1、流式细胞术在免疫学的应用二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法免疫样品的制备要求免疫样品的制备要求：1.一定数量的单细胞悬液一定数量的单细胞悬液，这是流式这是流式测定的基础测定的基础，如果悬液细胞数量过如果悬液细胞数量过少少，测定结果的准确性可能会受到测定结果的准确性可能会受到影响影响2.死细胞和碎片在某些免疫荧光样品死细胞和碎片在某些免疫荧光样品测定中测定中，有可能干扰免疫荧光的分有可能干扰免疫荧光的分布布，应予以排除应予以排除，以免引起测定结以免引起测定结果的假阴性或假阳性果的假阴性或假阳性流式细胞术在免疫学的应用2免疫样品的制备要求免疫样品的制备要求：3.荧光素所发荧光的强度与结合
2、位点荧光素所发荧光的强度与结合位点多少应成正比多少应成正比，在通常情况下在通常情况下，流式流式免疫样品的制备采用直接或间接免疫免疫样品的制备采用直接或间接免疫标记法标记法二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法流式细胞术在免疫学的应用3二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法直接免疫荧光标记法直接免疫荧光标记法：1 取与荧光素交联的抗体直接加入取与荧光素交联的抗体直接加入一定量的细胞一定量的细胞(约约1l06细胞细胞/ml)悬液中，悬液中，进行免疫标记反应进行免疫标记反应。如如做双参数标记染色做双参数标记染色，可把两种可把两种分分别别标有不同荧光素的抗体同时加标有不同荧光素的抗体同时加
3、入入流式细胞术在免疫学的应用4二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法直接免疫荧光标记法直接免疫荧光标记法：流式细胞术在免疫学的应用5二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法直接免疫荧光标记法直接免疫荧光标记法：2 标记反应一定时间后标记反应一定时间后，用用PBS液液(pH7.2-7.4)洗涤细胞悬液两次洗涤细胞悬液两次，离心后重新悬浮于缓冲液中离心后重新悬浮于缓冲液中，上上机检测机检测流式细胞术在免疫学的应用6二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法直接免疫荧光标记法直接免疫荧光标记法：优点优点：所测结果准确所测结果准确，操作简便操作简便，阴阳性结果易分析阴阳性结果易分析，适用于
4、同一适用于同一细胞群体多种参量标记的测定细胞群体多种参量标记的测定流式细胞术在免疫学的应用7二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法直接免疫荧光标记法直接免疫荧光标记法：缺点缺点：在检查每一抗原时都要制备在检查每一抗原时都要制备与抗原与抗原相应相应的荧光标记抗体的荧光标记抗体，不不但荧光抗体制备复杂但荧光抗体制备复杂，而且费用而且费用昂贵昂贵，另外其敏感性也较间接法另外其敏感性也较间接法稍差稍差流式细胞术在免疫学的应用8二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法间间接免疫荧光标记法接免疫荧光标记法：取一定量的细胞或细胞核悬液取一定量的细胞或细胞核悬液约约 1x106 细胞细胞/ml 加入
5、特异的第一加入特异的第一抗体抗体，待结合反应一定时间后待结合反应一定时间后，洗洗去多余的抗体去多余的抗体，加入荧光标记的第加入荧光标记的第二抗体二抗体，形成一种抗原形成一种抗原抗体抗体抗抗抗体免疫复合物抗体免疫复合物，通过通过FCM检测检测其荧光其荧光流式细胞术在免疫学的应用9二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法间间接免疫荧光标记法接免疫荧光标记法：流式细胞术在免疫学的应用10二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法间间接免疫荧光标记法接免疫荧光标记法：优点优点：操作较简单操作较简单，费用较低费用较低，只只要制备相关的第一抗体要制备相关的第一抗体，二抗可二抗可较广泛的应用较广泛的应
