1、10/31/20221F分析方法的设计依据分析方法的设计依据F分析方法建立的一般步骤分析方法建立的一般步骤F分析方法验证的内容与要求分析方法验证的内容与要求F体内药物分析应用示例体内药物分析应用示例本章内容提要本章内容提要第四章 分析方法的建立与验证10/31/20222第一节第一节 分析方法的设计依据分析方法的设计依据建立分析检测方法的主要依据建立分析检测方法的主要依据 待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况 分析测定的目的与要求分析测定的目的与要求 生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法 实验室条件实验室条件第四章 分析方法的建立与验
2、证10/31/20223一、一、待测药物的理化性质及体内存在状况待测药物的理化性质及体内存在状况准确测定准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物生物样品中的药物或其特定代谢物预处理预处理待测物待测物从结合物或缀合物中从结合物或缀合物中释放释放选择样品选择样品预处理方法预处理方法首先应考虑首先应考虑待测药物的待测药物的理化性质理化性质药物在生物体内的药物在生物体内的存在状况存在状况药物在生物体内的药物在生物体内的生物转化生物转化(代谢代谢)途径途径第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据10/31/20224(一一)待测药物的理化性质待测药物的理化性质药物的药物的pKa值、亲脂性、溶
3、解度、分配系数等值、亲脂性、溶解度、分配系数等预处理及检测方法预处理及检测方法具有具有亲脂性亲脂性在适当的在适当的pH值下用值下用溶剂萃取溶剂萃取具有具有强极性或亲水性强极性或亲水性沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取衍生化后萃取等等具有具有挥发性挥发性GC测定法测定法具有具有光谱或电化学特性光谱或电化学特性分析检测方法分析检测方法药物的药物的稳定性稳定性萃取浓缩技术萃取浓缩技术对酸碱不稳定对酸碱不稳定避免使用强酸或强碱性溶剂避免使用强酸或强碱性溶剂对热不稳定对热不稳定避免高温蒸发溶剂避免高温蒸发溶剂第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据
4、10/31/20225(二二)待测药物的体内存在状态待测药物的体内存在状态与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低分离萃取方法分离萃取方法蛋白结合较强蛋白结合较强不宜直接采用溶剂萃取不宜直接采用溶剂萃取体内浓度高低体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物代谢过程及其代谢产物分析检测技术分析检测技术浓度较低浓度较低（尤其有（尤其有代谢产物代谢产物共存）共存）代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定采用采用LC-MS、EIA等分析检测技术等分析检测技术 第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据10/31/20226二、分析测定
5、的目的与要求二、分析测定的目的与要求体内药物分析的目的体内药物分析的目的影响影响分析方法分析方法的应用的应用药代动力学药代动力学研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物要求要求 同时测定原形药物和代谢产物同时测定原形药物和代谢产物检测检测 宽线性范围宽线性范围(CmaxCmax的的1/20)、高灵敏度高灵敏度(10-9g/ml)和高专属和高专属 性性(分离能力分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离原形药物及其代谢产物的分离)方法方法 不必强调方法的简便、快速；不必强调
6、方法的简便、快速；大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据10/31/20227二、分析测定的目的与要求二、分析测定的目的与要求临床治疗药物监测临床治疗药物监测 有效治疗浓度范围内药物浓度有效治疗浓度范围内药物浓度方法方法尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定大多采用大多采用UV、RIA或或EIA等等中毒患者的临床抢救中毒患者的临床抢救 药物浓度极高药物浓度极高方法方法不必强调方法的灵敏度，强调方法的不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性特
7、异性和和分析速度分析速度大多采用色谱及其联用技术大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或或EIA第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据10/31/20228三、生物样品的类型与预处理方法三、生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法生物样品的类型与预处理方法决定决定分析方法分析方法的应用的应用以血浆或血清为分析样品以血浆或血清为分析样品采用采用蛋白沉淀蛋白沉淀-溶剂萃取溶剂萃取预处理技术预处理技术分析样品较为分析样品较为“干净干净”，可用，可用HPLC检测检测用用RIA分析分析样品的预处理方法可较为样品的预处理方法可较为粗放粗放经过简单的蛋白沉淀或不经任何预
