1、微生物发酵工程案例教学第五组：第五组：利用基因工程酵母生产抗疟疾药物利用基因工程酵母生产抗疟疾药物前体前体-青蒿酸青蒿酸微生物发酵工程案例教学选用这篇文章的原因选用这篇文章的原因：符合符合微生物发酵微生物发酵的主题，且综合分子生物学、微生物的主题，且综合分子生物学、微生物学、细胞生物学等学科学、细胞生物学等学科大部分为我们所学的知识：生化中的大部分为我们所学的知识：生化中的甲羟戊酸途径甲羟戊酸途径；分子生物学实验手段等等分子生物学实验手段等等实验思路实验思路简单明了简单明了，充分体现对知识的灵活运用，充分体现对知识的灵活运用实验结果影响深刻，将会对实验结果影响深刻，将会对疟疾治疗疟疾治疗带来一
2、场带来一场革命革命微生物发酵工程案例教学一、疟疾一、疟疾俗称俗称“打摆子打摆子”，是一，是一种由种由疟原虫疟原虫（疟原虫属，（疟原虫属，Plasmodium spp.是是一类一类单细胞真核生物单细胞真核生物，属于细胞内寄生虫）造属于细胞内寄生虫）造成的，通过成的，通过疟蚊疟蚊传播的传播的全球性急性寄生虫传染全球性急性寄生虫传染病病。微生物发酵工程案例教学疟原虫的生命周期很复杂。通疟原虫的生命周期很复杂。通过过蚊子蚊子叮咬进入宿主体内後首叮咬进入宿主体内後首先侵入先侵入肝脏细胞肝脏细胞，再由肝脏进，再由肝脏进入血液感染入血液感染红血球红血球，在红血球，在红血球内内无性繁殖无性繁殖扩增之後，受外部
3、扩增之後，受外部环境因素的影响，它们可以继环境因素的影响，它们可以继续感染新的红血球，也可能形续感染新的红血球，也可能形成成配子体配子体（gametocytegametocyte），当），当蚊子吸取受感染的血液後，雄、蚊子吸取受感染的血液後，雄、雌配子体进入雌配子体进入蚊子胃蚊子胃内发育成内发育成配子并进行配子并进行有性生殖有性生殖，合子最，合子最终在胃壁下形成终在胃壁下形成卵囊卵囊（oocyteoocyte）。卵囊中疟原虫进）。卵囊中疟原虫进行无性繁殖，最终形成行无性繁殖，最终形成孢子体孢子体（sporozoitesporozoite）进入蚊子）进入蚊子唾液唾液腺腺，准备感染新的脊椎动物宿，
4、准备感染新的脊椎动物宿主。主。微生物发酵工程案例教学 疟疾在年发病率不超过十万分之三的中国可能并不为疟疾在年发病率不超过十万分之三的中国可能并不为人们关注，但是在人们关注，但是在非洲非洲，平均每，平均每3030秒秒就有就有一名一名儿童死于儿童死于疟疾。疟疾。世界范围内，仅是呈现临床症状的患者病例每年就在世界范围内，仅是呈现临床症状的患者病例每年就在3 3亿到亿到5 5亿亿之间，而每年因患疟疾而死亡的人数则则在之间，而每年因患疟疾而死亡的人数则则在一一到三百万之间到三百万之间,这其中大部分为儿童。这其中大部分为儿童。微生物发酵工程案例教学 由于传播疟疾的恶性疟原虫（由于传播疟疾的恶性疟原虫（Pl
5、asmodium falciparumPlasmodium falciparum）具有具有复杂的生命周期复杂的生命周期，因而很难根除这种疾病，治疗是，因而很难根除这种疾病，治疗是唯一的选择。而唯一的选择。而抗药抗药疟原虫突变系疟原虫突变系Plasmodium Plasmodium falciparumfalciparum2,32,3的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。的出现更严重阻碍了对这种疾病的控制。而而青蒿素青蒿素，一种由一种由我国学者我国学者在在2020世纪世纪7070年代初从年代初从Artemisia annua LArtemisia annua L（菊科植物，俗称青蒿）中提炼出来（菊
6、科植物，俗称青蒿）中提炼出来的倍半萜内酯环内过氧化物（的倍半萜内酯环内过氧化物（C-15C-15倍半萜），通过释放倍半萜），通过释放高剂量的高剂量的自由基自由基杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫。杀死隐藏于红细胞中的恶性疟原虫。是是目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的目前世界上最有效的治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的药物，被世界卫生组织称为药物，被世界卫生组织称为“治疗疟疾的最大希望治疗疟疾的最大希望”。二、青蒿素二、青蒿素微生物发酵工程案例教学 人工合成青蒿素由于其工艺复杂、人工合成青蒿素由于其工艺复杂、毒副作用大、成本高而不能投入毒副作用大、成本高而不能投入生产。世界上青蒿素药物的生
