1、LOGO免疫印迹法的实验技免疫印迹法的实验技术术 一、Western-Blot简介vWestern Blot，又称为免疫印迹又称为免疫印迹（Immunoblot）,是是70年代末年代末80年代初发年代初发展起来的蛋白质测定技术。展起来的蛋白质测定技术。v蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大蛋白质印迹的发明者一般认为是美国斯坦福大学的乔治学的乔治斯塔克（斯塔克（George Stark）。在尼）。在尼尔尔伯奈特（伯奈特（Neal Burnette）于）于1981年所年所著的分析生物化学（著的分析生物化学（Analytical Biochemistry）中首次被称为）中首次被称为Western
2、 Blot。免疫印迹法的实验技术2v印迹法（印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。方法。vWestern Blot 印迹方法，是检测蛋白质混合印迹方法，是检测蛋白质混合液体中某种特定目的蛋白的液体中某种特定目的蛋白的定性方法定性方法，也可作为，也可作为确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不同条件下的同条件下的相对含量的半定量方法。相对含量的半定量方法。免疫印迹法的实验技术3v实验主要内容：实验用途实验用途2实验注意事项实验
3、注意事项 4实验方法及步骤实验方法及步骤3 3 实验原理实验原理3 1免疫印迹法的实验技术4实验原理实验原理v 将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶【SDS-polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE)】电泳使蛋白质按分子量的大小进行分离 凝胶上分离到的蛋白质转移至固相支持物（硝酸纤维素膜或PVDF 膜）上 用抗靶蛋白的非标记抗体（一抗）与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合与经辣根过氧化物酶标记（偶联）的二抗结合 用ECL发光或DAB显色检测。如果转印膜上含有靶蛋白，经DAB显色后上出现棕黄色条带蛋白条带。免疫印迹法的实验技术5vWestern
4、 Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，被检测物是蛋白质，“探针探针”是抗体，是抗体，“显色显色”用标用标记的二抗。经过记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗
5、体起反应，疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。用于检测蛋白水平的表达。免疫印迹法的实验技术6实验用途v用于检测样品中特异性蛋白质是否存蛋白质是否存在。在。v对特异性蛋白质进行半定量半定量分析。免疫印迹法的实验技术7蛋白免疫印迹组成凝胶电泳凝胶电泳1SDS-聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳，使胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋待测样品中的蛋白质按分子量大白质按分子量大小在凝胶中分成小在凝胶中分成带带2把凝胶中已
6、分成把凝胶中已分成条带的蛋白质转条带的蛋白质转移到一种固相支移到一种固相支持物上持物上样品的印迹样品的印迹3用特异性的抗体用特异性的抗体检测出已经印迹检测出已经印迹在膜上的所要研在膜上的所要研究的相应抗原究的相应抗原免疫学检测免疫印迹法的实验技术8实验步骤v 提取细胞或组织蛋白提取细胞或组织蛋白测定蛋白测定蛋白含量含量制备制备SDS-PAGE胶胶蛋白蛋白变性、上样变性、上样电泳电泳 转膜转膜封闭封闭一抗一抗TBST洗膜洗膜HRP标记标记的二抗的二抗TBST洗膜洗膜ECL底物显底物显色色X光片曝光、显色光片曝光、显色结果分析结果分析免疫印迹法的实验技术9免疫印迹法的实验技术10二、蛋白样本的制备
7、和浓度的测定二、蛋白样本的制备和浓度的测定v蛋白的提取：一般包括组织蛋白提取、细胞蛋白蛋白的提取：一般包括组织蛋白提取、细胞蛋白的提取的提取 组织蛋白提取组织蛋白提取v组织和裂解液（组织和裂解液（加入蛋白酶抑制剂，加入蛋白酶抑制剂，为防止细胞内蛋白酶对蛋白质的降解）按比例配制）按比例配制-置于玻璃置于玻璃匀浆器中，充分研磨（冰上操作）匀浆器中，充分研磨（冰上操作）4离心，离心，12000rpm，10min取上清分装取上清分装1.5ml离心管离心管中中20保存。保存。（低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解。）v 蛋白酶抑制剂：蛋白酶抑制剂：如PMSF、EDTA、EGTA等，要根据具体情况具体选择