8、处理经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定直接测定第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据10/31/20229四、实验室条件四、实验室条件在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。器装备，合理选择可行的分析方法。第四章 分析方法的建立与验证第一节 分析方法的设计依据10/31/202210第二节第二节 分析方法分析方法建立的一般步骤建立的一般步骤 第四章 分析方法的建立与验证10/31/202211一、分析方法的选择一、分析方
9、法的选择体内药物分析方法的设计体内药物分析方法的设计生物样品中的生物样品中的药物浓度药物浓度决定分析方法的决定分析方法的首要因素首要因素生物样品中药物或其特定代谢产物的生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少浓度低、样品量少难以通过难以通过增加取样量增加取样量提高方法灵敏度提高方法灵敏度通过通过选择适当的分析方法选择适当的分析方法适应样品分析需求适应样品分析需求体内药物分析中常用分析方法体内药物分析中常用分析方法特点见特点见表表4-14-1第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤10/31/202212二、分析方法的建立二、分析方法的建立 分析方法建立之前分析方法建立之前
10、查阅文献资料查阅文献资料充分了解药物在体内的充分了解药物在体内的动力学过程，动力学过程，使所使所拟定的分析方法拟定的分析方法避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定避免受到代谢产物的干扰适用于实际生物样品测定第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤10/31/202213二、分析方法的建立二、分析方法的建立 初步拟定分析方法后初步拟定分析方法后进行一系列试验工作进行一系列试验工作选择最佳分析条件选择最佳分析条件同时同时验证分析方法的可行性验证分析方法的可行性确认是否适用于实际生物样品确认是否适用于实际生物样品F 分析方法的分析方法的建立建立和和验证验证过程过程是不可截然划分的
11、是不可截然划分的 为便于讨论而分别叙述为便于讨论而分别叙述F 分析方法的建立步骤分析方法的建立步骤第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤10/31/202214(一一)检测条件的筛选检测条件的筛选标准物质标准物质 照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定 确定最佳分析检测条件确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度检测灵敏度HPLC 调整检测器检测器(类型、条件)色谱柱色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)流动相流动相(组分及其配比)及其流速 柱温柱温、进样量进样量、内标物质内标物质的浓度及其加入量等 使各物质具有足够的足够的方法灵敏度方法灵敏度(LOQ)良好
12、的良好的色谱参数色谱参数(n、R、T)适当的适当的保留时间保留时间(tR)第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤10/31/202215(二二)分离条件的筛选分离条件的筛选在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：1空白溶剂试验空白溶剂试验 溶剂(方法特异性方法特异性)2空白生物基质试验空白生物基质试验 endogenous compounds(方法特异性方法特异性)3模拟生物样品试验模拟生物样品试验 方法效能指标方法效能指标4实际生物样品测试实际生物样品测试 代谢产物(方法特异性方法特异性)第四章 分析方法的建立与验证第二节 分
13、析方法的建立步骤10/31/2022161空白溶剂试验空白溶剂试验待测药物的非生物基质溶液非生物基质溶液（通常为水溶液）采用拟定的分析方法进行拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等 样品预处理预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等）测定响应信号响应信号（如HPLC峰面积或峰高）考察目标考察目标方法的特异性特异性空白值应尽可能小，并能有效校正第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤10/31/202217色谱分析法色谱分析法可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），甚至检
14、测器类型检测器类型空白试剂信号应不干扰药物的测定不干扰药物的测定（如R1.5）本步骤主要考察本步骤主要考察需经化学反应需经化学反应的预处理过程的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验 第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤10/31/2022182.空白生物基质试验空白生物基质试验空白生物基质空白生物基质 (blank biological matrix)如空白血浆空白血浆照“1.空白溶剂试验空白溶剂试验”项下方法操作考察目标考察目标生物基质中内源性物质内源性物质对测定的干扰对测定的干扰（方法特异性）在待测药物(或特定的活性代