6、用。流式细胞术在免疫学的应用11二、流式免疫学染色方法二、流式免疫学染色方法间间接免疫荧光标记法接免疫荧光标记法：缺点缺点：由于二抗常为多克隆抗体由于二抗常为多克隆抗体，非非特异性荧光背景较强特异性荧光背景较强，非特异性结非特异性结合较多合较多，影响了实验结果的分析影响了实验结果的分析，因此因此，在样品制备的同时应增设阴在样品制备的同时应增设阴阳性对照阳性对照，避免测定结果的假阳性避免测定结果的假阳性，另外另外，由于间接免疫荧光标记步骤由于间接免疫荧光标记步骤较多较多，增加了细胞的丢失增加了细胞的丢失流式细胞术在免疫学的应用12三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术混合细
7、胞群体的区分混合细胞群体的区分：在制备好的单细胞悬液中在制备好的单细胞悬液中，常含有不同大小、形常含有不同大小、形 状状 的的 细细 胞胞 群群，对于不同的细胞群对于不同的细胞群，常用常用90光散射和前向角散射区分其光散射和前向角散射区分其体积大小体积大小，然后可以通过计算机然后可以通过计算机画出地形图画出地形图，等高线图或点阵图等高线图或点阵图，画出不同细胞群的范围画出不同细胞群的范围，选择有选择有用的细胞群体用的细胞群体流式细胞术在免疫学的应用13三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术混合细胞群体的区分混合细胞群体的区分：流式细胞术在免疫学的应用14三、免疫荧光测定的
8、标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术混合细胞群体的区分混合细胞群体的区分：这种区分细胞群体的方法简便这种区分细胞群体的方法简便。然而然而，固定剂固定后的细胞可能会固定剂固定后的细胞可能会改变某些细胞的光散射的特性改变某些细胞的光散射的特性，在在区分细胞群体时应加以考虑区分细胞群体时应加以考虑。常用常用的另一种区分细胞的方法是利用某的另一种区分细胞的方法是利用某些染料对死活细胞膜的穿透性不同些染料对死活细胞膜的穿透性不同，核着色与否这些特点进行区分核着色与否这些特点进行区分流式细胞术在免疫学的应用15三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术混合细胞群体的区分混合细胞群体
9、的区分：如如PI染料染色培养后的细胞染料染色培养后的细胞，死细胞内有死细胞内有PI染料发出较强的染料发出较强的荧光，荧光，而活细胞由于膜的选择性通透而活细胞由于膜的选择性通透，阻阻挡了挡了PI染料进入细胞内染料进入细胞内，因此所发因此所发出的荧光很弱出的荧光很弱流式细胞术在免疫学的应用16三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术免疫荧光染料免疫荧光染料常用的免疫荧光染料有常用的免疫荧光染料有：异硫异硫氰氰荧光素荧光素(FITC)藻胆蛋白类染料藻胆蛋白类染料 藻红蛋白藻红蛋白(PE)藻青蛋白藻青蛋白 别藻红蛋白别藻红蛋白德州红德州红(Texas Red)流式细胞术在免疫学的应
10、用17三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术免疫荧光染料：免疫荧光染料：这几种染料都能与纯化的单这几种染料都能与纯化的单克隆抗体结合克隆抗体结合，可以在较广范的可以在较广范的波长范围内被有效地激发波长范围内被有效地激发，其发其发射光容易被区分射光容易被区分，分别为红、绿分别为红、绿橙色橙色流式细胞术在免疫学的应用18三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术免疫荧光染料：免疫荧光染料：用两种染料结合两种不同的用两种染料结合两种不同的抗体抗体，每一种细胞结合抗体的荧每一种细胞结合抗体的荧光都是不同的光都是不同的，用不同的探测器用不同的探测器测定不同的发射波
11、长测定不同的发射波长，这样可以，这样可以同时检测一个细胞的两个参数同时检测一个细胞的两个参数流式细胞术在免疫学的应用19三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术免疫荧光染料：免疫荧光染料：FITC和和PE两种染料都可以两种染料都可以在在488nm被激发，它们被激发，它们可同时可同时与与两种不同的抗体结合两种不同的抗体结合，FITC的荧的荧光发射在绿区光发射在绿区，大约大约530nm，而而PE的发射在橙红区，大约在的发射在橙红区，大约在570nm以上，它们适用于同时区以上，它们适用于同时区分不同抗原位点的细胞群分不同抗原位点的细胞群流式细胞术在免疫学的应用20三、免疫荧光测定
