的蛋白质和多肽均可标记 ；衰变过程不；衰变过程不产生产生 射线，可以晶体闪烁计数仪直接测量射线，可以晶体闪烁计数仪直接测量 射线；射线；125125I I半衰期长半衰期长(60(60天天)、比活度高、比活度高(9
36、5%)95%)较较131131I(I(半半衰期衰期8 8天，比活度仅天，比活度仅20%)20%)更为适用。更为适用。59125125I I标记方法分类标记方法分类 直接标记法：标记含酪氨酸的化合物，可将直接标记法：标记含酪氨酸的化合物，可将125125I I直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上，此直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上，此法法操作简便，反应时间短，标记物的比活度高。操作简便，反应时间短，标记物的比活度高。间接标记法：常用环核苷酸、前列腺素等小分间接标记法：常用环核苷酸、前列腺素等小分子化合物的标记。先将子化合物的标记。先将125125I I标记在载体上，再与标记在载体上，再与蛋白质结
37、合。蛋白质结合。此法操作较复杂，标记蛋白质的此法操作较复杂，标记蛋白质的比活度也低于直接法。但标记反应较为温和，比活度也低于直接法。但标记反应较为温和，可以避免因蛋白质直接加入可以避免因蛋白质直接加入125125I I引起的生物活性引起的生物活性的丧失。的丧失。60125125I I标记物的纯化标记物的纯化 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 ：SephadexSephadex分子量分子量700 700 1 500 1 500 5 000 5 000 1500150020000 20000 型号型号G10 G10 G15 G15 G25 G25 G50 G50 分子量分子量3000300070000 700
38、00 40004000150000 150000 50005000800000 800000 50005000300000 300000 型号型号G75 G75 G100 G100 G150G150G200 G200 61125125I I标记物的鉴定标记物的鉴定 1.1.放射性化学纯度放射性化学纯度 是指结合于抗原上的放射性强度占总是指结合于抗原上的放射性强度占总放射性总强度的百分率。一般要求游离碘含放射性总强度的百分率。一般要求游离碘含量占总放射性碘的量占总放射性碘的5%5%以下。标记抗原在贮存以下。标记抗原在贮存过久后会出现标记物的脱碘，如游离碘超过过久后会出现标记物的脱碘，如游离碘超过
39、5 5则应重新纯化去除这部分游离碘。则应重新纯化去除这部分游离碘。62125125I I标记物的鉴定标记物的鉴定 2.2.免疫活性免疫活性 指标记抗原结合于抗体的放射性占指标记抗原结合于抗体的放射性占总放射性的百分率。方法是用小量的标记总放射性的百分率。方法是用小量的标记抗原加过量的抗体抗原加过量的抗体(10(10倍量倍量)，反应后分离，反应后分离结合部分结合部分(B)(B)和游离部分和游离部分(F)(F)，分别测定放，分别测定放射性，算出射性，算出B/TB/T。此值应在。此值应在8080以上，以上，该值越大，表示抗原损伤越少。该值越大，表示抗原损伤越少。63 3.3.比度：比度：指单位化学量
40、标记物中所含的放射性指单位化学量标记物中所含的放射性强度，即每分子被标记物平均所标记放射性强度，即每分子被标记物平均所标记放射性原子数目，原子数目，Ci/gCi/g、Ci/gCi/g等单位。等单位。125125I I标记物的鉴定标记物的鉴定64抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型1.1.平衡饱和法平衡饱和法 指抗原和抗体反应达到再不结合、也不解离指抗原和抗体反应达到再不结合、也不解离的平衡状态，称为饱和状态。操作时在反应管内的平衡状态，称为饱和状态。操作时在反应管内同时加入标准品同时加入标准品(或样品或样品)、标记抗原和特异性抗、标记抗原和特异性抗体，混匀后在一定温度下孵育一定时间，使三种体，混匀