15、谢物、内标物质等)的“信号窗信号窗”（信号附近的有限范围）内不应出现内源性物质信号内源性物质信号第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤10/31/2022193.模拟生物样品试验模拟生物样品试验模拟生物样品模拟生物样品(质量控制质量控制,QC样品样品)空白生物基质中加入待测药物照“1.空白溶剂试验空白溶剂试验”项下方法操作考察目标考察目标方法的线性范围线性范围、精密度与准确度精密度与准确度、灵敏度灵敏度 药物的萃取回收率萃取回收率等各项技术指标同时进一步进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性方法特异性第四章 分析方法的建立与验证第
16、二节 分析方法的建立步骤10/31/202220色谱分析法色谱分析法进一步考察待测药物(或内标物)与内源性物质(或其它药物)的分离情况分离情况色谱峰的 tR、n 和 T 是否与水溶液的一致一致 色谱峰是否为单一成分单一成分 标准曲线的截距是否显著偏离零点偏离零点等内源性物质内源性物质是否对待测药物或内标物质是否对待测药物或内标物质构成干扰构成干扰第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤10/31/2022214.实际生物样品的测试实际生物样品的测试空白生物基质和模拟生物样品试验确定的分析方法及其条件不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白
17、结合物血浆蛋白结合物)或代谢生成数个代谢产物代谢产物及其进一步的结合物结合物(或缀合物)实际生物样品实际生物样品确立分析方法后，确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试尚需进行实际生物样品的测试考察目标考察目标代谢产物代谢产物对药物、内标物质的干扰干扰情况进一步验证方法的可行性验证方法的可行性第四章 分析方法的建立与验证第二节 分析方法的建立步骤10/31/202222第三节第三节 分析方法分析方法验证的内容与要求验证的内容与要求用于实际生物样品分析之前验证验证(validation)分析方法的可行性可行性与与可靠性可靠性方法验证时应考虑影响分析方法所有可变因素(采样,样品制备,色谱分离,检
18、测与数据评价等)使用的技术指标技术指标效能指标效能指标使用的样品样品通常采用模拟生物样品模拟生物样品和用药后的实际生物样品实际生物样品第四章 分析方法的建立与验证10/31/202223验证步骤验证步骤首先为分析方法分析方法的验证 特异性、精密度与准确度、回收率特异性、精密度与准确度、回收率定量限与检测限、溶液稳定性定量限与检测限、溶液稳定性其次为生物基质中生物基质中待测药物稳定性稳定性的验证 室温放置、冷冻（或冷藏）、冻室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环融循环第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202224验证的效能指标与基本要求验证的效能指标与基本要求1特
19、异性特异性避免干扰避免干扰2标准曲线与线性范围标准曲线与线性范围覆盖所有浓度范围覆盖所有浓度范围3准确度准确度与实际状况相符与实际状况相符4精密度精密度结果可重现结果可重现5定量限定量限达到峰浓度的达到峰浓度的1/101/206稳定性稳定性确保所有样品准确测定确保所有样品准确测定7提取回收率提取回收率确保准确度确保准确度第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202225一、方法特异性一、方法特异性(专属性或选择性专属性或选择性)方法的特异性方法的特异性(specificity)又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用系指当有内源性物质存在时，
20、方法准确测定待测物质的能力系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力专属性表示所检测的信号信号(响应)系属于待测药物所特有待测药物所特有的选择性系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区区分分(分离分离)的能力的能力特异性特异性函盖二者，以验证验证所测定的物质与待测药物的同一性同一性考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022261.1.内源性物质的干扰内源性物质的干扰比较比较待测药物或其活性代谢产物待测药物或其活性代谢产物检测信号检测信号对照品（或标准品）空白生物基质模拟生物样品（空白生物基质中
21、添加对照品）如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致 及与内源性物质色谱峰的 R确证确证内源性物质对分析方法有无内源性物质对分析方法有无干扰干扰第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022272.2.代谢产物的干扰代谢产物的干扰比较比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号检测信号与代谢产物(在实际样品中 tR 随随时间延长而增加)的 R如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 或改变色谱条件(色谱柱)再比较确证确证其它代谢产物对分析方法有无其它代谢产物对分析方法有无干扰干扰结构已知的特定活性代谢物的测定结构已知的特定