8、。免疫印迹法的实验技术11注意事项注意事项v注意个人防护。注意个人防护。PMSF严重损害呼吸道黏膜、眼严重损害呼吸道黏膜、眼睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了睛及皮肤，一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，立即，立即用大量水冲洗。用大量水冲洗。v所用离心机需提前预冷。所用离心机需提前预冷。v为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。为防止蛋白降解，所有操作应在冰上完成。v吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。吸取蛋白上清液时，注意不要把沉淀吸上来。免疫印迹法的实验技术12蛋白浓度的测定蛋白浓度的测定原因：原因：vWestern Blot作为一项半定量实验技术，作为一项半定量实验技术，电泳前，必须对不同的样品
9、进行总蛋白含电泳前，必须对不同的样品进行总蛋白含量测定。量测定。v蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴蛋白质总量不足可能妨碍对目的蛋白的鉴定定;蛋白质含量太高则会使带形扭曲蛋白质含量太高则会使带形扭曲,甚至甚至会影响此电泳方法的分辨力。会影响此电泳方法的分辨力。免疫印迹法的实验技术13方法：方法：v目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩目前常用的有五种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（脲法（Biuret法）、法）、Folin酚试剂法酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法法）、紫外吸收法以及考马斯亮蓝法Bradford法）。法）。v目前实验室测蛋白浓度都用试剂盒，如目前实验室测蛋
10、白浓度都用试剂盒，如BCA法试法试剂盒剂盒.免疫印迹法的实验技术14BCA法工作原理vBCA(bicinchoninic acid 二辛可酸)法测定蛋白质的原理与Lowery法相似。即在碱性环境下蛋白在碱性环境下蛋白质分子中肽键结构与质分子中肽键结构与Cu2+络合并将络合并将Cu2+还原还原成成Cu1+。BCA特异地与特异地与Cu1+结合形成稳定的结合形成稳定的紫蓝色复合物，在紫蓝色复合物，在562 nM处有最大光吸收值并处有最大光吸收值并与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该量成正比，可以根据吸收值测定蛋
11、白质浓度。该测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去垢剂颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去垢剂等影响小。等影响小。免疫印迹法的实验技术15SDS-PAGE电泳SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠电泳法，即十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶电泳法。电泳法。原理原理v 1在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。于分子大小和形状以及所带电荷多少。v 2在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫在聚丙烯酰胺凝胶系统中
12、，加入一定量的十二烷基硫酸钠（酸钠（SDS），），SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，在一在一定条件下，大多数蛋白质与定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合的结合（1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质蛋白质），使各种蛋白质SDS复合物都带上相同密度复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。此时，蛋白质分子
