1、分子诊断的其它应用分子诊断的其它应用第一节第一节 分子诊断在移植配型中的应用分子诊断在移植配型中的应用 HLA HLA的分子生物学分型的分子生物学分型 第二节第二节 分子诊断在法医学鉴定中的应用分子诊断在法医学鉴定中的应用 第三节第三节 单核苷酸多态性分析单核苷酸多态性分析 分子诊断的其它应用2第一节第一节 分子诊断在移植配型中的分子诊断在移植配型中的 应用应用HLAHLA的分子生物学分型的分子生物学分型 一、一、HLA遗传学基础遗传学基础Human leucocyte antigenHuman leucocyte antigen人类白血病抗原人类白血病抗原分子诊断的其它应用3一、一、HLAH
2、LA与器官移植与器官移植 基本概念基本概念 组织相容性组织相容性(histocompatibilityhistocompatibility)器官或组织移植时供者与受者相互接器官或组织移植时供者与受者相互接受 的 程 度,不 相 容 就 会 出 现受 的 程 度,不 相 容 就 会 出 现 排 斥 反 应排 斥 反 应(rejectionrejection),诱导排斥反应的抗原称为,诱导排斥反应的抗原称为组织相容性抗原组织相容性抗原,也称为,也称为移植抗原移植抗原。分子诊断的其它应用4主要组织相容性抗原主要组织相容性抗原(MHAMHA)|主要组织相容性抗原主要组织相容性抗原 Major Majo
3、r histocompatibilityhistocompatibility antigen antigen|次要组织相容性抗原次要组织相容性抗原|人类白细胞抗原人类白细胞抗原 HLAHLA Human leukocyte antigenHuman leukocyte antigen其中与移植排斥有关的主要为其中与移植排斥有关的主要为HLA-HLA-类和类和类抗原。类抗原。分子诊断的其它应用5主要组织相容性复合体主要组织相容性复合体(MHCMHC)编码编码MHA(MHA(在人为在人为HLA)HLA)的基因是一组呈高的基因是一组呈高度多态性的基因群,集中分布于染色体上的度多态性的基因群,集中分布
4、于染色体上的特定区域,称为特定区域,称为主要组织相容性复合体主要组织相容性复合体(major histocompatibility complexmajor histocompatibility complex,MHCMHC),),MHCMHC编码的产物称为编码的产物称为MHCMHC分子分子。分子诊断的其它应用6 抗原抗原 免疫系统免疫系统 抗原肽抗原肽MHC/分子复合物分子复合物 免疫应答免疫应答 CD4+/CD8+T细胞细胞(细胞免疫、体液免疫)(细胞免疫、体液免疫)抗原性异物排除抗原性异物排除 MHC分子为分子为T细胞分化发育所必需细胞分化发育所必需 MHC分子为免疫应答的启动和调节所必
5、需分子为免疫应答的启动和调节所必需分子诊断的其它应用7分子诊断的其它应用8(一一)MHC/HLA)MHC/HLA的基因组成的基因组成 v人类的人类的MHCMHC又称为又称为HLAHLA基因复合体基因复合体,位于第,位于第6 6对对染色体的短臂染色体的短臂6p21.36p21.3上,约上,约4000kb4000kb。vHLAHLA基因有七大类基因有七大类:即:即A A,B B,C C,D D,DRDR,DQDQ,DPDP。这七大类座位内又有不同的位点。这七大类座位内又有不同的位点。v根据编码分子的功能和分布的不同,可将根据编码分子的功能和分布的不同,可将整整个复合体的基因分成三类个复合体的基因分
6、成三类:类、类、类和类和类基因。类基因。分子诊断的其它应用9分子诊断的其它应用10分子诊断的其它应用11分子诊断的其它应用12HLA基因的分类基因的分类 分类分类 基因座位基因座位 类基因类基因 HLA-A -B -C HLA-E -F -G -H -X 类基因类基因 HLA-DP -DQ -DR HLA-DN -DO -DM 类基因类基因 位于位于和和类基因之间主类基因之间主 要编码某些补体和炎症因要编码某些补体和炎症因 子(如:子(如:C4A,C4B,C2,Bf等补体组分)等补体组分)分子诊断的其它应用13HLA抗原分布vHLA-IHLA-I类抗原类抗原分布于有核细胞表面;分布于有核细胞表