22、活性代谢物的测定必要时通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性对于结构未知的代谢产物的测定对于结构未知的代谢产物的测定可采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022283.3.伍用药物的干扰伍用药物的干扰TDM 时时还要考虑患者可能同时服用药物还要考虑患者可能同时服用药物(通常为数有限通常为数有限)的干扰的干扰 比较比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号检测信号如HPLC色谱峰的 tR、n 和 T 是否一致确证确证同时服用药物对分析方法的干扰情况干扰情况第四章 分析方法的
23、建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022294.4.与参比方法的相关性与参比方法的相关性除上述方法外，有时还可使用除上述方法外，有时还可使用参比方法对照参比方法对照参比方法参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法如在TDM中使用UV(或RIA)时,可以HPLC(或GC)为参比参比方法测定结果为横坐标参比方法测定结果为横坐标(X);拟定方法结果为纵坐标拟定方法结果为纵坐标(Y)用最小二乘法计算回归方程 YabX (坐标标度相等)相关系数相关系数(r)表示两种方法测得结果的一致性若若 r 1，表示拟定方法为非线性表示拟定方法为非线性，如 RIA 中抗血清滴度选择不
24、当第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022304.4.与参比方法的相关性与参比方法的相关性YabX截距截距(a)表示拟定方法受到恒定干扰恒定干扰的程度内源性物质(UV)斜率斜率(b)表示拟定方法受到比例干扰比例干扰的程度标记抗原不纯(RIA)与参比方法的相关性比较与参比方法的相关性比较除显示分析方法的特异性外斜率斜率b表示两种方法测得结果的一致性表示两种方法测得结果的一致性若参比方法准确度良好若参比方法准确度良好若截距若截距a0,则拟定方法的则拟定方法的准确度准确度(回收率回收率)为为100b(%)第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10
25、/31/202231二、标准曲线与线性范围二、标准曲线与线性范围标准曲线标准曲线（standard curve）calibration curve or working curve生物样品中所测定药物浓度与响应的生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性相关性（比例的程度）（比例的程度）通常用回归分析方法所得的通常用回归分析方法所得的回归方程回归方程来评价来评价除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式线性模式回归分析法为回归分析法为最小二乘法最小二乘法（least squares）或或加权最小二乘法加权最小二乘法（weighted least s
26、quares）线性范围线性范围（linear rang）标准曲线的标准曲线的最高最高与与最低最低浓度的区间浓度的区间模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202232二、标准曲线与线性范围二、标准曲线与线性范围(续续)标准曲线标准曲线用用模拟生物样品模拟生物样品建立建立线性范围线性范围(不包括不包括零点零点)应能应能覆盖全部生物样品覆盖全部生物样品中的药物浓度中的药物浓度不能使用不能使用外推的方法外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度求算未知生物样品中的药物浓度
27、建立标准曲线所使用的模拟生物样品建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待测的含药生物样品应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质相同的生物基质制备制备第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202233标准曲线的一般建立方法标准曲线的一般建立方法 1.标准系列溶液标准系列溶液(非生物基质溶液非生物基质溶液)的的制备制备溶剂溶剂水或甲醇水或甲醇（或其他适当溶剂）（或其他适当溶剂）浓度浓度标准模拟生物样品中药物浓度的标准模拟生物样品中药物浓度的 50倍以上倍以上 加入量为生物样品总体积的加入量为生物样品总体积的 2%以下以下 避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异
28、避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异浓度较低浓度较低应应除去溶剂除去溶剂后再加入生物基质后再加入生物基质 否则否则,在实际样品测定时应在实际样品测定时应加入等体积的溶剂加入等体积的溶剂并涡旋混匀并涡旋混匀 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022342.2.标准系列溶液的浓度范围标准系列溶液的浓度范围至少含至少含58个浓度点个浓度点(不包括零点不包括零点,即空白即空白)可可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度覆盖全部待测生物样品中的药物浓度如：如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式等比梯度模式比例常数约为比例常数约为 2)若体内平均达峰浓度