41、后在一定温度下孵育一定时间，使三种成分的反应几率相同。一般来说，平衡法的反应成分的反应几率相同。一般来说，平衡法的反应时间需较长，低温（时间需较长，低温（44）或室温为）或室温为1 1天，但操作天，但操作方便，精密度较好。方便，精密度较好。65抗原抗体反应类型抗原抗体反应类型2.2.顺序加样法顺序加样法 将标准品将标准品(或样品或样品)先与抗体一同温育反应一先与抗体一同温育反应一定时间，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，定时间，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，然后加入标记抗原再短时温育，与剩余的抗体结然后加入标记抗原再短时温育，与剩余的抗体结合，最后分离合，最后分离B B与与F F。此法
42、使非标记抗原与抗体结。此法使非标记抗原与抗体结合形成复合物的几率大于标记抗原，相当于使非合形成复合物的几率大于标记抗原，相当于使非标记抗原具有较高的竞争能力，结果使剂量反应标记抗原具有较高的竞争能力，结果使剂量反应曲线的斜率增加，有利于提高分析的灵敏度。曲线的斜率增加，有利于提高分析的灵敏度。66RIA B、F分离方法分离方法1.1.第二抗体沉淀法第二抗体沉淀法 在抗原与抗体反应后加入第二抗体，形成双在抗原与抗体反应后加入第二抗体，形成双抗体复合物。但因第一抗体浓度甚低，其复合物亦抗体复合物。但因第一抗体浓度甚低，其复合物亦极少，无法进行离心分离，为此在分离时加入一定极少，无法进行离心分离，为
43、此在分离时加入一定量的与一抗同种动物的血清或量的与一抗同种动物的血清或IgGIgG，使之与第二抗，使之与第二抗体形成可见的沉淀物，与上述抗原的双抗体复合物体形成可见的沉淀物，与上述抗原的双抗体复合物形成共沉淀。经离心即可使含有结合态抗原（形成共沉淀。经离心即可使含有结合态抗原（B B）的沉淀物沉淀，与上清液中的游离标记抗原（的沉淀物沉淀，与上清液中的游离标记抗原（F F）分离。该血清或分离。该血清或IgGIgG通常称为分析试剂。通常称为分析试剂。67RIA B、F分离方法分离方法2.2.聚乙二醇（聚乙二醇（PEGPEG）沉淀法）沉淀法 是以是以PEGPEG溶液代替第二抗体作沉淀剂。在测定溶液代
44、替第二抗体作沉淀剂。在测定不含有血浆蛋白的样品时，用不含有血浆蛋白的样品时，用PEGPEG沉淀剂分离沉淀剂分离B B、F F，必须加适量蛋白或正常人混合血清，以增加蛋白的必须加适量蛋白或正常人混合血清，以增加蛋白的含量，便于沉淀。含量，便于沉淀。PEGPEG沉淀剂的主要优点是制备方沉淀剂的主要优点是制备方便、沉淀完全。缺点是非常特异性结合率比用第二便、沉淀完全。缺点是非常特异性结合率比用第二抗体为高，且温度高于抗体为高，且温度高于3030时沉淀物容易复溶。时沉淀物容易复溶。68THANK YOUSUCCESS2022-10-3069可编辑RIA B、F分离方法分离方法3.PR3.PR试剂法试剂
45、法 是一种将双抗体与是一种将双抗体与PEGPEG二法相结合的方法。二法相结合的方法。此法保持了两者的优点，节省了两者的用量，此法保持了两者的优点，节省了两者的用量，而且分离快速、简便。而且分离快速、简便。70RIA B、F分离方法分离方法4.4.活性炭吸附法活性炭吸附法 小分子游离抗原或半抗原被活性炭吸附，大分小分子游离抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子复合物留在溶液中。在抗原与特异性抗体反应后，子复合物留在溶液中。在抗原与特异性抗体反应后，加入葡聚糖活性炭。放置加入葡聚糖活性炭。放置5 510min10min，使游离抗原，使游离抗原吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中吸附在活性炭颗粒上