13、的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。免疫印迹法的实验技术16免疫印迹法的实验技术17实验前的准备实验前的准备设备和材料的准备设备和材料的准备:v电泳槽的准备电泳槽的准备(本实验用垂直电泳槽本实验用垂直电泳槽)、电泳仪的、电泳仪的准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液枪、枪头、准备、离心机、电磁炉、煮锅、移液枪、枪头、烧杯、量筒烧杯、量筒试剂的准备和配置试剂的准备和配置:v双蒸水、双蒸水、30%丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris-HCl(PH为为8.8)、Tris-HC
14、l(PH为为6.8)、10%SDS、10%过硫酸铵过硫酸铵(AP)、TEMED、电泳上样缓冲、电泳上样缓冲液、电泳缓冲液、蛋白液、电泳缓冲液、蛋白Marker免疫印迹法的实验技术18v 根据待测样品的蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度根据待测样品的蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度.（一般浓缩胶为（一般浓缩胶为5%，分离胶根据所测蛋白分子量定），分离胶根据所测蛋白分子量定）凝胶浓度（）凝胶浓度（）线性分离范围（线性分离范围（KD)KD)151512-4312-43101016-6816-687.57.536-9436-945.05.057-21257-212免疫印迹法的实验技术19作用作用
15、v浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽电泳槽的上方为负极，下方为正极的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动，在凝胶中形成移动界面并带动凝胶中所含界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物负电荷的多肽复合物向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶，使样品中所含使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚多肽复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）集成一条很薄的区带（或称积层）（0.5-1cm）。v分离胶：由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛分离胶：由于胶孔径小，而且成为一个整体的筛状结构，它
16、们对大分子阻力大，小分子阻力小，状结构，它们对大分子阻力大，小分子阻力小，起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以起着分子筛效应，也就是蛋白质在分离胶中，以分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最分子筛效应和电荷效应而出现迁移率的差异，最终达到彼此分开。终达到彼此分开。(PH为为8.8)免疫印迹法的实验技术20实验步骤实验步骤 组装组装SDS-PAGE凝胶用玻璃槽凝胶用玻璃槽 配制和灌注分离胶配制和灌注分离胶 用水压线用水压线30-40分钟直至分离胶凝固分钟直至分离胶凝固 倒掉压线水配制和灌注浓缩胶倒掉压线水配制和灌注浓缩胶 插入样品梳插入样品梳 凝胶直至浓缩胶凝固凝胶直至浓缩胶凝固 制备
17、样品制备样品样品样品:上样缓冲液上样缓冲液=4:1,混匀混匀1000C加热加热5分钟分钟,离心取上清离心取上清)拔出样品梳拔出样品梳 加入电泳缓冲液加入电泳缓冲液,上样，电泳上样，电泳 电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止夹心式垂直电泳槽夹心式垂直电泳槽免疫印迹法的实验技术21蛋白变性的原因蛋白变性的原因v上样蛋白为蛋白样本和上样缓冲液的混合上样蛋白为蛋白样本和上样缓冲液的混合物，按比例配制，物，按比例配制，100煮煮5min。v其目的是将其目的是将SDS 与蛋白质充分结合，以使与蛋白质充分结合，以使蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结构蛋白质完全变性和解聚，并形成棒状结
