1、小鼠骨髓间充质干细胞的原代培养 一、立题依据一、立题依据 1、小鼠骨髓间充质干细胞原代培养的意义、小鼠骨髓间充质干细胞原代培养的意义?有利于进行骨髓间充质干细胞的生物学特性的研究?为下一步的传代培养创造条件?可以直接应用于临床实践，是研究骨髓间充质干细胞作用的前提 2、骨髓间充质干细胞原代培养的方法?贴壁培养筛选法?密度梯度离心法 3、骨髓间充质干细胞的应用前景?在适当的条件下，骨髓间充质干细胞可以分化为三个胚层来源的组织细胞而进行细胞移植的治疗，在体外培养扩增后也可种植于生物材料上，回植入机体修复组织损伤。?骨髓间充质干细胞在治疗组织器官退行性疾病、遗传缺陷性疾病和基因治疗方面也展现了美好前
2、景。二、材料和方法二、材料和方法 1 1、材料、材料 成年小白鼠4只?胎牛血清（杭州四季清公司）?L-DMEM(Hyclone赛默飞世尔生物化学制品北京有限公司）?胰蛋白酶（Sigma公司）?PBS（NaCl 8g,KCl 0.2g,NaHPO412H2O 2.88g,KH2PO4 0.2g,三蒸水1000ml)?Percoll细胞分离液（Percoll原液：三蒸水:NaCl 2.6:1.9:0.5)?青霉素、链霉素（100U/ml青霉素，青霉素，100g/ml链霉素）链霉素）?8%NaHCO3溶液（8gNaHCO3,100ml超纯水）2、仪器?倒置显微镜尼康TE2000E（上海于欣仪器有限公
3、司）?CO2恒温培养箱MC0-15A(日本三洋电机楳氏会公司)?超净工作台SW-CJ-2F（苏州安泰空气技术公司）?生物显微镜（舜宇公司）?低温高速离心机（Jouan公司)?无菌操作台，血球计数板，6孔培养板等 3、方法 骨髓的收集骨髓的收集 PercollPercoll密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细 胞胞 贴壁培养骨髓间充质干细胞贴壁培养骨髓间充质干细胞 形态学观察形态学观察 原代培养细胞原代培养细胞 生长曲线的测定生长曲线的测定 三、结果三、结果（一）骨髓间充质干细胞的形态学观察 24 h24 h后就见有细胞贴壁，多数细后就见有细胞贴壁，多数细胞呈
4、圆形胞呈圆形（图（图1A1A）72 h后首次半量换液去除未贴壁后首次半量换液去除未贴壁细胞，此时贴壁的细胞为单个，细胞，此时贴壁的细胞为单个，形态大部分为圆形形态大部分为圆形（图（图1B)1B)结果一 第第1 1次换液后次换液后5 57 d7 d可见由几十个到数百个细胞组成的集落，细胞形可见由几十个到数百个细胞组成的集落，细胞形梭态呈形、三角形或星形梭态呈形、三角形或星形 （图（图1C1C、D D）结果一 原代细胞培养原代细胞培养10 d10 d左右，细左右，细胞快速增殖，每个集落中的胞快速增殖，每个集落中的细胞不断增殖呈长梭形放射细胞不断增殖呈长梭形放射状排列（图状排列（图1E1E）培养培养
5、2 2周左右，每个小集落形周左右，每个小集落形成约数百致上千个细胞的大成约数百致上千个细胞的大集落，集落交界处出现重叠集落，集落交界处出现重叠、融合、融合（图（图1F)1F)图图1.1.倒置显微镜下骨髓间充质干细胞原代培养形态观察倒置显微镜下骨髓间充质干细胞原代培养形态观察 Fig.1 Morphology of BMSCs in primary culture under an inverted microscope Fig.1 Morphology of BMSCs in primary culture under an inverted microscope (A)1d,(A)1d,10
6、0;(B)3d,100;(B)3d,100;(C)5d,100;(C)5d,200;(D)7d,200;(D)7d,200;(E)9d,200;(E)9d,400;(F)13d,400;(F)13d,400.400.结果二（二）原代小鼠骨髓（二）原代小鼠骨髓MSCsMSCs的生长曲线结果的生长曲线结果 BMSCsBMSCs原代培养生长曲线（图原代培养生长曲线（图2 2），生长曲线表明），生长曲线表明BMSCsBMSCs的增殖能力的增殖能力很强，所测细胞在开始的前很强，所测细胞在开始的前4 4天里生长缓慢处于潜伏适应期，第天里生长缓慢处于潜伏适应期，第5 5天开始迅速增长进入对数生长期，到第天开
7、始迅速增长进入对数生长期，到第9 9天细胞数轻度上升，第天细胞数轻度上升，第1010天达到顶点，生长速度减缓进入平台期。天达到顶点，生长速度减缓进入平台期。四四 讨论讨论?分离骨髓MSCsMSCs的方法主要有四种：贴壁筛选法、密度梯度离心法、免疫磁珠分离法、流式分选法等。我们使用密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，能有效地将红细胞、白细胞和间充质干细胞分离开来，同时操作简便，快速，对细胞的活性影响较小。且此分离法简单经济，因而被广泛应用。?据本实验培养细胞的经验，如果操作中吸取界面层细胞不小心，会混进非单核细胞，就会大大降低细胞分离的纯度，使分离出的细胞大小不均。另外，细胞分离操作时间延长，操作不
8、轻柔，分离出的细胞纯度降低，都会降低细胞的贴壁率和存活率。讨论讨论?有时在相同的培养条件下，有极少数标本较难扩增骨髓MSCsMSCs，可能与冲洗骨髓腔的操作有关。骨髓MSCsMSCs具有黏附贴塑料瓶壁的特性，在实验中用玻璃瓶也能培养扩增。在原代培养物中，除了呈成纤维细胞样的MSCsMSCs外，还混杂着一些其他细胞，可以根据这些污染细胞生物学特性将其除去。血清的浓度并非越高越好，相反，高浓度血清由于含有大量促进细胞分化的因子，已引起细胞分化，从而使细胞过早出现老化，反而不利于干细胞生长，一般以5%5%10%10%胎牛血清最适合MSCsMSCs的生长。细胞接种密度过密，会引起细胞之间的接触抑制；而过稀又会导致细胞分泌的因子不足从而影响细胞的生长。一般适宜密度为（4848）10104 4个/ml/ml。五五 结论结论 本实验通过对成年小白鼠骨髓MSCs进行分离，体外培养，同时从细胞形态和生物学特性进行观察和检测，认为采用淋巴细胞分离液密度梯度离心，贴壁培养和消化时间控制相结合，可以获得纯度较高和活性骨髓MSCs，具有操作简单，快速，实用等优点，为一种较为有效的分离纯化骨髓 MSCs的方法。谢谢大家
