1、分子诊断策略与常用分子诊断策略与常用技术技术一、分子诊断的概念和特点一、分子诊断的概念和特点 概念：概念：利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，利用现代分子生物学和分子遗传学的技术和方法，通过检测基因结构或其表达水平是否正常，从而对人通过检测基因结构或其表达水平是否正常，从而对人体健康状态和疾病作出诊断的方法。体健康状态和疾病作出诊断的方法。传统的诊断：表现型传统的诊断：表现型基因型基因型 基基 因因 诊诊 断：基因型断：基因型表现型表现型 （逆向诊断）逆向诊断）2分子诊断策略与常用技术特点特点特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高早期诊断性早期诊断性 适应性强适应性强一、分子诊断的概念和特点
2、一、分子诊断的概念和特点检测致病基因突变；分析与疾病连锁的遗传标志；建立检测致病基因突变；分析与疾病连锁的遗传标志；建立多基因疾病表型克隆；定量分析致病基因的表达水平多基因疾病表型克隆；定量分析致病基因的表达水平 已明确疾病表型与基因型的关系已明确疾病表型与基因型的关系分子诊断的前提分子诊断的前提3分子诊断策略与常用技术二、分子诊断策略二、分子诊断策略直接诊断直接诊断直接检测致病基因的突变直接检测致病基因的突变 基因突变类型基因突变类型缺失、点突变、重复、插入等缺失、点突变、重复、插入等间接诊断间接诊断应用应用DNADNA多态性为遗传标记进行连锁分析，多态性为遗传标记进行连锁分析，确定待测者是
3、否得到带有致病的染色体，从而间接地作出确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出诊断诊断 DNADNA多态多态RFLPRFLP、VNTRVNTR、SNPSNP4分子诊断策略与常用技术DNADNA多态（多态（DNA PolymorphismDNA Polymorphism）。DNADNA分析中常用的遗传性多态性标记有分析中常用的遗传性多态性标记有3 3类：类：1 1）称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2 2）：如：如STRSTR其重复次数在人群中存在其重复次数在人群中存在变异，形成多态即变异，形成多态即 VNTR，为第二代多态性标记；
4、，为第二代多态性标记；3 3）：发生在基因组中的单个核苷酸的替：发生在基因组中的单个核苷酸的替代，为第三代多态性标记。代，为第三代多态性标记。二、分子诊断策略二、分子诊断策略5分子诊断策略与常用技术三、分子诊断常用技术三、分子诊断常用技术n核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术n等位基因特异寡核苷酸探针等位基因特异寡核苷酸探针(allele(allele specific oligonucleotide,ASO)specific oligonucleotide,ASO)nDNADNA限制性长度多态性限制性长度多态性(restriction(restriction fragment length po
5、lymorphism,RLFP)fragment length polymorphism,RLFP)分析分析nPCR-SSCPPCR-SSCPnDNADNA测序测序 nDNADNA芯片技术芯片技术 6分子诊断策略与常用技术点突变（点突变（C to T）5335G53引物引物1引物引物2探针探针1探针探针2A等位基因特异寡核苷酸探针（等位基因特异寡核苷酸探针（ASOASO）7分子诊断策略与常用技术RLFP分析法分析法9分子诊断策略与常用技术RFLPRFLP分析分析 优点优点 分辩率高，无需标记分辩率高，无需标记,重复性好，简便快速直观重复性好，简便快速直观 主要用于核酸变异分析比较主要用于核酸变
6、异分析比较,微生物的分群分型，微生物的分群分型，癌基因分析，遗传病的诊断等。癌基因分析，遗传病的诊断等。局限局限 只能应用突变引起限制性酶切位点改变筛选，检测只能应用突变引起限制性酶切位点改变筛选，检测效率低。效率低。10分子诊断策略与常用技术 原理原理 将经扩增的将经扩增的DNADNA片段变性形成单链，由于序列不同，单片段变性形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率链构象就有差异，在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无变异。优点优点 检测基因变异，具有操作简便、快速特点，不需
7、特殊设检测基因变异，具有操作简便、快速特点，不需特殊设备，适用于大样本筛选。备，适用于大样本筛选。己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失突变，基因的多态性分析等。基因的多态性分析等。PCR/PCR/单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（SSCPSSCP）11分子诊断策略与常用技术（PCR-SSCPPCR-SSCP）示意图）示意图12分子诊断策略与常用技术DNADNA测序测序13分子诊断策略与常用技术DNA自动测序结果举例14分子诊断策略与常用技术DNADNA芯片技术芯片技术15分子诊断策略与常用技术四、分子诊断的应用及举例四、分子诊断的
8、应用及举例n遗传疾病遗传疾病n肿瘤肿瘤n感染性疾病感染性疾病n判断个体疾病易感性判断个体疾病易感性n器官移植组织配型器官移植组织配型n法医学中个体识别、亲子鉴定法医学中个体识别、亲子鉴定16分子诊断策略与常用技术Mst酶切位点酶切位点(CCTNAGG)5 3 正常基因正常基因5 3 突变基因突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析G GA AG G G GT TG G 谷谷AaAa缬缬AaAa17分子诊断策略与常用技术0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带着突变携带着患者患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性
9、酶切分析镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析18分子诊断策略与常用技术 Normal Normal Gene ProbeGene Probe与正常与正常 Probe Probe 杂交稳定杂交稳定 Mutation Mutation S S Gene Probe Gene Probe与异常与异常 S S杂交杂交 稳定稳定镰状红细胞贫血患者基因组的镰状红细胞贫血患者基因组的ASOASO探针杂交探针杂交19分子诊断策略与常用技术斑点杂交结果：斑点杂交结果：镰状红细胞贫血患者基因组的镰状红细胞贫血患者基因组的ASOASO探针杂交探针杂交/S S/S/S S/S正常探针正常探针异常探针异常探针20分子诊断策略与常用技术正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变Leber 病患者病患者 PCR/SSCP分析分析+21分子诊断策略与常用技术