7、产生产。世界上青蒿素药物的生产主要依靠主要依靠我国我国从野生和栽培青蒿从野生和栽培青蒿中直接提取。但是青蒿中青蒿素中直接提取。但是青蒿中青蒿素的含量很低的含量很低(0.1%-1%w/w),(0.1%-1%w/w),且且受地域性种植影响较大。目前使受地域性种植影响较大。目前使用青蒿素进行治疗每个疗程的费用青蒿素进行治疗每个疗程的费用是美元到美元，对于受用是美元到美元，对于受疟疾危害最深的非洲和南美地区疟疾危害最深的非洲和南美地区的贫困患者来说过于的贫困患者来说过于昂贵昂贵。微生物发酵工程案例教学 基于这些因素，科学家们开始尝试利用基因工程手基于这些因素，科学家们开始尝试利用基因工程手段通过微生物
8、去合成这种物质。这项工作被专门列为段通过微生物去合成这种物质。这项工作被专门列为“青蒿素计划青蒿素计划”，由美国，由美国加利福尼亚大学伯克利分校加利福尼亚大学伯克利分校的的生化工程师生化工程师Jay KeaslingJay Keasling 主持，并且起初就获得主持，并且起初就获得“比比尔尔-梅琳达盖茨基金会梅琳达盖茨基金会”4260 4260 万美元的资助。万美元的资助。2006 2006 年，年，Keasling Keasling 等宣布，通过合成生物学技等宣布，通过合成生物学技术对一株酵母菌成功进行遗传工程改造，使得后者可以术对一株酵母菌成功进行遗传工程改造，使得后者可以产生高水平的产生
9、高水平的青蒿酸青蒿酸（artemisinic acidartemisinic acid）青蒿素青蒿素的一种直接的前体。的一种直接的前体。该成果发表于该成果发表于20062006年年4 4月月1313日英国日英国自然自然杂志上，杂志上，题为题为“Production of the antimalarial drug Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeastprecursor artemisinic acid in engineered yeast”三、基因工程合成青蒿酸三、
10、基因工程合成青蒿酸微生物发酵工程案例教学但是酵母的生长代谢速率较青蒿要高出不知道多少倍，但是酵母的生长代谢速率较青蒿要高出不知道多少倍，而且其培养条件容易控制，不受气候、政治等因素的影而且其培养条件容易控制，不受气候、政治等因素的影响。因此，如果能用酵母生产青蒿酸，那将是非常高产、响。因此，如果能用酵母生产青蒿酸，那将是非常高产、高效的。高效的。真核真核糖酵解糖酵解甲羟戊酸途径甲羟戊酸途径真核真核糖酵解糖酵解甲羟戊酸途径甲羟戊酸途径酵母与青蒿相比：酵母与青蒿相比：微生物发酵工程案例教学研究人员已经探明青蒿素是通过以下途径在青蒿细胞内研究人员已经探明青蒿素是通过以下途径在青蒿细胞内合成的：合成的
11、：焦磷酸法呢焦磷酸法呢酯（酯（FPP）Amorphadiene（合成青蒿酸及合成青蒿酸及青蒿素的最直接青蒿素的最直接的前体原料的前体原料）青蒿酸青蒿酸青蒿素青蒿素微生物发酵工程案例教学 由于酵母也可以合成由于酵母也可以合成FPPFPP，所以我们所需要做的只是将，所以我们所需要做的只是将FPPFPP到到AmorphadieneAmorphadiene再到再到青蒿酸青蒿酸这两个过程克隆进入酵母这两个过程克隆进入酵母细胞内，并对细胞内的其他与之相关的基因进行调控，细胞内，并对细胞内的其他与之相关的基因进行调控，使之能正常并且大量合成青蒿酸。使之能正常并且大量合成青蒿酸。微生物发酵工程案例教学为了将流
12、程图转为了将流程图转为现实，我们对为现实，我们对酵母细胞进行了酵母细胞进行了总共总共8 8次次的基因工的基因工程改造。程改造。四四 具体流程具体流程微生物发酵工程案例教学 第一步，为了能让酵母第一步，为了能让酵母细胞合成细胞合成AmorphadieneAmorphadiene，我，我们将们将ADSADS基因插入由基因插入由GAL1 GAL1 启启动子控制转录的动子控制转录的pRS425pRS425质粒质粒中，然后在酵母细胞中表达，中，然后在酵母细胞中表达，结果显示单独转入结果显示单独转入ADSADS基因基因的酵母只合成少量的的酵母只合成少量的amorphadieneamorphadiene。如