29、为若体内平均达峰浓度为50，其，其1/20为为2.5设定最高浓度为设定最高浓度为100，最低浓度为，最低浓度为1(个体差异个体差异)实际制备时：实际制备时：500、250、100、50、20、10 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022353.3.标准系列模拟生物样品的制备标准系列模拟生物样品的制备 空白生物基质空白生物基质(如血浆如血浆)加入标准系列溶液适量，涡旋混匀加入标准系列溶液适量，涡旋混匀为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失先加入标准溶液先加入标准溶液 再加入空白生物基质再加入空白生物基质 涡旋混匀
30、涡旋混匀 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022364.4.标准曲线的绘制标准曲线的绘制以待测药物的检测响应以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高如色谱峰面积或峰高)或与内标物质的检或与内标物质的检测响应的比值测响应的比值(内标法内标法)(因变量因变量,y)对模拟血药浓度对模拟血药浓度(自变量自变量,x)求得回归方程求得回归方程(yabx)及其相关系数及其相关系数()在一组由至少在一组由至少7个浓度个浓度(不包括零点不包括零点)构成的标准曲线中，构成的标准曲线中，至多可至多可有有2个浓度点数据，可予剔除。个浓度点数据，可予剔除。但应有确切原因，如：但应有
31、确切原因，如：样品处理有损失、色谱图有问题，或样品处理有损失、色谱图有问题，或显著偏离标准曲线显著偏离标准曲线该数据参与标准曲线回归后，计算该数据参与标准曲线回归后，计算QC样品或返算该点浓度时显著偏离其标称浓度样品或返算该点浓度时显著偏离其标称浓度(配制浓度配制浓度)其余其余应有至少应有至少5个浓度点在标准曲线上个浓度点在标准曲线上第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022375.5.加权最小二乘法加权最小二乘法最小二乘法最小二乘法每个浓度点每个浓度点绝对误差绝对误差(yiyi)赋予同等的重要性赋予同等的重要性 标准曲线上的高低浓度相差悬殊标准曲线上的高低浓
32、度相差悬殊(范围达范围达102)低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求加权最小二乘法加权最小二乘法回归计算时增加一个回归计算时增加一个权重因子权重因子(w)各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小式中，式中，wi为标准曲线上第为标准曲线上第i个浓度点的权重因子个浓度点的权重因子2iiiyyy2)(iiiyyw2)(iiyy第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022381）回归方程）回归方程(y=a+b x)参数的计算参数的计算22biiiiiiiiiiii
33、ixwxwwywxwyxww222aiiiiiiiiiiiiiixwxwwyxwxwywxwiiiiiwxwywba 或，22/riiiiiiiiiiwywywwywbxaw第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022392）权重因子的选择）权重因子的选择加权加权赋予低浓度点以更大的权重赋予低浓度点以更大的权重在实际工作中的一般方法在实际工作中的一般方法当当wi=1/(yi)2时，则时，则而而yi与与xi成正比成正比所以，令所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2(通常取通常取wi=1/C2)当当高浓度点高浓度点测量值的准确度测量值的准确度下降过大下降过大低浓
34、度点权重过大，低浓度点权重过大，降低降低低浓度点的低浓度点的权重权重，wi=k/xi2)(iiiyyw2iiiyyy第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202240标准曲线的标准曲线的限度要求限度要求药代动力学或生物利用度研究药代动力学或生物利用度研究标准曲线至少包括标准曲线至少包括5个浓度个浓度(通常为通常为58个浓度个浓度,不包括零点不包括零点)最高浓度应高于达峰浓度最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于最低浓度应低于Cmax的的10%5%，并应为方法的，并应为方法的LOQ(非非LOD)回归方程的截距应接近于零回归方程的截距应接近于零相关系数要求
35、相关系数要求 0.99(色谱法色谱法)或或0.98(生物学方法生物学方法)若非线性，可分为高低若非线性，可分为高低两个浓度区间两个浓度区间(每个区间不少于每个区间不少于5个浓个浓度度)，分别加权回归，分别加权回归如如1、2、5、10、20和和10、20、50、100、200第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202241三、准确度三、准确度方法准确度方法准确度(accuracy)系指用该方法系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度度的接近程度应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的应使用
36、实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定所以，通常使用模拟生物样品测定一般用一般用相对回收率相对回收率(relative recovery，RR)或或 相对误差相对误差(relative error，RE)表示表示第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022421.1.测定法测定法取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，用标准曲线计算用标准曲线计算在标准曲线范围内制备质控在标准曲线范围内制备质控(quality control，QC)样品样品高高(接近上限接近