46、，离心使颗粒沉淀，上清液中含有结合的标记抗原。此法适用于测定类固醇激素、含有结合的标记抗原。此法适用于测定类固醇激素、强心糖苷和各种药物，因为它们是相对非极性的，强心糖苷和各种药物，因为它们是相对非极性的，又比抗原抗体复合物小，易被活性炭吸附。又比抗原抗体复合物小，易被活性炭吸附。71IRMA B、F分离方法分离方法固相分离法固相分离法 利用聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯塑料试利用聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯塑料试管（小珠）作为固相载体，将特异性抗体或管（小珠）作为固相载体，将特异性抗体或抗原直接吸附于管壁（小珠），利用固相抗抗原直接吸附于管壁（小珠），利用固相抗体或抗原分离体或抗原分离B B和和F F
47、。72RIA与与IRMA的比较的比较免疫放射分析免疫放射分析放射免疫分析放射免疫分析标记物标记物抗体抗体抗原抗原标记物用量标记物用量过量过量限量限量反应方式反应方式直接结合，反应参直接结合，反应参数与待测抗原量成数与待测抗原量成正比正比竞争性结合，反应竞争性结合，反应参数与待测抗原量参数与待测抗原量成反比成反比反应速率反应速率较快较快较慢较慢B、F分离方法分离方法固相抗体等固相抗体等第二抗体等第二抗体等特异性特异性高高较高较高灵敏度灵敏度高高较高较高73u所有试剂最好平衡到室温后加样。由于血清所有试剂最好平衡到室温后加样。由于血清标准或样品长时间保存后会出现上稀下浓现象，标准或样品长时间保存后
48、会出现上稀下浓现象，分离剂更是如此，所以试剂包括样品在内加样分离剂更是如此，所以试剂包括样品在内加样前应摇匀。前应摇匀。u不同批号的试剂最好不要混合使用。加样或不同批号的试剂最好不要混合使用。加样或溶解时，注意各试剂之间不要相互污染。溶解时，注意各试剂之间不要相互污染。放射免疫分析实验注意事项放射免疫分析实验注意事项 74u同次实验要保证所有管中加入的标记物、抗同次实验要保证所有管中加入的标记物、抗体完全一致。当一次检测大量样品时将两瓶或体完全一致。当一次检测大量样品时将两瓶或两瓶以上的标记物混合在一起后加样，以保证两瓶以上的标记物混合在一起后加样，以保证实验的一致性。实验的一致性。u抽吸上清
49、液时，应特别注意不要将沉淀抽走，抽吸上清液时，应特别注意不要将沉淀抽走，否则将严重影响测定结果的准确性。否则将严重影响测定结果的准确性。u对于药盒对于药盒(100(100管管)中提供中提供2 2瓶标记物的多肽类瓶标记物的多肽类产品，一般标记物、标准品稳定性欠佳，要求产品，一般标记物、标准品稳定性欠佳，要求现用现溶，复溶后低温冰冻保存，应尽量减少现用现溶，复溶后低温冰冻保存，应尽量减少液体状态放置的时间。液体状态放置的时间。放射免疫分析实验注意事项放射免疫分析实验注意事项 751 1、放射性（、放射性（125125 I I），对环境的污染及对身体的），对环境的污染及对身体的危害，该方法已经为重视
50、环保的国家逐步取消。危害，该方法已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）2 2、125 125 I I 的半衰期短而导致其试剂有效期短。的半衰期短而导致其试剂有效期短。3 3、标记物、标记物125125 I I 的稳定性差，导致试剂盒批间、的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。次定标，造成浪费。4 4、操作繁琐，出报告时间长。、操作繁琐，出报告时间长。5 5、无法保存备用。、无法保存备用。放放免技术的缺点免技术的缺点76u以荧光物质标记抗体进行抗原定