18、构同时使整个蛋白带上负电荷同时使整个蛋白带上负电荷。免疫印迹法的实验技术22v 玻璃板要清洁玻璃板要清洁,对齐卡严，防止漏胶。对齐卡严，防止漏胶。v 丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴手套及口罩手套及口罩.v 过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制.v 溶液中一旦加入溶液中一旦加入TEMED，应立即混匀并快速灌注入玻璃，应立即混匀并快速灌注入玻璃夹槽中夹槽中.v 浓缩胶缓冲液浓缩胶缓冲液(PH为为6.
19、8)、分离胶缓冲液、分离胶缓冲液(PH8.8)，PH值要准确。值要准确。v 胶灌入前要充分混匀，灌胶要缓慢胶灌入前要充分混匀，灌胶要缓慢,避免有气泡的产生避免有气泡的产生.v 为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的电泳上为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的电泳上样缓冲液样缓冲液.v 正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由上向下方向电泳上向下方向电泳。免疫印迹法的实验技术23说明：说明：v 不是所有的蛋白质都能用不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方
20、法测出的分子量是不可靠的。包括：些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。包括：电荷异常或构电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是的影响，它的分子量是21,000，但，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，最好至少用两种方
21、法来测定未知样品的分子量，互。因此，最好至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。相验证。v 有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如-胰凝胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法
22、测定其分子量及分子中肽链的数到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。凝胶电泳的结果互相参照。免疫印迹法的实验技术24v蛋白质印迹法就是将电泳后分离的蛋白质从凝胶蛋白质印迹法就是将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相支持物上。中转移到固相支持物上。v常用的固相支持物有常用的固相支持物有NC（硝酸纤维素）膜、尼（硝酸纤维素）膜、尼龙膜及龙膜及PVDF（聚偏氟乙烯）膜。（聚偏氟乙烯）膜。vPVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性，价附、物理强度，以及具有更
23、好的化学兼容性，价格比格比NC膜要贵。膜要贵。NC膜更常用。膜更常用。免疫印迹法的实验技术25附：附：膜的选择主要根据：膜的选择主要根据：v膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的膜能结合蛋白 的载量）的载量）v膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）有两种规格：膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）有两种规格：0.45um和和0.2um（for MW20kDa)。v不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选显不影响后续的显色检测（也就是适合用于所选显色方法）色方法）免疫印迹法的实验技术26v 转膜转膜通常有两种方法：毛通常有两种方法：毛细管印迹法和
24、电泳印迹法。细管印迹法和电泳印迹法。电泳印迹效率更高。这种电泳印迹效率更高。这种方法是用有孔的塑料和有方法是用有孔的塑料和有机玻璃板将凝胶和硝酸纤机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成维素膜夹成三明治三明治形状，形状，而后浸入两个平行电极中而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合以使蛋白质离开凝胶结合在膜上。转移后的膜就称在膜上。转移后的膜就称为一个印（为一个印（blot），用于），用于对蛋白质的进一步检测。对蛋白质的进一步检测。免疫印迹法的实验技术27实验前的准备实验前的准备v设备和材料的准备设备和材料的准