13、图中菌株。如图中菌株EPY201EPY201，4.4mg/L4.4mg/L 。微生物发酵工程案例教学 而细胞中与而细胞中与amorphadiene amorphadiene 的量最直接相关的就是的量最直接相关的就是FPPFPP的量，所以，为了提高啤酒酵母合成的量，所以，为了提高啤酒酵母合成amorphadieneamorphadiene的的能力，我们对能力，我们对FPPFPP合成途径（合成途径（甲羟戊酸合成途径甲羟戊酸合成途径）进行了）进行了总共总共5 5次次的基因工程改造。的基因工程改造。几个与几个与FPPFPP合成相关的基因的表达被合成相关的基因的表达被正调控正调控，而另外，而另外几个促使
14、几个促使FPPFPP转变成固醇的基因被转变成固醇的基因被负调控负调控。同时为了保证。同时为了保证宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修宿主菌株的遗传稳定性，所有这些对宿主细胞进行的修饰都是通过饰都是通过染色体融合染色体融合进行的进行的 。具体过程如下：。具体过程如下：微生物发酵工程案例教学首先，将一种截短的水溶性酶首先，将一种截短的水溶性酶3-3-羟羟基基-3-3-甲基甲基-戊二酰辅酶戊二酰辅酶A A还原酶（还原酶（我我们所学生化书中为译为们所学生化书中为译为-羟基羟基-甲基甲基-戊二酰辅酶戊二酰辅酶A A还原酶，简称还原酶，简称HMGCoAHMGCoA还原酶，又简称还原酶，又简称t
15、HMGRtHMGR，是固，是固醇合成的限速酶）醇合成的限速酶）过表达过表达，可提高，可提高amorphadieneamorphadiene的合成产量的合成产量近五倍近五倍（菌株（菌株 EPY208EPY208）；）；微生物发酵工程案例教学其次，利用一个其次，利用一个methioninerepressiblemethioninerepressible启动启动子子 (PMET3PMET3)，通过对编码鲨，通过对编码鲨稀合酶（固醇生物合成途径稀合酶（固醇生物合成途径中中FPPFPP合成后第一步）的合成后第一步）的ERG9ERG9基因基因进行进行负调控负调控，可将，可将amor amor phadie
16、nephadiene的合成量再增加两的合成量再增加两倍（菌株倍（菌株EPY225EPY225）；）；微生物发酵工程案例教学然后，尽管然后，尽管upc2-1,upc2-1,一个一个可以加强可以加强UPCUPC（啤酒酵母（啤酒酵母中调节固醇合成的一个的通中调节固醇合成的一个的通用转录因子）活性的半显性用转录因子）活性的半显性突变体等位基因，在已有菌突变体等位基因，在已有菌株株 EPY208EPY208背景下背景下过表达过表达（菌株菌株EPY210EPY210）对）对amorphadieneamorphadiene合成的提高起合成的提高起的作用并不显著，但结合对的作用并不显著，但结合对ERG9ERG
17、9基因的负调控，其过表基因的负调控，其过表达可将达可将amorphadieneamorphadiene的合成的合成量提高到量提高到105mg/L105mg/L（菌株菌株EPY213EPY213）；）；微生物发酵工程案例教学再次，在酵母染色体更再次，在酵母染色体更远处在转进一个远处在转进一个tHMGRtHMGR拷贝可以将将其合成量拷贝可以将将其合成量再增加再增加50%50%达到达到149mg/L149mg/L（菌株菌株 EPY 219EPY 219）；微生物发酵工程案例教学最后，虽然编码最后，虽然编码FPPFPP合酶的基因合酶的基因（ERG20ERG20）过表达对过表达对amorphadiene
18、amorphadiene合成合成总量（总量（菌株菌株 EPY224EPY224）的提高效果非常）的提高效果非常小，但在小，但在细胞密度降低细胞密度降低的情况下其合的情况下其合成量却可增加成量却可增加10%10%。将所有这些对基因。将所有这些对基因的修饰综合在菌株的修饰综合在菌株EPY224EPY224上，上，amorphadieneamorphadiene的合成量已经达到了的合成量已经达到了153mg/L153mg/L,是之前所报道这种倍半萜是之前所报道这种倍半萜(烯烯)最大合成水平的几乎最大合成水平的几乎500500倍倍。微生物发酵工程案例教学 现在我们已经得到了可以现在我们已经得到了可以高
19、效合成高效合成amorphadieneamorphadiene的的酵母菌株，但为能将酵母菌株，但为能将amor phadieneamor phadiene转变成转变成青蒿酸青蒿酸，我们，我们还需要找到并分离出青蒿中编码还需要找到并分离出青蒿中编码催化催化amorphadieneamorphadiene转变转变成青蒿酸的酶的基因成青蒿酸的酶的基因。青蒿素是一种倍半萜内酯衍生物，这些衍生物在青蒿素是一种倍半萜内酯衍生物，这些衍生物在菊科菊科植物中普遍存在植物中普遍存在，是一类十分有特性的细胞，是一类十分有特性的细胞次级次级代谢产代谢产物。我们物。我们假定假定菊科植物在半倍半萜内酯的合成的前几步菊科