12、的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术标本的保存和固定：标本的保存和固定：在实验中，染色后的标本常常在实验中，染色后的标本常常不能及时上机检测不能及时上机检测。在这种情况下，在这种情况下，应该把染好的标本进行固定应该把染好的标本进行固定流式细胞术在免疫学的应用21三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术标本的保存和固定：标本的保存和固定：FCM免疫方法对固定剂的要免疫方法对固定剂的要求比较严格，固定剂必须有效地求比较严格，固定剂必须有效地固定细胞并保护细胞内抗原或细固定细胞并保护细胞内抗原或细胞膜表面抗原特性不受破坏，又胞膜表面抗原特性不受破坏，又必须使被固定细胞的细
13、胞膜对抗必须使被固定细胞的细胞膜对抗体有一定的通透性，使其能够进体有一定的通透性，使其能够进入细胞内与相应抗原结合入细胞内与相应抗原结合流式细胞术在免疫学的应用22三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术标本的保存和固定：标本的保存和固定：醇类、醇类、醛醛类固定剂易导致所固类固定剂易导致所固定的细胞缩小变形，一般常用定的细胞缩小变形，一般常用1-4%的多聚甲的多聚甲醛醛缓冲液缓冲液(pH7.4)进行进行固定固定，或用或用0.37-1.5%的甲的甲醛醛缓冲缓冲液液(pH7.4)固定固定，固定液加入后混，固定液加入后混匀置匀置4储存，一般不超过一周，储存，一般不超过一周，在上机
14、前用在上机前用PBS或相应的缓冲液洗或相应的缓冲液洗涤涤流式细胞术在免疫学的应用23三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术标本的保存和固定：标本的保存和固定：这种固定方法对染色后的标本来这种固定方法对染色后的标本来说，固定程序简单，对细胞体积，光说，固定程序简单，对细胞体积，光散射及荧光特性都无明显影响散射及荧光特性都无明显影响。另外，另外，这些这些醛醛类的固定剂的另一优点是具有类的固定剂的另一优点是具有消毒作用，能够杀灭组织中存在的各消毒作用，能够杀灭组织中存在的各类肝炎病毒类肝炎病毒，也可灭活，也可灭活其他传染性毒其他传染性毒素，对工作人员的自我保护来说，它素，对工作
15、人员的自我保护来说，它是很好的固定剂和消毒液是很好的固定剂和消毒液流式细胞术在免疫学的应用24三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术标本的保存和固定：标本的保存和固定：同时同时，在单细胞悬液制备过程在单细胞悬液制备过程中不能使用酶消化方法中不能使用酶消化方法，否则将破否则将破坏细胞膜表面抗原物质结构坏细胞膜表面抗原物质结构流式细胞术在免疫学的应用25三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术阳性标准和阴性对照：阳性标准和阴性对照：在在FCM样品制备过程中样品制备过程中，不同细胞亚群的免疫荧光测定不同细胞亚群的免疫荧光测定，应设定一个阳性与阴性应设定一个阳
16、性与阴性对照对照流式细胞术在免疫学的应用26三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术阳性标准和阴性对照：阳性标准和阴性对照：如对淋巴细胞和如对淋巴细胞和白白细胞悬液用细胞悬液用抗抗白白细胞抗体和抗淋巴细胞抗体进细胞抗体和抗淋巴细胞抗体进行标记行标记，将细胞悬液分为三份将细胞悬液分为三份流式细胞术在免疫学的应用27三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术阳性标准和阴性对照：阳性标准和阴性对照：第一份细胞悬液直接加入二抗第一份细胞悬液直接加入二抗(FITc-羊抗鼠羊抗鼠IgG)；第二份悬液先第二份悬液先加入抗白细胞抗体加入抗白细胞抗体，然后在加入第然后在加入