25、备:转移电泳槽的准备转移电泳槽的准备(本实验用垂直电泳本实验用垂直电泳槽槽)、转移电泳仪的准备、膜、滤纸、海绵转移电泳仪的准备、膜、滤纸、海绵垫、玻璃棒垫、玻璃棒v试剂的准备和配置试剂的准备和配置:电转液、甲醇（电转液、甲醇（PVDF膜）、（考马斯亮蓝染色液、丽春红染色膜）、（考马斯亮蓝染色液、丽春红染色液）液）免疫印迹法的实验技术28v根据待测样品的蛋白质分子量选择转移的电流大根据待测样品的蛋白质分子量选择转移的电流大小及时间小及时间.我们通常我们通常 200mA/膜，按照目的膜，按照目的蛋白蛋白分子大小、胶浓度分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据选择转移时间，具体可以根据实际适当调整
26、。实际适当调整。目的蛋白分子大小目的蛋白分子大小(kDa)胶浓度胶浓度 转移时间转移时间(h)80-140 8%1.5-2.0 25-80 10%1.5 1540 12%0.75 20 15%0.5免疫印迹法的实验技术29v NC膜预处理：（剪裁与胶大小一致的膜预处理：（剪裁与胶大小一致的NC膜，将其浸入膜，将其浸入1转移缓冲液平衡转移缓冲液平衡5分钟以上。注意：必须保证分钟以上。注意：必须保证NC膜始膜始终完全浸于转移缓冲液中，裁剪时要戴手套，避免手上蛋终完全浸于转移缓冲液中，裁剪时要戴手套，避免手上蛋白将膜污染。）白将膜污染。）v 剪裁剪裁6层滤纸，比胶略大，用转移缓冲液浸泡后待用，同层滤
27、纸，比胶略大，用转移缓冲液浸泡后待用，同时时4层海绵垫也用转移液浸泡。层海绵垫也用转移液浸泡。v 取胶：撬开玻璃板，将多余的胶切除，把裁好的胶放人转取胶：撬开玻璃板，将多余的胶切除，把裁好的胶放人转移液中。移液中。v 转膜转膜v 制作制作“三明治三明治”：由夹子的黑板（阴极）侧开始，依：由夹子的黑板（阴极）侧开始，依次为黑板次为黑板海绵垫片海绵垫片3层滤纸层滤纸胶胶NC膜膜三层滤纸三层滤纸（注意：排除气泡）（注意：排除气泡）海绵垫片海绵垫片(阳极阳极)，扣紧转膜夹板，扣紧转膜夹板，放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意放入含有转膜缓冲液的转移电泳槽中（见蛋白质转移示意图）。图）。免
28、疫印迹法的实验技术30免疫印迹法的实验技术31v 正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正正确连接转移电泳连线，保证电荷由负极向正极流动。接通电源，恒压状态下转膜（此步操作极流动。接通电源，恒压状态下转膜（此步操作宜在宜在4进行）。进行）。v小心取出转移膜，做好标记，在小心取出转移膜，做好标记，在1TBST液中液中漂洗两次。漂洗两次。v（用考马斯亮蓝快速染色液处理凝胶，检查蛋白（用考马斯亮蓝快速染色液处理凝胶，检查蛋白转移是否完全转移是否完全,用丽春红染色液膜用丽春红染色液膜,检测蛋白质是检测蛋白质是否转移到膜上否转移到膜上.）免疫印迹法的实验技术32vPVDF膜需膜需100%甲醇预处理，再用
29、缓冲液平衡，甲醇预处理，再用缓冲液平衡，才能用才能用。v必须保证必须保证NC膜始终完全浸于转移缓冲液中膜始终完全浸于转移缓冲液中,滤纸滤纸要充分浸于转移缓冲液中要充分浸于转移缓冲液中.v操作要轻，避免胶膜的破损操作要轻，避免胶膜的破损。v记住记住“黑面胶，白面膜黑面胶，白面膜”，夹子的黑面朝架子的黑，夹子的黑面朝架子的黑面面。v必须保证必须保证“三明治三明治”各层之间均无气泡各层之间均无气泡。v电转移时最好为恒流电转移时最好为恒流,电转移的时间和电流大小取电转移的时间和电流大小取决于凝胶的厚度和蛋白质分子量的大小决于凝胶的厚度和蛋白质分子量的大小.分子量大分子量大,电流稍大时间长电流稍大时间长
30、;分子量大分子量大,电流小时间短电流小时间短;v注意做好膜上的标记注意做好膜上的标记。免疫印迹法的实验技术34v转移结束后，借助抗原抗体反应，利用转移结束后，借助抗原抗体反应，利用ECL（增强化学发光）发光或（增强化学发光）发光或DAB（3,3二氨基联苯胺）显色技术检测目的蛋白。二氨基联苯胺）显色技术检测目的蛋白。免疫印迹法的实验技术35vDAB显色原理：DAB在在HRP作用下形成红褐色作用下形成红褐色不溶产物不溶产物，从而指示目的蛋白位置及强弱。，从而指示目的蛋白位置及强弱。vECL试剂采用氧化还原反应的原理：利用二抗上利用二抗上标记的辣根过氧化物酶标记的辣根过氧化物酶(HRP)，使底物发生