20、植物在半倍半萜内酯的合成的前几步中利用的是源于中利用的是源于同一祖先同一祖先的合成酶，据此对菊科植物进的合成酶，据此对菊科植物进行了一次行了一次基因组比较分析基因组比较分析。微生物发酵工程案例教学进行基因组比较分析之前，我们先接触两个概念：进行基因组比较分析之前，我们先接触两个概念：1、细胞色素、细胞色素P450酶酶 细胞色素细胞色素P450同工酶是血红蛋白超级家族，它是同工酶是血红蛋白超级家族，它是内质网内质网膜上混合功能氧化酶系统的末端氧化酶膜上混合功能氧化酶系统的末端氧化酶。每个细胞色素。每个细胞色素P450同工酶由一个蛋白质及一个血红素基弥补部分组成。细胞色同工酶由一个蛋白质及一个血红
21、素基弥补部分组成。细胞色素素P450酶系统催可催化很多反应，包括环氧化反应，酶系统催可催化很多反应，包括环氧化反应，N-去烷去烷基化，基化，O-去烷基化，去烷基化，S-氧化及脂肪族和氧化及脂肪族和芳香族残基的羟化反芳香族残基的羟化反应应。和所有的酶一样，细胞色素。和所有的酶一样，细胞色素P450同工酶呈饱和同工酶呈饱和Michaelos-Meuten动力学，其活性动力学，其活性需要辅助因子需要辅助因子，并可被诱，并可被诱导或抑制。导或抑制。系统命名：比如，系统命名：比如，CYP2家族有几个亚家族，诸如家族有几个亚家族，诸如CYP2C、CYP2D、CYP2E。数字代表不同的酶，如。数字代表不同的
22、酶，如CYP2D6，基因同样用基因同样用CYP2D6表示。不论其来源或催化活性为何，这表示。不论其来源或催化活性为何，这种命名法的优点是很易识别结构一致或高度相似的细胞色素种命名法的优点是很易识别结构一致或高度相似的细胞色素P450酶。酶。（CYP71AV1）微生物发酵工程案例教学2 2、已表达序列标志（、已表达序列标志（ESTEST）ESTEST是从一个随机选择的是从一个随机选择的cDNA cDNA 克隆进行克隆进行55端和端和33端单一次测序获得的短的端单一次测序获得的短的cDNA cDNA 部分序列部分序列,代表一个完整代表一个完整基因的一小部分基因的一小部分,EST,EST 来源于一定
23、环境下一个组织总来源于一定环境下一个组织总mRNA mRNA 所构建的所构建的cDNA cDNA 文库。文库。ESTEST标记在亲缘关系较远的物种间标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁比较基因组连锁图和比较质量性状信息图和比较质量性状信息是特别有用。是特别有用。ESTEST是在随机选择并经序列分析后分离得到的和（或）是在随机选择并经序列分析后分离得到的和（或）进行了特性鉴定的核酸，当进行了特性鉴定的核酸，当确定确定ESTEST片段的序列时尚不知片段的序列时尚不知道由之编码的蛋白质的功能道由之编码的蛋白质的功能。鉴定。鉴定ESTEST分子：首先确定部分子：首先确定部分序列信息并将其储存在数据
24、库中；然后用该序列信息分序列信息并将其储存在数据库中；然后用该序列信息作为探针与数据库中的已知序列数据进行比较。在有些作为探针与数据库中的已知序列数据进行比较。在有些情况下，经过这种同源性检索可以在核苷酸序列水平上情况下，经过这种同源性检索可以在核苷酸序列水平上揭示出与编码已知功能蛋白质的另一种核酸相关的特定揭示出与编码已知功能蛋白质的另一种核酸相关的特定ESTEST序列。最后，选择这样的序列。最后，选择这样的ESTEST分子并进一步分析之。分子并进一步分析之。微生物发酵工程案例教学进行基因组比较分析的已知条件：进行基因组比较分析的已知条件：知道是一种知道是一种特异的细胞色素特异的细胞色素P4
25、50P450酶酶对对amorphadieneamorphadiene进行专一性羟化（先进行专一性羟化（先前已经有文章报道），但其基因未知，我们目的就是要找到其编码基因前已经有文章报道），但其基因未知，我们目的就是要找到其编码基因假定菊科植物在半倍萜内酯的合成的前几步中利用的是假定菊科植物在半倍萜内酯的合成的前几步中利用的是源于同一祖先的源于同一祖先的合成酶合成酶知道菊科植物的已表达序列标志（知道菊科植物的已表达序列标志（ESTEST）数据库（由向日葵和莴苣这两种）数据库（由向日葵和莴苣这两种菊科作物提供的基因数据构建，从中菊科作物提供的基因数据构建，从中检索得到细胞色素检索得到细胞色素P450