17、第二抗体二抗体；第三份悬液先加入抗淋巴第三份悬液先加入抗淋巴细胞单克隆抗体细胞单克隆抗体，再加入第二抗体再加入第二抗体流式细胞术在免疫学的应用28三、免疫荧光测定的标本处理技术三、免疫荧光测定的标本处理技术阳性标准和阴性对照：阳性标准和阴性对照：分别将这三种标记后的细胞悬分别将这三种标记后的细胞悬液上机检测液上机检测，第一份悬液细胞的荧第一份悬液细胞的荧光强度最低光强度最低，无阳性结合细胞无阳性结合细胞，第第二份有少量的细胞表达二份有少量的细胞表达，说明该悬说明该悬液中自细胞较少液中自细胞较少，第三份有较多的第三份有较多的阳性细胞表达阳性细胞表达，证明有大量的淋巴证明有大量的淋巴细胞存在细胞存
18、在流式细胞术在免疫学的应用29四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记 与人体免疫功能有关的主要与人体免疫功能有关的主要是淋巴细胞，具有细胞免疫功能是淋巴细胞，具有细胞免疫功能主要是淋巴细胞中的主要是淋巴细胞中的T细胞亚群，细胞亚群，而而B细胞与体液免疫功能有关细胞与体液免疫功能有关流式细胞术在免疫学的应用30四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群的功能细胞亚群的功能:T细胞亚群在适应性免疫应答细胞亚群在适应性免疫应答中起着关键作用，中起着关键作用，T细胞亚群的变细胞亚群的变化直接影响机体的免疫状态的强化直接影响机体的免疫状态的强弱和结局，对于适
19、应性免疫反应弱和结局，对于适应性免疫反应功能在时间、空间层面上的质与功能在时间、空间层面上的质与量的评价，可以通过量的评价，可以通过T细胞亚群分细胞亚群分布和功能检测来实现布和功能检测来实现 流式细胞术在免疫学的应用31四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群的功能细胞亚群的功能:目前越来越多的研究表明目前越来越多的研究表明，T淋巴细胞亚群在各种临床疾病淋巴细胞亚群在各种临床疾病(如如：造血系统疾病造血系统疾病，病毒感染和恶性病毒感染和恶性肿瘤等肿瘤等)都有异常改变都有异常改变。在各种疾病的发生发展过程在各种疾病的发生发展过程中测定人外周血中中测定人外周血中T抑制抑
20、制(T8)和和T辅助辅助(T4)淋巴细胞亚群比例淋巴细胞亚群比例，可，可用来用来评价体内细胞免疫调节平衡评价体内细胞免疫调节平衡状态状态流式细胞术在免疫学的应用32四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群的功能细胞亚群的功能:测定测定T亚群的相对标记率亚群的相对标记率，特特别是别是T细胞的免疫调节功能细胞的免疫调节功能，可以可以帮助研究各种与免疫有关的疾病发帮助研究各种与免疫有关的疾病发病机制病机制。所以所以，它可以作为临床免它可以作为临床免疫研究的手段疫研究的手段，成为临床检验的一成为临床检验的一项重要指标项重要指标流式细胞术在免疫学的应用33四、四、T淋巴细胞及
21、其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞的功能及检测参数：细胞的功能及检测参数：1 抗原识别：主要通过检测抗原识别：主要通过检测T细胞受细胞受体体(简称为简称为TCR)与其相应的配体与其相应的配体(MHC-主要组织相容性复合物主要组织相容性复合物)2 2 T细胞活化：活化早期可以检测细胞活化：活化早期可以检测活化的表型物质活化的表型物质CD25、CD71、CD69或或MHC-分子和细胞因子分子和细胞因子IFN-、TNF-2等。也可检测细胞等。也可检测细胞内钙离子升高和酪氨酸磷酸化酶内钙离子升高和酪氨酸磷酸化酶等等流式细胞术在免疫学的应用34四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群
22、免疫标记T细胞的功能及检测参数：细胞的功能及检测参数：3 T细胞增殖：细胞增殖：DNA细胞周期和细胞周期和Brdu掺入法，或者分析细胞周期掺入法，或者分析细胞周期相关蛋白等相关蛋白等(如如Cyclin-D1、D2、D3、E）4 4 T细胞克隆扩增：可以检测细胞克隆扩增：可以检测T细胞受体细胞受体V基因片断产物，应用基因片断产物，应用其相应单克隆抗体，定量分析基其相应单克隆抗体，定量分析基因片断的取用频率，这是一项检因片断的取用频率，这是一项检测测T细胞克隆的新技术细胞克隆的新技术流式细胞术在免疫学的应用35四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞的功能及检测参数：细胞的