31、氧化，使底物发生氧化还原反应，从而发出荧光。还原反应，从而发出荧光。vECL发光相对于发光相对于DAB显色而言，具有发光持久，显色而言，具有发光持久，灵敏度高灵敏度高(一般可达到一般可达到pg级以上级以上)等优点，且等优点，且DAB具有致癌性。具有致癌性。免疫印迹法的实验技术36v ECL结果结果 DAB结果结果 免疫印迹法的实验技术37 1.设备和材料的准备设备和材料的准备:v 洗膜用平皿洗膜用平皿v 摇床摇床v ECL发光所需发光所需(避光盒、避光盒、X-光片、光片、X-光片曝光盒等光片曝光盒等)2.试剂的准备和配置试剂的准备和配置:v 封闭液封闭液(5%脱脂奶粉、脱脂奶粉、BSA、Wes
32、ternBlot 膜封膜封闭液）闭液）v 一抗一抗v 二抗二抗v 抗体稀释液抗体稀释液 v TBST缓冲液缓冲液v ECL试剂盒或试剂盒或DAB试剂盒试剂盒免疫印迹法的实验技术38v 1、封闭：将转移后的膜浸入封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动封闭封闭：将转移后的膜浸入封闭液中，室温、摇床上缓慢摇动封闭1h（或（或4过夜）；（封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，使过夜）；（封闭硝酸纤维素膜上剩余的疏水结合位点，使抗体只能跟特异的蛋白结合）抗体只能跟特异的蛋白结合）v 2.一抗反应一抗反应 将一抗用抗体稀释液稀释到所需浓度；将一抗用抗体稀释液稀释到所需浓度；将封闭后的膜放入一抗工作液中，将封闭后的
33、膜放入一抗工作液中，4反应过夜反应过夜(或或37,2小小时时)。v 3.洗膜洗膜 将膜从一抗中取出，将膜从一抗中取出，TBST洗涤洗涤10min3，室温下缓慢摇动洗涤，室温下缓慢摇动洗涤。v 4.二抗反应二抗反应 将二抗用抗体稀释液稀释到所需浓度将二抗用抗体稀释液稀释到所需浓度。将膜放入二抗工作液中室温将膜放入二抗工作液中室温30min。v 5.洗膜洗膜 TBST洗涤洗涤10min3，室温下缓慢摇动洗涤，室温下缓慢摇动洗涤v 6.曝光及洗片（或曝光及洗片（或DAB显色）显色）免疫印迹法的实验技术39曝光及洗片方法曝光及洗片方法v按按1:1（v/v）混合）混合ECL试剂盒中两种液体。试剂盒中两种
34、液体。v将上述混合液均匀铺在将上述混合液均匀铺在NC膜表面，室温作用膜表面，室温作用2分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝分钟。抖掉膜上液体，将其放入铺有保鲜膜的曝光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住光盒中，再将保鲜膜折叠，以包裹住NC膜（避膜（避免在膜的上面出现气泡）。免在膜的上面出现气泡）。v在暗室中（红光下）将在暗室中（红光下）将X光胶片直接压于包裹光胶片直接压于包裹后的膜上，曝光盒中曝光适当时间。后的膜上，曝光盒中曝光适当时间。v将曝光后将曝光后X光片放入显影液中显影、清水中漂光片放入显影液中显影、清水中漂洗、定影液中定影洗、定影液中定影1分钟（具体曝光时间及显影分钟（具体曝光时间及
35、显影时间需根据显影结果作出调整）时间需根据显影结果作出调整）免疫印迹法的实验技术40实验注意事项实验注意事项1.处理膜的过程中，切勿使膜干掉处理膜的过程中，切勿使膜干掉（否则导致背景（否则导致背景增高）增高）2.选择合适的一抗及二抗浓度（浓度高不一定效果选择合适的一抗及二抗浓度（浓度高不一定效果好，过高会导致背景变黑）好，过高会导致背景变黑）3.应考虑试剂的发光强度及其应考虑试剂的发光强度及其淬灭淬灭时间来选时间来选择合适的曝光时间。择合适的曝光时间。4.保鲜膜包裹保鲜膜包裹NC膜时，避免膜上有气泡，影响显膜时，避免膜上有气泡，影响显影。影。5、显影、定影要充分，、显影、定影要充分，X平要完全
36、浸没在液面下。平要完全浸没在液面下。免疫印迹法的实验技术41免疫印迹法的实验技术42 免疫印迹法的实验技术43？免疫印迹法的实验技术44v背景太高背景太高1、膜没有均匀浸湿或出现干膜2、膜或者缓冲液污染3、封闭不充分4、抗体与封闭剂出现交叉反应5、抗体浓度过高 原原因因对对策策1 1、转膜前用转膜前用电转液电转液将膜完全将膜完全浸湿浸湿，操作过程避免干膜，操作过程避免干膜2 2、拿取膜与吸水纸时要戴手拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液套，更换新鲜转膜缓冲液3 3、检测一抗、二抗与封闭剂检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应是否有交叉反应4 4、杂交前检测一抗、二抗的杂交前检测一抗、二抗的工作浓度工作浓度免疫印迹法的实验技术45LOGOvAdd your company slogan免疫印迹法的实验技术46