26、P450已表达序列已表达序列标志（标志（ESTs)ESTs)拥有针对拥有针对CYP71CYP71和和CYP82CYP82家族（家族（P450P450酶在菊科植物中最多的两个家族，其酶在菊科植物中最多的两个家族，其序列已知）序列已知）高度特异的简并引物高度特异的简并引物那么怎么通过对已知条件的运用才可以得到青蒿中那么怎么通过对已知条件的运用才可以得到青蒿中这种特异的细胞色素这种特异的细胞色素P450P450基因呢？基因呢？微生物发酵工程案例教学步骤如下：步骤如下：高度特异的高度特异的简并引物简并引物青蒿毛状体细胞青蒿毛状体细胞的互补的互补DNADNA库库PCRPCR、凝、凝胶电泳胶电泳回收等回收
27、等几个特定的几个特定的p450p450片段片段一个青蒿一个青蒿P450P450基因基因片段片段与之对应的与之对应的mRNAmRNA完整完整P450cDNAP450cDNA（CYP71AV1CYP71AV1）RT-PCRRT-PCR 转录转录BLASTBLAST分析法将这些片段分析法将这些片段与向日葵和莴苣的与向日葵和莴苣的ESTEST比对，我们惊奇地发现比对，我们惊奇地发现有一个青蒿有一个青蒿P450P450基因片基因片段与来自以上两种植物段与来自以上两种植物的未知功能的未知功能ESTsESTs序列非序列非常相似常相似微生物发酵工程案例教学经过经过BLASTBLAST分析筛选出的那个青蒿分析筛
28、选出的那个青蒿P450P450基因片段与来基因片段与来自以上两种植物的未知功能自以上两种植物的未知功能ESTsESTs序列非常相似（氨基酸序列非常相似（氨基酸水平上达相似度达水平上达相似度达85-88%85-88%），而同其他非菊科植物的），而同其他非菊科植物的P450P450序列相似度较低（氨基酸水平上序列相似度较低（氨基酸水平上小于小于50%50%）。这表明）。这表明相对于非菊科植物，相对于非菊科植物，P450P450基因在这三个亲缘关系较远的基因在这三个亲缘关系较远的菊科植物属中是高度保守的。菊科植物属中是高度保守的。随后相应的随后相应的完整完整P450cDNAP450cDNA（CYP7
29、1AV1CYP71AV1），一个编码），一个编码495495个氨基酸的开放阅读框，成功从青蒿中分离获得。个氨基酸的开放阅读框，成功从青蒿中分离获得。微生物发酵工程案例教学 为了保证异源表达的为了保证异源表达的CYP71AV1CYP71AV1可以发挥正常功能，可以发挥正常功能，协同它进行氧化还原反应的天协同它进行氧化还原反应的天然配体，然配体，NADPHNADPH：细胞色素细胞色素P450P450氧化还原酶（氧化还原酶（CPRCPR），），同同样从青蒿中成功分离，并且其样从青蒿中成功分离，并且其生化活性已经在体外被证实。生化活性已经在体外被证实。微生物发酵工程案例教学 1 1、体内表达、体内表达
30、GC-MSGC-MS检测检测：在配体分子在配体分子CPRCPR的参的参与下，我们分别在与下，我们分别在活细胞活细胞体内体内和和体外体外研究了研究了CYP71AV1CYP71AV1是是否可以催化否可以催化amorpha amorpha dienediene转变为多级氧转变为多级氧化产物。化产物。微生物发酵工程案例教学分析结果显示：分析结果显示：几乎几乎95%95%的这种特异化合物是来的这种特异化合物是来源于细胞体的。而且这种化源于细胞体的。而且这种化合物的电子碰撞质谱和保留合物的电子碰撞质谱和保留时间与从青蒿中提取的青蒿时间与从青蒿中提取的青蒿酸的酸的完全吻合完全吻合。微生物发酵工程案例教学在摇
31、瓶培养条件下，同时在摇瓶培养条件下，同时表达表达CYP71AV1 CYP71AV1 和和CPRCPR的的EPY224EPY224菌株青蒿酸产量为菌株青蒿酸产量为32 32 13 13 mg/L(mg/L(平均数平均数 标准差标准差,n,n7)7)。更为重要的是，其中间代。更为重要的是，其中间代谢产物，谢产物，青蒿醇和青蒿醛青蒿醇和青蒿醛在细在细胞体和培养基中被检测到的量胞体和培养基中被检测到的量几乎可以忽略（青蒿醇的量比几乎可以忽略（青蒿醇的量比青蒿素酸的青蒿素酸的5%5%还少，并且根本还少，并且根本没有青蒿醛被检测出）。没有青蒿醛被检测出）。微生物发酵工程案例教学从啤酒酵母菌株从啤酒酵母菌株