23、功能及检测参数：5 T细胞分化：细胞分化：Th(Th1 Th2)，Ts(Tsc/Ts)可以用细胞内细胞因子可以用细胞内细胞因子以及体液或培养液中的细胞因以及体液或培养液中的细胞因子，应用微球夹心免疫荧光法，子，应用微球夹心免疫荧光法，这是近年来发展的一项新技术这是近年来发展的一项新技术流式细胞术在免疫学的应用36四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞的功能及检测参数：细胞的功能及检测参数：6 T细胞的效应作用：可以检测细胞的效应作用：可以检测Fas、FasL、颗粒酶或可检颗粒酶或可检测细胞内凋亡指数测细胞内凋亡指数Annexin-V(磷酸酯丝氨酸酶磷酸酯丝氨酸酶)等，
24、也可等，也可检测检测Caspase酶酶(凋亡酶系统凋亡酶系统)7 T细胞免疫记忆功能：常用细胞免疫记忆功能：常用8 CD45亚型亚型(CD45RO)流式细胞术在免疫学的应用37四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞的免疫表型细胞的免疫表型：根据根据T淋巴细胞免疫表型和功能分为淋巴细胞免疫表型和功能分为T总淋巴细胞总淋巴细胞 CD3+T辅助性细胞辅助性细胞 CD4+/CD3+T抑制性细胞抑制性细胞 CD8+/CD3+NK细胞细胞 CD56+/CD3+流式细胞术在免疫学的应用38四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记流式细胞术在免疫学的应用39四、四、
25、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记流式细胞术在免疫学的应用40四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记NoImage流式细胞术在免疫学的应用41四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记FCM检测检测T细胞亚群的参考值：细胞亚群的参考值：细胞表面抗细胞表面抗原原正常人参考范围正常人参考范围CD361.1%77.0%CD435.4%52.0%CD818.4%31.2%CD5610.4%19.8%CD4/CD80.98 1.94 流式细胞术在免疫学的应用42四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群的生物学意义：细胞亚群的
26、生物学意义：1 T3+升高、升高、T4+升高提示免疫功升高提示免疫功能增强，在这里并不单指细胞数能增强，在这里并不单指细胞数量增加，还应该将量增加，还应该将T3+、T4+表达表达量量(荧光量荧光量)增加也视为免疫功能增增加也视为免疫功能增强强流式细胞术在免疫学的应用43四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群的生物学意义：细胞亚群的生物学意义：2 T8+升高提示免疫功能降低，但升高提示免疫功能降低，但是是T抑制细胞中有一群抑制细胞中有一群T毒性细胞，毒性细胞，当当T毒性细胞增高时常产生自体及毒性细胞增高时常产生自体及异体细胞破坏功能增强，那将造成异体细胞破坏功能增强
27、，那将造成自身免疫性疾病的发生，在器官移自身免疫性疾病的发生，在器官移植术后产生对异体器官的排异反应植术后产生对异体器官的排异反应流式细胞术在免疫学的应用44四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群的生物学意义：细胞亚群的生物学意义：3 NK细胞表达阳性增加，表达自细胞表达阳性增加，表达自然杀伤功能增强和执行免疫监视功然杀伤功能增强和执行免疫监视功能增强能增强流式细胞术在免疫学的应用45四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群的生物学意义：细胞亚群的生物学意义：4 T4/T8比值升高提示免疫功能比值升高提示免疫功能增强，但常与一些自身免疫