7、面;vHLA-IIHLA-II类抗原类抗原主要表达在活化的主要表达在活化的MM、B B细细胞、树突状细胞等抗原提呈细胞,血管内胞、树突状细胞等抗原提呈细胞,血管内皮细胞及活化的皮细胞及活化的T T细胞表面。细胞表面。vHLA-IIIHLA-III主要是一些补体成分:如主要是一些补体成分:如C2C2、C4C4、BfBf等。等。分子诊断的其它应用14MHC class I proteins form a functional receptor on most nucleated cells of the body.分子诊断的其它应用15There are 3 major and 2 minor M
8、HC class II proteins encoded by the HLA.The genes of the class II combine to form heterodimeric()protein receptors that are typically expressed on the surface of antigen presenting cells.分子诊断的其它应用16分子诊断的其它应用17(二)(二)HLAHLA的遗传特点的遗传特点1 1单倍型遗传单倍型遗传 haplotypehaplotypev由于一条染色体上由于一条染色体上HLAHLA各位点的距离非常近,各位点的
9、距离非常近,很少发生同源染色体之间的交换,因此亲代很少发生同源染色体之间的交换,因此亲代的的HLAHLA以单倍型为单位将遗传信息传给子代。以单倍型为单位将遗传信息传给子代。ABabGHghABGHABghababGHgh(1)(2)(3)(4)分子诊断的其它应用18分子诊断的其它应用19分子诊断的其它应用202 2共显性遗传共显性遗传 共显性共显性(co-dominanceco-dominance)是指某位点的等)是指某位点的等位基因均能同等表达,二者的编码产物都可位基因均能同等表达,二者的编码产物都可在细胞表面检测到。在细胞表面检测到。多数个体的多数个体的HLAHLA位点都是位点都是杂合子杂
10、合子,但当父,但当父亲和母亲在某位点上具有相同的等位基因时,亲和母亲在某位点上具有相同的等位基因时,其子代的这个位点就成为其子代的这个位点就成为纯合子纯合子。分子诊断的其它应用21Codominant expression of HLA genes 分子诊断的其它应用22分子诊断的其它应用233 3连锁不平衡连锁不平衡 v理论上,一个理论上,一个HLAHLA位点的等位基因与另一位点的等位基因与另一个或个或几个位点的等位基因在某一单倍型出现的频率几个位点的等位基因在某一单倍型出现的频率应等于各自频率的乘积。然而实际情况是,在应等于各自频率的乘积。然而实际情况是,在不同的地区或不同的人群,某些基因
11、相伴出现不同的地区或不同的人群,某些基因相伴出现的频率特别高,这种现象称为的频率特别高,这种现象称为连锁不平衡连锁不平衡。v已经发现某些疾病的发生与已经发现某些疾病的发生与HLAHLA复合体中某些复合体中某些特定的等位基因密切相关。特定的等位基因密切相关。分子诊断的其它应用24二、分子生物学分型法二、分子生物学分型法 1.RFLP1.RFLP与与PCR-RFLPPCR-RFLP分型法分型法 将目的基因片段将目的基因片段PCRPCR扩增后,利用多种扩增后,利用多种限限制性内切酶对扩增产物进行酶切,不同的基制性内切酶对扩增产物进行酶切,不同的基因序列会产生不同的酶切产物,从而产生不因序列会产生不同
12、的酶切产物,从而产生不同的电泳图谱。它以简单、敏感、准确,无同的电泳图谱。它以简单、敏感、准确,无需同位素等优点成为目前较常用的需同位素等优点成为目前较常用的HLAHLA基因基因分型技术之一,但是无法分辨杂合子,且只分型技术之一,但是无法分辨杂合子,且只能区分有限的多态性。能区分有限的多态性。分子诊断的其它应用252.2.PCR-SSPPCR-SSP分型法分型法 等位基因特异性等位基因特异性PCRPCR(ASPCRASPCR)设计出一整套等位基因组特异性引物设计出一整套等位基因组特异性引物(sequence specific primer,SSPsequence specific primer