37、上限)、中、低、中、低(接近接近LOQ)3个浓度个浓度每一浓度至少每一浓度至少5个样本个样本与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次次 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022432.2.结果计算与限度要求结果计算与限度要求计算计算测定值测定值M(measured)平均值与理论浓度平均值与理论浓度(加入值加入值)A(added)比值比值相对回收率相对回收率相对误差相对误差限度要求限度要求相对回收率应在相对回收率应在85%115%(LOQ附近附近80%120%)RE在在15%(LOQ附近为附近为20%
38、)）（%100AMRR）（）（%100%100RRAAMRE第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202244四、精密度四、精密度方法精密度方法精密度(precision)系指每次测定结果与多次测定的平均值的系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度偏离程度表示该分析方法的表示该分析方法的可重复性可重复性(reproducibility)反映分析方法的反映分析方法的可操作可操作性，是方法验证的基本要点之一性，是方法验证的基本要点之一实际生物样品的量有限实际生物样品的量有限(如血浆，一般为如血浆，一般为0.52ml)使用模拟生物样品测定使用模拟生物样品测定 第四章
39、 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022451.1.表示方法表示方法方法精密度一般用标准偏差方法精密度一般用标准偏差(standard deviation，SD)或或相对标准相对标准偏差偏差(relative standard deviation，RSD)表示表示 SD=RSD=包括批内包括批内(within-run或或intra-assay)RSD日内日内(within-day)和批间和批间(between-run或或inter-assay)RSD日间日间(between-day，day-to-day)112nXXniii）（%100XSD）（%100112Xn
40、XXniii第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022462.2.测定法测定法分别测定法分别测定法()照准确度项下方法，取空白生物基质照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆如血浆)数份，分别在同一数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低批内和不同批间制备高、中、低 3个浓度的个浓度的QC样品，并分析测定样品，并分析测定批内批内RSD每一浓度每一浓度56个样品，每个样品测定个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线次，用随行标准曲线分别计算分别计算3个浓度及每个浓度及每1浓度的浓度的RSD批间批间RSD每每1分析批内每一浓度制备分析批内每一浓度制备1个样品，
41、每个样品测定个样品，每个样品测定1次；用次；用随行标准曲线计算随行标准曲线计算3个浓度个浓度(每一浓度每一浓度56个分析批数据个分析批数据)的的RSD第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022472.2.测定法测定法连续测定法连续测定法()()若实际样品测定所用的分析批次少于若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行批，也可进行3个批次的个批次的连续分析连续分析(每每1浓度的每浓度的每1批次为批次为56个样本个样本)方差分析法方差分析法 批间批间RSD=批内批内RSD=(%)1001)(%)100112 XIXXnXISSIiiA）（%100(%)100
42、XINSSSSXINSSAtote）（）（%100)(11212 XINXXnXXIiIiinjij第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022483.3.限度要求限度要求在药代动力学和生物利用度研究中在药代动力学和生物利用度研究中对对 g/ml级水平的级水平的RSD一般应一般应10%ng/ml级水平的级水平的RSD一般应一般应15%在在LOQ附近附近RSD应应20%。第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202249五、定量限五、定量限方法定量限方法定量限(limit of quantitation，LOQ)系指在保证具有一定可靠
43、性系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求准确度与精密度符合要求)的前的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度又称为方法灵敏度又称为方法灵敏度(sensitivity)标准曲线上的最低浓度点标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点最低浓度点LOQ)要求要求 应能满足测定应能满足测定35个消除半衰期后生物样品中的药物浓度个消除半衰期后生物样品中的药物浓度准确度在准确度在80%120%(或或RE在在20%的范围内的范围内)RSD20%第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202250六、稳定性与质量控制六、稳定性与质量控制稳定