28、性增强，但常与一些自身免疫性疾病有关疾病有关(如类风湿、塞莱斯氏如类风湿、塞莱斯氏综合症综合症)5 T4/T8比值降低提示免疫功能比值降低提示免疫功能降低，如在恶性肿瘤、病毒感降低，如在恶性肿瘤、病毒感染、再障性贫血等，尤其在染、再障性贫血等，尤其在AIDS病时具有特异性极高的诊病时具有特异性极高的诊断价值断价值流式细胞术在免疫学的应用46四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群流式免疫标记程序细胞亚群流式免疫标记程序：在进行淋巴细胞亚群标记时在进行淋巴细胞亚群标记时，目目前人们常利用全血进行标记前人们常利用全血进行标记，在在加入加入抗体抗体后加入后加入lysing
29、红细胞溶解液红细胞溶解液，3-5min后后，加入加入PBS洗去血红蛋白洗去血红蛋白，并并重新悬浮于重新悬浮于lml PBS中中，上机检测上机检测，该方法的优点是该方法的优点是，用血量少用血量少，一般每一般每种抗体用全血种抗体用全血20ul即可即可，且操作步骤且操作步骤简便简便流式细胞术在免疫学的应用47四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群流式免疫标记程序细胞亚群流式免疫标记程序：Lysing溶解液的配制溶解液的配制:0.83%氯化氯化胺，胺，0.55mM Na-EDTA0.1%碳酸氢碳酸氢钾，钾，调调pH7.3流式细胞术在免疫学的应用48四、四、T淋巴细胞及其亚
30、群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群流式免疫标记程序细胞亚群流式免疫标记程序：免疫荧光直接标记法免疫荧光直接标记法l)取淋巴细胞混悬液取淋巴细胞混悬液l106细胞细胞/ml，50ul2)加入标有荧光素的单克隆抗体工作液加入标有荧光素的单克隆抗体工作液50ul3)37水浴水浴30min，避光避光4)加入加入PBS 10ml，混匀混匀5)离心离心1000rpm，10min，弃上清弃上清流式细胞术在免疫学的应用49四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群流式免疫标记程序细胞亚群流式免疫标记程序：免疫荧光直接标记法免疫荧光直接标记法6)重复重复4、5步骤步骤7)加入
31、加入1ml PBS 缓冲液混匀缓冲液混匀8)上机检测上机检测流式细胞术在免疫学的应用50四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群流式免疫标记程序细胞亚群流式免疫标记程序：免疫荧光免疫荧光间接间接标记法标记法l)取淋巴细胞混悬液取淋巴细胞混悬液l106细胞细胞/ml，50ul2)加入抗加入抗T细胞亚群的单抗工作液细胞亚群的单抗工作液50ul3)37水浴水浴30min4)加入加入PBS 10ml混匀混匀5)离心离心1000rpm，10min，弃上清弃上清流式细胞术在免疫学的应用51四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群流式免疫标记程序细胞亚
32、群流式免疫标记程序：免疫荧光免疫荧光间接间接标记法标记法6)加入加入FITC羊抗鼠羊抗鼠IgG第二抗体第二抗体50ul7)37水浴水浴30min，避光避光8)加入加入10ml PBS，混匀混匀9)离心离心1000rpm，10min，弃上清弃上清流式细胞术在免疫学的应用52四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记T细胞亚群流式免疫标记程序细胞亚群流式免疫标记程序：免疫荧光免疫荧光间接间接标记法标记法l0)重复重复8、9步骤步骤11)加入加入1ml PBS 液混匀液混匀12)上机检测上机检测流式细胞术在免疫学的应用53五、造血系统的分化抗原及白血病抗原标记五、造血系统的分化抗原及
33、白血病抗原标记 骨髓是一个细胞群体的造血器官骨髓是一个细胞群体的造血器官，正常人出生后正常人出生后，它是血细胞唯一的生它是血细胞唯一的生长、发育、分化的场所长、发育、分化的场所，淋巴、单核、淋巴、单核、巨噬、粒系在正常分化成熟过程的不巨噬、粒系在正常分化成熟过程的不同阶段出现或消失细胞表面抗原。这同阶段出现或消失细胞表面抗原。这些抗原是具有一定功能的生物效应分些抗原是具有一定功能的生物效应分子子，它们参与免疫应答和调控作用它们参与免疫应答和调控作用流式细胞术在免疫学的应用54五、造血系统的分化抗原及白血病抗原标记五、造血系统的分化抗原及白血病抗原标记 用单抗可以将急淋分为用单抗可以将急淋分为:
34、T细胞细胞急淋急淋(T-ALL)，B细胞急淋细胞急淋(B-ALL)，普通型急淋普通型急淋(C-ALL)和无标志型急和无标志型急淋淋(NULL-ALL)。它们在治疗和预后上不同，所它们在治疗和预后上不同，所以，利用不同类型白血病细胞上表以，利用不同类型白血病细胞上表达某些分化抗原这一特点，可以对达某些分化抗原这一特点，可以对白血病进行白血病进行详细分型，并给予详细分型，并给予导向导向治疗治疗流式细胞术在免疫学的应用56五、造血系统的分化抗原及白血病抗原标记五、造血系统的分化抗原及白血病抗原标记 此外，此外，白血病细胞膜表面标记白血病细胞膜表面标记的表达与预后的表达与预后之间也有密切之间也有密切关
35、系关系 流式免疫荧光标记造血系统的流式免疫荧光标记造血系统的细胞抗原细胞抗原，其基本原理其基本原理，实验方法实验方法，步骤与淋巴细胞亚群免疫标记相同步骤与淋巴细胞亚群免疫标记相同，不再赘述不再赘述流式细胞术在免疫学的应用57六、血小板膜表面受体的标记六、血小板膜表面受体的标记 血小板是巨核细胞分化成熟血小板是巨核细胞分化成熟后后，巨核细胞浆裂解脱落的小块巨核细胞浆裂解脱落的小块细胞质细胞质，它的最表层富含糖蛋它的最表层富含糖蛋白白和一些酶和一些酶，是血小板表面特异吸是血小板表面特异吸附的血浆成分附的血浆成分，也是血小板粘着、也是血小板粘着、聚集的反应部位聚集的反应部位，血小板膜上含血小板膜上含
36、有多种与凝血有关的因子有多种与凝血有关的因子，在止在止血血，凝血凝血，维持血管内皮的完整维持血管内皮的完整性方面具有重要的生理功能性方面具有重要的生理功能流式细胞术在免疫学的应用58六、血小板膜表面受体的标记六、血小板膜表面受体的标记 目前认为与血小板有关的血小目前认为与血小板有关的血小板膜受体有板膜受体有2b、3a、2b-3a复合物复合物，1b、VWF、GMP-140、Fg等等。其检其检测方法不尽相同测方法不尽相同，有有SDA-PAGE法法，交叉免疫电泳法交叉免疫电泳法，这种方法难于检这种方法难于检出较低含量的膜受体出较低含量的膜受体，而免疫印迹而免疫印迹法的灵敏度较高法的灵敏度较高，但标本
37、用量大但标本用量大，操作复杂耗时长操作复杂耗时长，膜纯化过程中受膜纯化过程中受体变化大体变化大，易丢失易丢失。临床实验室较临床实验室较少应用放免法少应用放免法，易受其他细胞的干易受其他细胞的干扰或一个抗原分子结合多个抗体而扰或一个抗原分子结合多个抗体而导致测定结果偏高等缺点导致测定结果偏高等缺点流式细胞术在免疫学的应用59六、血小板膜表面受体的标记六、血小板膜表面受体的标记 用用FCM检测血小板膜受体检测血小板膜受体，是分析血小板方法学上的重要进是分析血小板方法学上的重要进展展，它从分子水平诊断血小板功它从分子水平诊断血小板功能和数量的异常能和数量的异常，方法操作简便、方法操作简便、快速、特异
38、和准确度高快速、特异和准确度高，重复性重复性好好，且标本的用量少且标本的用量少，能灵敏地能灵敏地从大量血小板中检出从大量血小板中检出2%受体阳性受体阳性或阴性的血小板。因此或阴性的血小板。因此，流式细流式细胞测定血小板膜受体数量和功能胞测定血小板膜受体数量和功能很适合作为临床检验很适合作为临床检验流式细胞术在免疫学的应用60六、血小板膜表面受体的标记六、血小板膜表面受体的标记1.血小板悬液的制备血小板悬液的制备1)聚丙烯一次注射器取静脉血聚丙烯一次注射器取静脉血1-2ml，用用3.8%的的枸橼枸橼酸酸钠钠或或1%Na2EDTA抗凝置塑料管中。抗凝置塑料管中。2)800转转/分离心分离心10分钟
39、分钟，取上层血取上层血浆浆，可获得富血小板血浆可获得富血小板血浆(PRP)。3)将将PRP3500转转/分离心分离心15分钟分钟,血小血小板沉淀弃上清板沉淀弃上清流式细胞术在免疫学的应用61六、血小板膜表面受体的标记六、血小板膜表面受体的标记1.血小板悬液的制备血小板悬液的制备4)加入加入0.2ml ACD溶液悬液悬浮溶液悬液悬浮，再再加入加入1ml，Tyrode液液，混匀。混匀。5)离心离心3000转转/分分15分钟分钟，弃上清。弃上清。6)重复重复4.5步骤。步骤。7)加入加入lml 2%多聚甲多聚甲醛，醛，或或2%戊二戊二醛，醛，室温室温30分钟分钟，将其血小板固定将其血小板固定，放置放