13、,SSP),借助),借助PCRPCR技术获得技术获得HLAHLA型特异的扩增产物,可通过型特异的扩增产物,可通过电泳直接分析带型决定电泳直接分析带型决定HLAHLA型别,从而大大简型别,从而大大简化了实验步骤。优点是简单易行化了实验步骤。优点是简单易行,分辨率可分辨率可从低到高从低到高,成本低成本低 。缺点是不易自动化。缺点是不易自动化;不不能检测新的等位基因,试剂盒需不断升级。能检测新的等位基因,试剂盒需不断升级。分子诊断的其它应用263.3.PCR-SSCPPCR-SSCP分型法分型法 v如果二个如果二个HLAHLA等位基因存在点突变,经等位基因存在点突变,经PCRPCR扩扩增后进行聚丙烯
14、酰凝胶电泳,因其序列的差增后进行聚丙烯酰凝胶电泳,因其序列的差异形成不同的空间构象,则电泳迁移率也不异形成不同的空间构象,则电泳迁移率也不一样,如此可将它们区别开。一样,如此可将它们区别开。vPCR-SSCPPCR-SSCP作为作为PCR-SSOPCR-SSO的补充,有助于新的的补充,有助于新的HLAHLA等位基因或突变体的发现,在区分纯合子等位基因或突变体的发现,在区分纯合子和杂合子基因方面有其独到之处。和杂合子基因方面有其独到之处。分子诊断的其它应用27 vSBTSBT分型法分型法基于序列的基于序列的HLAHLA分型法分型法(S Sequence-equence-B Based HLA a
15、sed HLA T Typingyping),是通,是通过对过对扩增后的扩增后的HLAHLA基因片段进行核酸序列测定,从基因片段进行核酸序列测定,从而判断而判断HLAHLA型别的方法。型别的方法。v以上各个方法都存在一些缺陷,如能配合以上各个方法都存在一些缺陷,如能配合使使用,则能大大提高分型能力。用,则能大大提高分型能力。分子诊断的其它应用28 我国生物芯片技术获得重大突破!由军事医学科学院放射与辐射医学研究所王升启研究员领导的课题组,与深圳益生堂生物企业有限公司联合研制的HLA-DRB1分型基因芯片试剂盒,于2005年9月获得了由国家食品药品监督管理局(SFDA)颁发的新药证书和生产文号。
16、这是在国家自然科学基金重点项目和863计划的资助下,基因芯片技术应用的又一里程碑式的重大成果。分子诊断的其它应用29分子诊断的其它应用30 移植配型移植配型(又称为又称为HLAHLA配型配型/组织配型组织配型):):指在指在器官移植中检验器官移植中检验供受者供受者之间移植抗原(之间移植抗原(HLAHLA)是否相配的一系列措施。目前主要检测的是是否相配的一系列措施。目前主要检测的是ABOABO抗原系统和抗原系统和HLAHLA抗原系统。抗原系统。HLAHLA抗原系统抗原系统主要进行主要进行HLA-AHLA-A、HLA-BHLA-B和和HLA-DRHLA-DR三对位点的配型,只有两个个体的三对位点的
17、配型,只有两个个体的HLAHLA配型完全相同才能进行造血干细胞移植,配型完全相同才能进行造血干细胞移植,否则会发生移植排斥反应否则会发生移植排斥反应 。分子诊断的其它应用31v理论上说,同胞兄弟姐妹中有理论上说,同胞兄弟姐妹中有1/41/4的机会的机会HLAHLA配配型型完全相合完全相合;子女与父母之间只有一半;子女与父母之间只有一半HLAHLA抗抗原相同,医学上叫做原相同,医学上叫做半相合半相合,通常不能,通常不能相互移相互移植。所以骨髓移植主要在同胞兄弟姐妹之间进植。所以骨髓移植主要在同胞兄弟姐妹之间进行。行。v常见的常见的HLAHLA分型,在分型,在300300500500人就可以找到相
18、人就可以找到相同者,少见的同者,少见的HLAHLA分型可能是万分之一的机率,分型可能是万分之一的机率,而罕见的就要到几万甚至几十万的人群中寻找。而罕见的就要到几万甚至几十万的人群中寻找。分子诊断的其它应用32分子诊断的其它应用33 HLAHLA抗原系统抗原系统可通过可通过血清学方法血清学方法、细胞学细胞学方法方法、分子生物学方法分子生物学方法来检测来检测。血清学分型血清学分型借助的是借助的是微量淋巴细胞毒试验微量淋巴细胞毒试验或称或称补体依赖的细胞毒试验补体依赖的细胞毒试验。取已知。取已知HLAHLA抗血抗血清加入待测外周血淋巴细胞,作用后加入兔清加入待测外周血淋巴细胞,作用后加入兔补体,充分