32、YPH499YPH499中分中分离离微体微体，这些微体仅表达，这些微体仅表达CPRCPR（对（对照组）或者同时表达照组）或者同时表达CPRCPR和和CYP71AV1CYP71AV1。将微体在不同的合成。将微体在不同的合成途径中间体（途径中间体（amorphadieneamorphadiene，青，青蒿醇，青蒿醛）条件下进行培养。蒿醇，青蒿醛）条件下进行培养。2 2、体外酶法检测：、体外酶法检测：微生物发酵工程案例教学a-ca-c每一种酶的测定分别加入每一种酶的测定分别加入（a a）10M amorphadiene10M amorphadiene，（b b）25M 25M 青蒿醇青蒿醇（c c）
33、25M 25M 青蒿醛。青蒿醛。底物的色谱峰用星号标出。醚提取底物的色谱峰用星号标出。醚提取物经过衍生，并用物经过衍生，并用GC-MSGC-MS在不同的粒子模在不同的粒子模式下分析（式下分析（mlzmlz：121121，189189，204204，218218，220220和和248248）。酶反应的产物按照预期得）。酶反应的产物按照预期得到：到：1 1，青蒿醇（保留时间，青蒿醇（保留时间13.2013.20分钟）；分钟）；2 2，青蒿醛（保留时间，青蒿醛（保留时间11.7911.79分钟）；分钟）；3 3，青蒿酸（保留时间青蒿酸（保留时间13.5813.58分钟，甲酯化后分钟，甲酯化后检测）
34、检测）微生物发酵工程案例教学虽然先前已经有报道，使用青蒿蛋白提取物的体外虽然先前已经有报道，使用青蒿蛋白提取物的体外酶法测定证明可溶性的酶法测定证明可溶性的醇醛脱氢酶醇醛脱氢酶和一种和一种C11C11，1313双键还双键还原酶原酶（作用于醛）参与青蒿素的生物合成（作用于醛）参与青蒿素的生物合成 。我们不排除。我们不排除在青蒿中存在其他的醇醛脱氢酶参与的催化反应，但是在青蒿中存在其他的醇醛脱氢酶参与的催化反应，但是体外实验中重组的体外实验中重组的CYP71AV1CYP71AV1将将amorpha-4,11-dieneamorpha-4,11-diene高效高效转化为青蒿酸，完全显示出膜结合、多功
35、能的转化为青蒿酸，完全显示出膜结合、多功能的CYP71ACYP71AV1V1是青蒿素的生物合成中的是青蒿素的生物合成中的关键促成因素关键促成因素。微生物发酵工程案例教学我们证实，通过用碱性缓冲液（我们证实，通过用碱性缓冲液（pHpH为为9 9的的Tris-HCLTris-HCL缓冲液中添加缓冲液中添加1.2M1.2M的山梨醇）的山梨醇）清洗胞体沉淀物，绝大部分合成的青蒿酸清洗胞体沉淀物，绝大部分合成的青蒿酸（96%96%）可以而被分离出，而且冲洗之后）可以而被分离出，而且冲洗之后细胞体和培养基中的残留量仅为细胞体和培养基中的残留量仅为2%2%。青蒿。青蒿酸不仅可以被高效的转移到细胞外，且在酸不
36、仅可以被高效的转移到细胞外，且在酸性条件下经过质子化后会被束缚在细胞酸性条件下经过质子化后会被束缚在细胞表面。表面。五、提纯微生物发酵工程案例教学利用这个特点制定了一种便捷提纯方法：利用这个特点制定了一种便捷提纯方法：混合培养物混合培养物细胞体沉淀物细胞体沉淀物碱性清洗碱性清洗缓冲液缓冲液凝胶柱层析纯度大于95%的青蒿酸HCLHCL调调pHpH醚抽提醚抽提抽提产物抽提产物微生物发酵工程案例教学在一个一升发酵罐中，青蒿酸的产量为在一个一升发酵罐中，青蒿酸的产量为115mg115mg，而通这，而通这种方法的，我们可以得到种方法的，我们可以得到76mg76mg的提纯产物。最重要的是，经的提纯产物。最
37、重要的是，经 1H and13C1H and13C原子核磁共振检测原子核磁共振检测显示，这种酵母合成青蒿酸与显示，这种酵母合成青蒿酸与从青蒿中直接提取的青蒿酸从青蒿中直接提取的青蒿酸分子结构完全一样分子结构完全一样。因此，可以。因此，可以确定我们所得到的这株转基因酵母能够直接合成结构功能上确定我们所得到的这株转基因酵母能够直接合成结构功能上完全正确的青蒿酸。完全正确的青蒿酸。微生物发酵工程案例教学转基因酵母在生产青蒿酸时需要的生物量与青蒿相转基因酵母在生产青蒿酸时需要的生物量与青蒿相比比：青蒿素（酸）含量胞体干重4.5%地上部分干重0.16%培养时间 4-5天 数月提纯方法简单 复杂总之，转基