40、置4冰箱保存可达冰箱保存可达1个月之久个月之久流式细胞术在免疫学的应用62六、血小板膜表面受体的标记六、血小板膜表面受体的标记2.血小板膜受体的标记步骤血小板膜受体的标记步骤1)取固定后的血小板悬液离心取固定后的血小板悬液离心2500转转/分分，10分钟分钟，去上清。去上清。2)加入抗血小板膜受体的相应抗体工加入抗血小板膜受体的相应抗体工作液作液0.lml，室温孵育室温孵育30分钟。分钟。3)加入加入5mlTES悬浮液悬浮液2500转转/分分，离离心心10分钟分钟，弃上清弃上清，并悬浮并悬浮流式细胞术在免疫学的应用634)加入加入FITC羊抗羊抗IgG第二抗体工作第二抗体工作液液0.1ml室温
41、孵育室温孵育30分钟。分钟。5)重复重复3)步骤。步骤。6)加入加入lmlTES悬浮液将血小板悬悬浮液将血小板悬浮。浮。7)上机检测上机检测六、血小板膜表面受体的标记六、血小板膜表面受体的标记2.血小板膜受体的标记步骤血小板膜受体的标记步骤流式细胞术在免疫学的应用64七七、FCM在在AIDS病检测的应用病检测的应用 爱滋病又称获得性免疫缺陷综合爱滋病又称获得性免疫缺陷综合症症(AIDS)，是一种近年来新发现的免是一种近年来新发现的免疫性疾病疫性疾病。其临床表现为全身衰竭其临床表现为全身衰竭，免疫机制破坏造成免疫功能下降免疫机制破坏造成免疫功能下降,本本病多发于男女青壮年病多发于男女青壮年，主要
42、通过性接主要通过性接触或感染触或感染 和和 血血 液液 传播传播，由于传染性由于传染性强和病死率极高强和病死率极高，有有 人人 称称 AIDS 病病 为为20 世纪的瘟疫和超级癌症世纪的瘟疫和超级癌症，成为世界卫生组织重点控制监测的疾成为世界卫生组织重点控制监测的疾病之一病之一，也成为当今医学卫生防治的也成为当今医学卫生防治的重点研究课题重点研究课题流式细胞术在免疫学的应用65七七、FCM在在AIDS病检测的应用病检测的应用 人类一旦感染人类一旦感染HIV之后之后，HIV主主要选择地侵入人类具有重要免疫功能要选择地侵入人类具有重要免疫功能的的T淋巴细胞亚群中的淋巴细胞亚群中的T辅助性细胞辅助性
43、细胞(其免疫表型其免疫表型 CD4Th，在其侵入在其侵入Th细细胞后胞后，病毒失去被膜病毒失去被膜，经逆转录后形经逆转录后形成单链成单链DNA，再转录后形成双链在再转录后形成双链在病人的病人的T淋巴细胞中循环复制淋巴细胞中循环复制，使具使具有重要免疫功能的有重要免疫功能的T细胞群破坏细胞群破坏，相相继累及全身免疫功能器官，使全身免继累及全身免疫功能器官，使全身免疫状态下降疫状态下降流式细胞术在免疫学的应用66七七、FCM在在AIDS病检测的应用病检测的应用 AIDS病的一个特征的免疫学诊断指病的一个特征的免疫学诊断指标，标，T淋巴细胞总数减少淋巴细胞总数减少(正常为正常为65-81%)T细胞亚
44、群比值倒置，细胞亚群比值倒置，Th/Ts1.0(正正常为常为1.3-2.1：1)尤以尤以Th细胞下降显著细胞下降显著(正正常在常在44-50%)在在920%左右，而左右，而Ts细胞细胞增高增高(正常值正常值2729%)至至35-50%，NK细细胞减少或活力下降，但胞减少或活力下降，但B淋巴细胞群则在淋巴细胞群则在正常范围，正常范围，Tc亚群的单克隆抗体亚群的单克隆抗体CD3、CD4、CD8已大量生产已大量生产流式细胞术在免疫学的应用67七七、FCM在在AIDS病检测的应用病检测的应用 流式细胞术用于流式细胞术用于AIDS病免疫功能的病免疫功能的检测是一个重要的先进方法，使用直标检测是一个重要的
45、先进方法，使用直标或间标免疫荧光法，同时对或间标免疫荧光法，同时对TH(CD4)和和TS(CD8)进行双参数标记或三参数标记进行双参数标记或三参数标记测定计数，目前国内外都已进行了大量测定计数，目前国内外都已进行了大量FCM检测检测AIDS 病免疫功能研究，发现病免疫功能研究，发现CD4的的T细胞绝对数进行性减少，细胞绝对数进行性减少，FCM与抗与抗Tc亚群单抗的结合应用，将在亚群单抗的结合应用，将在AIDS病的检测和研究方面起重要作用病的检测和研究方面起重要作用流式细胞术在免疫学的应用68四、四、T淋巴细胞及其亚群免疫标记淋巴细胞及其亚群免疫标记FCM检测检测T细胞亚群的参考值：细胞亚群的参考值：细胞表面抗细胞表面抗原原正常人参考范围正常人参考范围CD361.1%77.0%CD435.4%52.0%CD818.4%31.2%CD5610.4%19.8%CD4/CD80.98 1.94 流式细胞术在免疫学的应用69