19、作用后加入染料,着染的细胞为补体,充分作用后加入染料,着染的细胞为死亡细胞,依据特异性抗体介导的补体系统死亡细胞,依据特异性抗体介导的补体系统对靶细胞溶解的原理,待检淋巴细胞表面具对靶细胞溶解的原理,待检淋巴细胞表面具有已知抗血清所针对的抗原。有已知抗血清所针对的抗原。分子诊断的其它应用34v细胞学分型技术细胞学分型技术指的是通过指的是通过纯合分型细纯合分型细胞及胞及预致敏淋巴细胞试验预致敏淋巴细胞试验对对HLAHLA分型。二种方法的分型。二种方法的基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己基本原理均是判断淋巴细胞在识别非己HLAHLA抗抗原决定簇后发生的增殖反应。由于分型细胞原决定簇后发生的增殖反应
20、。由于分型细胞来源困难以及操作繁琐,细胞学分型技术正来源困难以及操作繁琐,细胞学分型技术正逐渐被淘汰。逐渐被淘汰。流式细胞术流式细胞术取之取之 v分子生物学分型法分子生物学分型法利用利用PCRPCR技术将少量目的技术将少量目的DNADNA大量扩增,然后再进行产物鉴定的方法,大量扩增,然后再进行产物鉴定的方法,特点是灵敏度高,应用范围广等特点。特点是灵敏度高,应用范围广等特点。分子诊断的其它应用35 1)ABOABO血型相容试验:血型相容试验:2)淋巴细胞毒交叉试验(淋巴细胞毒交叉试验(MLR):):+不宜移植不宜移植 受者血清受者血清+供者淋巴细胞供者淋巴细胞 -可行可行 3)HLA定型或配型
21、试验定型或配型试验 非家庭配型:表现型相同非家庭配型:表现型相同 MHCII(HLA-DR)配合优于配合优于MHCI类类 HLA-DR和和HLA-DQ间的连锁不平衡间的连锁不平衡分子诊断的其它应用36分子诊断的其它应用37第二节第二节 分子诊断分子诊断在法医学鉴定中的应用在法医学鉴定中的应用v提要:提要:一、一、PCRPCR技术在法医鉴定中的应用技术在法医鉴定中的应用 二、二、DNADNA指纹图谱技术指纹图谱技术 三、三、STRSTR位点分析位点分析 四、四、DNADNA数据库的建立与数据库的建立与 DNA数据交换数据交换 五、性别鉴定与五、性别鉴定与Y Y基因检测基因检测 分子诊断的其它应用
22、38v分子生物学的优点:分子生物学的优点:(1 1)检材广泛,稳定性高)检材广泛,稳定性高 (2 2)方法灵敏)方法灵敏 (3 3)高概率认定)高概率认定 分子诊断的其它应用39一、一、PCRPCR技术在法医鉴定中的应用技术在法医鉴定中的应用v亲子鉴定亲子鉴定:指在对父母和子女之间的亲生:指在对父母和子女之间的亲生关系(或称为生物学关系)有所怀疑时,关系(或称为生物学关系)有所怀疑时,进行遗传关系方面的检查,以便确定亲子进行遗传关系方面的检查,以便确定亲子关系是否存在,又称为关系是否存在,又称为亲权鉴定亲权鉴定。v个体识别个体识别:又称个人同一认定又称个人同一认定 。v虽然二者的鉴定目标不同,
23、但使用的方法虽然二者的鉴定目标不同,但使用的方法是一样的。是一样的。分子诊断的其它应用40DNA提取 如果相匹配,将HLA分型与群体数据库进行比较 发出案例报告,并给出随机匹配的概率 DNA定量 多个STR标记PCR扩增 待检样本HLA分型与其它结果的比较 PCR产物的分离与鉴定 确定HLA分型 图图15-1 15-1 生物物证分析中生物物证分析中HLAHLA基因分型鉴定流程图基因分型鉴定流程图分子诊断的其它应用41二、二、DNADNA指纹图谱技术指纹图谱技术v一个一个DNADNA指纹能同时检测十几个甚至几十指纹能同时检测十几个甚至几十个位点的变异,反映的基因组信息非常个位点的变异,反映的基因