38、因酵母菌珠的单位生产效率比总之，转基因酵母菌珠的单位生产效率比青蒿高了青蒿高了近两个数量级近两个数量级。微生物发酵工程案例教学总的来说，我们采用改造总的来说，我们采用改造FPPFPP生物合成途径生物合成途径的方法获得的方法获得了能高水平生产青蒿酸的啤酒了能高水平生产青蒿酸的啤酒酵母菌株。该方法通过表达酵母菌株。该方法通过表达amorphadieneamorphadiene合成酶合成酶，一种，一种新新型的细胞色素型的细胞色素P450P450和与之相关和与之相关的来自青蒿的的来自青蒿的氧化还原酶氧化还原酶来提来提高高FPPFPP的产量。据了解，相关的产量。据了解，相关转化青蒿酸到青蒿素或其他派转化
39、青蒿酸到青蒿素或其他派生物的化学方法可能还有许多生物的化学方法可能还有许多待改进之处，但微生物法生产待改进之处，但微生物法生产青蒿酸是获得此类高效抗疟疾青蒿酸是获得此类高效抗疟疾药物切实可行的方法。药物切实可行的方法。微生物发酵工程案例教学六、实验方法：六、实验方法：、化学和植物材料：、化学和植物材料：青蒿酸标准品购买于青蒿酸标准品购买于Apin Apin ChemicalsChemicals公司或者直接用己烷从青蒿叶片萃取。公司或者直接用己烷从青蒿叶片萃取。青蒿植株被栽培在青蒿植株被栽培在加州大学伯克利分校加州大学伯克利分校的温室当的温室当中，并且都是从种子开始培育的。中，并且都是从种子开始
40、培育的。2 2、GCMSGCMS法分析法分析AmorphadieneAmorphadiene：用用GCMSGCMS对不对不同株系的啤酒酵母的同株系的啤酒酵母的AmorphadieneAmorphadiene合成量进行合成量进行测定，使用十二烷阻止测定，使用十二烷阻止AmorphadieneAmorphadiene的的挥发挥发。为了定量衡量为了定量衡量AmorphadieneAmorphadiene产量水平，用于测产量水平，用于测定标准曲线的定标准曲线的AmorphadieneAmorphadiene（90%90%纯）是通过大纯）是通过大肠杆菌菌株发酵制备的。肠杆菌菌株发酵制备的。微生物发酵工程
41、案例教学3 3、青蒿酸的胞内发酵，纯化及化学分析：、青蒿酸的胞内发酵，纯化及化学分析：将经过预培养将经过预培养的在的在600nm600nm（A600A600）下吸光度达到）下吸光度达到0.050.05的的EPY224EPY224菌株（已菌株（已经被转入经被转入pESCURA:CPR pESCURA:CPR 或者或者 pESCURA:CPR/CYP71AV1pESCURA:CPR/CYP71AV1）接种到接种到25ml25ml合成培养基中。该培养基不含组氨酸、亮氨合成培养基中。该培养基不含组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸和尿嘧啶，但是添加有酸、甲硫氨酸和尿嘧啶，但是添加有0.2%0.2%的葡萄糖、的葡萄
42、糖、1.8%1.8%的的半乳糖半乳糖以及以及1mMol1mMol定量的甲硫氨酸。定量的甲硫氨酸。300C300C下恒温培下恒温培养养120120小时小时，然后将培养混合物进行，然后将培养混合物进行离心离心，留下细，留下细胞体胞体。再用再用50mM Tris-HCl50mM Tris-HCl缓冲液（缓冲液（pH 9.0pH 9.0）冲洗细胞体冲洗细胞体，加入，加入2M2M的的HClHCl将缓冲液的将缓冲液的pHpH调至调至2.02.0，用混入，用混入4-4-烷基苯甲酸烷基苯甲酸（10ug/ml10ug/ml）的乙酸乙酯进行萃取。萃取馏分经）的乙酸乙酯进行萃取。萃取馏分经50ul 2M50ul 2
43、M的四甲基硅烷的四甲基硅烷-重氮甲烷和重氮甲烷和10%10%的甲醇衍生。在进行的甲醇衍生。在进行GC-MSGC-MS分析前，产物还要经过以（分析前，产物还要经过以（1 1：1 1）的醚和戊烷为洗脱剂）的醚和戊烷为洗脱剂的凝胶色谱提纯。的凝胶色谱提纯。微生物发酵工程案例教学 最后，提纯的产物经气相色谱质谱仪（最后，提纯的产物经气相色谱质谱仪（70eV70eV，Agilent TechnologiesAgilent Technologies）分析，毛细管柱为）分析，毛细管柱为DB5DB5（0.250.25毫毫米内径米内径 0.250.2530m30m，J&W ScientificJ&W Scien
44、tific）。气相色谱的）。气相色谱的加热程序从加热程序从8080（保持（保持2 2分钟），以每分钟分钟），以每分钟2020的梯度递的梯度递增到增到140140。产品分离时由。产品分离时由5/min5/min的速度增加到的速度增加到220220。采用火焰电离色谱检测采用火焰电离色谱检测标准品标准品时时为了定量为了定量，没有使用相，没有使用相同的气相加热程序对柱子进行净化。同的气相加热程序对柱子进行净化。微生物发酵工程案例教学4 4、发酵及产物的核磁共振分析、发酵及产物的核磁共振分析:使用使用1 1升的生物反应器升的生物反应器（New-Brunswick ScientificNew-Brunsw