44、性稳定性包括方法稳定性和样品稳定性包括方法稳定性和样品稳定性方法稳定性方法稳定性方法的耐用性方法的耐用性样品稳定性样品稳定性生物样品的存放条件和时间、冻生物样品的存放条件和时间、冻-融循环融循环测定法测定法QC样品穿插于实际样品测定全过程样品穿插于实际样品测定全过程模拟模拟(或实际或实际)生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察生物样品及其预处理后的待测溶液进行考察要求要求 准确度准确度85%115%(RE在在15%范围内范围内)，RSD15%第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202251七、萃取回收率七、萃取回收率生物样品的预处理方法生物样品的预处理方法重点考
45、虑重点考虑方法准确度方法准确度(或或相对回收率相对回收率)，操作简便、快速，操作简便、快速萃取回收率萃取回收率(绝对回收率，绝对回收率，absolute recovery)，70%萃取回收率与相对回收率的意义不同萃取回收率与相对回收率的意义不同萃取回收率萃取回收率考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失相对回收率相对回收率采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/2022521 1.测定法测定法取空白生物基质取空白生物基质(如血浆如血浆)，照准确
46、度项下方法，制备高、中、低，照准确度项下方法，制备高、中、低3个浓度的个浓度的QC样品样品(每一浓度至少每一浓度至少5个样品个样品)，每个样品分析测定，每个样品分析测定1次次另取等量的相同另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定AT经萃取后的经萃取后的QC样品的检测信号或比值样品的检测信号或比值(内标法内标法)AS未经萃取的标准溶液的检测信号或比值未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法内标法)）（%100STAAR第四章 分析方法的建立与验证第三节 分
47、析方法的验证与要求10/31/2022532 2.限度要求限度要求萃取回收率一般应萃取回收率一般应50%高、中浓度的高、中浓度的RSD应应15%低浓度的低浓度的RSD应应20%。第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202254第四节第四节 体内药物分析方法体内药物分析方法应用示例应用示例第三代喹诺酮类广谱抗菌药第三代喹诺酮类广谱抗菌药盐酸环丙沙星片人体生物等效性盐酸环丙沙星片人体生物等效性研究研究一、文献调研一、文献调研性质性质在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯在水中溶解，在甲醇中微溶，在乙醇中极微溶解，在氯仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶；环丙
48、沙星游离体在水中不溶，仿中几乎不溶，在氢氧化钠试液中易溶；环丙沙星游离体在水中不溶，在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。在乙醇、二氯甲烷中极微溶解，在稀醋酸中溶解。第四章 分析方法的建立与验证NOFNNOOH,HCl,H2O10/31/202255药动学参数药动学参数吸收过程吸收过程空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度约为空腹口服后吸收迅速、人体生物利用度约为49%70%Cmax 口服口服500mg后平均后平均Cmax为为2.42.6mg/LTmax 12h T1/2 血中血中T1/2约为约为4h，肾功能减退时稍有延长至肾功能减退时稍有延长至6h蛋白结合率蛋白结合率20%40%代谢代谢
49、口服给药口服给药24h内，内，40%50%原形、原形、15%代谢物经肾排出代谢物经肾排出第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202256体内分析方法体内分析方法RP-HPLC色谱柱色谱柱ODS色谱柱色谱柱流动相流动相甲醇甲醇(乙腈乙腈)-磷酸磷酸(枸橼酸枸橼酸)缓冲液缓冲液(三乙胺调节三乙胺调节pH2.33.5)，或或离子对色谱离子对色谱:溴化十六烷基三甲基铵溴化十六烷基三甲基铵(氢氧化四丁基铵氢氧化四丁基铵)检测检测紫外或荧光检测紫外或荧光检测生物样品预处理生物样品预处理蛋白沉淀法蛋白沉淀法甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接进样甲醇、乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接进
50、样溶剂萃取法溶剂萃取法二氯甲烷二氯甲烷-异丙醇、氯仿异丙醇、氯仿-异丙醇混合溶剂异丙醇混合溶剂蛋白沉淀蛋白沉淀-溶剂萃取溶剂萃取乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷-异丙醇提取异丙醇提取 第四章 分析方法的建立与验证第三节 分析方法的验证与要求10/31/202257二、分析方法设计二、分析方法设计1分析方法分析方法血浆蛋白结合率低血浆蛋白结合率低(20%40%)、以原形从肾排泄、以原形从肾排泄生物等效性研究生物等效性研究测定血浆中环丙沙星原形药物的浓度测定血浆中环丙沙星原形药物的浓度-时间时间曲线。曲线。初步拟定初步拟定：采用：采用RP-HPLC法法2检测方法检测方法紫外紫外灵敏度灵