24、组信息非常丰富丰富 v DNADNA指纹图谱由多个高变位点上的等位指纹图谱由多个高变位点上的等位基基因形成,具有更高的特异性因形成,具有更高的特异性 v严格遵循孟德尔遗传规律,遗传性简单严格遵循孟德尔遗传规律,遗传性简单稳定稳定 v DNADNA指纹图谱具有体细胞稳定性指纹图谱具有体细胞稳定性分子诊断的其它应用42三、三、STR位点分析位点分析vSTRs 是首选的群体遗传学和法医学研究的遗传标是首选的群体遗传学和法医学研究的遗传标志物志物 v美国联邦数据库美国联邦数据库(Combined DNA Index System,CODIS)公布的)公布的13个个STR位点位点:D3S1358、VWA
25、、FGA、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、THO1、TPOX、CSF1PO AMEL(性别确定基因)性别确定基因)分子诊断的其它应用43分子诊断的其它应用44分子诊断的其它应用46分子诊断的其它应用47分子诊断的其它应用48分子诊断的其它应用49分子诊断的其它应用50AMEL(性别确定基因)性别确定基因)The gene for amelogenin()can be used in sex determination of samples from unknown human origin through the Poly
26、merase Chain Reaction(PCR).Using primers specific for intron 1 of the gene,the gene sequence for the intron can be amplified.The X chromosome gene,AMELX,gives rise to a 106 bp amplification product(amplicon)and the Y chromosome gene,AMELY,a 112 bp amplicon.Hence,the AMELX contains a 6 bp deletion in
27、 the intron 1.分子诊断的其它应用51分子诊断的其它应用52优势优势vCODIS已经广泛地应用于法医已经广泛地应用于法医DNA分析分析 vSTR等位基因可以采用商业化试剂盒进行快等位基因可以采用商业化试剂盒进行快速检测速检测 v其数字化信息适于建立计算机资料库其数字化信息适于建立计算机资料库 v全球化的实验室可以促进分析不同人群的全球化的实验室可以促进分析不同人群的STR等位基因频率等位基因频率 v可以用很微量的可以用很微量的DNA进行进行STR分析分析分子诊断的其它应用53STR位点分析的检测方法位点分析的检测方法v直接荧光标记后进行毛细管电泳直接荧光标记后进行毛细管电泳 vPC
28、R-RFLP vPCR-单链构象多态性(单链构象多态性(PCR-SSCP)v探针杂交等多种方法探针杂交等多种方法 分子诊断的其它应用54四、四、DNA数据库的建立与数据库的建立与 DNA数据交换数据交换分子诊断的其它应用55五、性别鉴定与五、性别鉴定与Y基因检测基因检测vY基因检测试剂盒基因检测试剂盒 v同时检测同时检测7个多态性位点:个多态性位点:DYS390、DYS389、DYS385、DYS19、DYS389、DYS391、DYS392 操作简单操作简单 方便更科学地识别人种和族谱方便更科学地识别人种和族谱 帮助识别亲属关系,包括远亲帮助识别亲属关系,包括远亲 能快速识别混合样本中的男性
29、基因能快速识别混合样本中的男性基因 可利用法医基因数据库进行基因物证鉴定可利用法医基因数据库进行基因物证鉴定 分子诊断的其它应用56六、线粒体六、线粒体DNA分析分析 优势优势 v母系遗传母系遗传 v进化速度快进化速度快 v突变率高等突变率高等1灵敏性高 2准确性高 3多态性丰富分子诊断的其它应用57 通过对刑事案件现场遗留的生物检材进行线通过对刑事案件现场遗留的生物检材进行线粒体粒体DNA测序或者片段分析:测序或者片段分析:直接认定或否定犯罪嫌疑人直接认定或否定犯罪嫌疑人 认定死亡时年龄认定死亡时年龄 进行性别鉴定进行性别鉴定 分子诊断的其它应用58思考题思考题v分子诊断在移植配型中的应用分子诊断在移植配型中的应用 v分子诊断在法医学鉴定中的主要应用分子诊断在法医学鉴定中的主要应用分子诊断的其它应用59