45、ick Scientific），在），在3030的条件下，培的条件下，培养酵母菌养酵母菌9393个小时。个小时。2%2%的半乳糖的诱导酵母细胞，的半乳糖的诱导酵母细胞，600nm600nm下测下测ODOD值为值为1.71.7，最终的细胞浓度，最终的细胞浓度ODOD值值A600A600达到达到5.05.0。搅。搅拌速度从拌速度从100rmp100rmp变到变到500rmp500rmp，每分钟通氧，每分钟通氧0.5L0.5L，使得溶，使得溶氧量始终保持在氧量始终保持在40%40%，青蒿酸使用碱洗的方法从细胞沉淀，青蒿酸使用碱洗的方法从细胞沉淀物中提取出来，再使用含有物中提取出来，再使用含有78%7
46、8%的己烷，的己烷，20%20%的乙酸乙酯的乙酸乙酯和和2%2%的乙酸的硅胶管柱提纯。分离得到的青蒿酸（纯度的乙酸的硅胶管柱提纯。分离得到的青蒿酸（纯度大于大于95%95%）的结构采用）的结构采用College of Chemistry NMR College of Chemistry NMR Facility at the University of CaliforniaFacility at the University of California提供的提供的1H1H和和13C NMR500MHz13C NMR500MHz核磁共振仪进行分析。核磁共振仪进行分析。微生物发酵工程案例教学5 5
47、、体外酶法测定、体外酶法测定:用重组质粒用重组质粒pESCURA:CPRpESCURA:CPR或者或者pESCURA:CPR/CYP71AV1pESCURA:CPR/CYP71AV1与与1 1升的升的啤酒酵母啤酒酵母YPH499YPH499培养物，培养物，加入加入2%2%的半乳糖转化的半乳糖转化2424小时。微体使用聚小时。微体使用聚乙二醇法沉淀乙二醇法沉淀，然后超高速离心去除前面提到的细胞里的蛋白质杂质。然后超高速离心去除前面提到的细胞里的蛋白质杂质。取大约取大约500g500g的微体蛋白，的微体蛋白，100mM pH 7.5100mM pH 7.5的磷酸加缓冲液的磷酸加缓冲液,1010或者
48、或者25M 25M 的培养基，的培养基，100M NADPH100M NADPH和一个和一个NADPHNADPH的重建的重建体系（体系（5mM 5mM 葡萄糖葡萄糖-6-6-磷酸和磷酸和2 2个单位的葡萄糖个单位的葡萄糖-6-6-磷酸脱磷酸脱氢酶）。反应在氢酶）。反应在2424下轻微搅拌作用下轻微搅拌作用2424小时。反应完成小时。反应完成之后加酸至之后加酸至pH pH 为为2 2，然后使用乙醚抽提。产物采用与上，然后使用乙醚抽提。产物采用与上面所述相同的气相加热程序。使用包含了相对于产物典面所述相同的气相加热程序。使用包含了相对于产物典型的六种离子（型的六种离子（121121，189189，
49、204204，220220和和248248）的固定离子）的固定离子检测（检测（SIMSIM）法进行检测。）法进行检测。微生物发酵工程案例教学 七、本实验的意义：七、本实验的意义：保守分析证明，在使产品效价最优化的情况下，青蒿保守分析证明，在使产品效价最优化的情况下，青蒿素结合治疗法将会素结合治疗法将会远远降低远远降低于现在用于疟疾治疗的价于现在用于疟疾治疗的价格。格。这种生物合成方法不会受到像这种生物合成方法不会受到像天气和政治气候天气和政治气候等因素等因素的影响，但这些因素可能会对植物的培育造成影响。的影响，但这些因素可能会对植物的培育造成影响。从微生物里得到的青蒿酸可以采用对环境友好的方式
50、从微生物里得到的青蒿酸可以采用对环境友好的方式提取，而不用担心像植物能够产生其他的萜烯致使产提取，而不用担心像植物能够产生其他的萜烯致使产物受到污染，从而物受到污染，从而减少纯化的费用减少纯化的费用。微生物发酵工程案例教学转化的真菌除了用于治疗疟疾以外，也可以用来转化的真菌除了用于治疗疟疾以外，也可以用来对抗对抗其他疾病其他疾病。基因改良的菌株还可被转化用来生产其他。基因改良的菌株还可被转化用来生产其他类异戊二烯类化学物质类异戊二烯类化学物质，只要以对工程菌做稍许的改，只要以对工程菌做稍许的改变，加入任何数量感兴趣的与化学物合成有关的植物变，加入任何数量感兴趣的与化学物合成有关的植物基因，几乎
