1、2007-9-10Bitab1细菌内毒素检查技术细菌内毒素检查技术讲讲 义义北京毕特博生物技术有限责任公司2007年9月2007-9-10Bitab2目 录一、细菌内毒素检查的基础理论-3二、BET试验前的准备-24三、细菌内毒素检查的实验技术-281，鲎试剂灵敏度复核-332，干扰初筛试验-403，干扰试验-494，检查法-62四、细菌内毒素检测技术的发展2007-9-10Bitab3一、细菌内毒素检查的基础理论1，细菌内毒素2，鲎试剂3，BET用水4，BET程序5，2005年版细菌内毒素检查法6，相关参数的计算7，试验的相关知识2007-9-10Bitab41、细菌内毒素、细菌内毒素1 1
2、）化学成分及特性）化学成分及特性 -革兰氏阴性细菌细胞壁的产物革兰氏阴性细菌细胞壁的产物 -是高分子量脂多糖复合物（是高分子量脂多糖复合物（LPSLPS）除上述性质外，除上述性质外，LPS还有许多其他的生物活性还有许多其他的生物活性致热致热性性耐热耐热性性酸碱性酸碱性与鲎试剂反应与鲎试剂反应分子极性分子极性需要在需要在250摄氏度干热至少摄氏度干热至少3060分钟才能彻底灭分钟才能彻底灭活活多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性，多糖链有亲水性，脂肪链具有疏水性，在水中呈不均匀分布在水中呈不均匀分布内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原，内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原，再刺激下丘脑体温调
3、节中枢，引起发热反应再刺激下丘脑体温调节中枢，引起发热反应与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶胶与强酸强碱水解反应与强酸强碱水解反应（1 1）特性特性2007-9-10Bitab5内毒素的分子结构内毒素的分子结构（2）化学结构 -含有3个截然不同的区域O-特异侧链核心多糖类脂A2007-9-10Bitab62）内毒素与热原的关系内毒素与热原的关系 -内毒素是热原之一种-医药工业接受的观点是，内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原，控制内毒素污染就等于控制热原污染。3）标准内毒素和环境内毒素）标准内毒素和环境内毒素1）标准内毒素经人工提取精制并经生物效价测
4、定的细菌内毒素，作为BET检查的参考品或对照品。主要分参考标准品（RSE）及工作标准品（CSE）。CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际）。2）环境内毒素天然产生的内毒素，普遍存在于水、空气及各种原料中，成分除了脂多糖外还含有较多的蛋白质、多糖和其他杂质，其极性不明显，致热性较标准内毒素弱。BET的对象是环境内毒素。2007-9-10Bitab74）标准内毒素溶液（）标准内毒素溶液（C溶液）的制备溶液）的制备1）中国药典）中国药典2005年版的年版的BET法规定，将细菌内毒素国家标法规定，将细菌内毒素国家标准品用细菌内毒素检查用水溶
5、解后，需在旋涡混合器上混匀准品用细菌内毒素检查用水溶解后，需在旋涡混合器上混匀15分钟，以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀分钟，以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟，秒钟，其他国家药典都有类似要求其他国家药典都有类似要求-具有极性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布具有极性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布2007-9-10Bitab82、鲎试剂1 1）鲎试剂的分类）鲎试剂的分类-根据鲎的种类分类 美洲鲎试剂(LAL)中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL）-根据检查方法分类 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂-根据鲎试剂的反应特异性分类 普通鲎试剂 特异型鲎试剂2007-9-10Bitab92 2）鲎试
6、剂的规格）鲎试剂的规格-一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量试剂）-把自身的包装容器作为反应管的试剂称为单次试验试剂，在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次试验试剂-多次试验试剂有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用时应先用相应量的溶解液复溶鲎试剂。2007-9-10Bitab103 3）鲎试剂的质量标准）鲎试剂的质量标准-灵敏度灵敏度 定义：再细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生凝集的标准内毒素的最低浓度，单位EU/ml。常用鲎试剂的灵敏度：0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml-自身凝集自身凝集 部颁标准，
7、鲎试剂的阴性对照在37度4小时不产生凝集反应-缓冲能力缓冲能力-干燥失重干燥失重-无菌无菌：中国标准无此项要求2007-9-10Bitab114）鲎试剂与内毒素的反应机理）鲎试剂与内毒素的反应机理C因子因子活化的活化的C因子因子内毒素内毒素活化的活化的B因子因子B因子因子凝固酶凝固酶凝固酶原凝固酶原凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白（凝胶）凝固蛋白原凝固蛋白原葡聚糖或葡聚糖或LAL-RM活化的活化的G因子因子G因子因子二价阳离子二价阳离子AC-lle-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物）AC-lle-Glu-Ala-Arg-OHpNA405nm测吸光度值（对硝基苯胺 黄色）2007-9-10Bit
8、ab123、BET用水2000年版药典要求，BET用水应为与0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在371条件下24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。2005年版药典要求，凝胶法BET用水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET用水内毒素含量应少于0.005EU/ml。美国药典要求的BET用水是指与所使用的鲎试剂不发生反应的灭菌注射用水或其他水。2007-9-10Bitab134、BET程序1）验证实验凝胶法凝胶法光度测定法光度测定法2）检查法 凝胶法凝胶法光度测定法 动态法动态法 终点法终点法：终点比色法试验灵敏度的复核试验干扰试验标准曲线可靠性试验干扰试验
9、凝胶限量试验 凝胶半定量试验 动态比浊法试验动态比色法试验动态终点法动态终点法2007-9-10Bitab145、中国药典2005年版细菌内毒素检查法1 1）综述部分）综述部分细菌内毒素检查法的定义及BET方法学分类内毒素标准品及检查用水BET器具的要求供试品溶液的要求内毒素限值的确定最大有效稀释倍数的计算2007-9-10Bitab15 2 2）试验部分）试验部分（1 1）凝胶法）凝胶法鲎试剂灵敏度复核试验干扰试验检查法（2 2）光度测定法）光度测定法标准曲线的可靠性试验干扰试验检查法3 3）20052005年版药典年版药典BETBET法际验部分主要内容法际验部分主要内容凝胶限量试验凝胶半定
10、量试验2007-9-10Bitab16鲎 试 验 方 法凝胶法光度测定法限量法半定量法动态法终点法动 态浊度法动 态显色法终 点浊度法终 点 显色法灵敏度以标示灵敏度表示以标准曲线最低浓度表示预试验1灵敏度复核试验各浓度平行4管,NC 2管标准曲线验证试验各浓度平行3管，NC 2管有效条件D阴性0.5c2|0.980 TDTC（对动态法而言）预试验2干扰试验干扰试验无干扰条件A、D阴性 0.5Es2 0.5EsEt2Es|0.980 50%R200%TDTC检查法A、B、C、D各平行2管(共8管)A、B、C、D各平行2管(共12管)有效条件 B、C阳性 D阴性|0.980 50%R200%TD
11、TC2007-9-10Bitab17 1 1）内毒素限值）内毒素限值 （1）药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/ML为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg(活性单位)表示；K为人每公斤体重每小时科接受的最大内毒素剂量，以EU/(kgh)表示，注射剂K=5 EU/(kgh),放射性药品注射剂K=2 EU/(kgh),鞘内用注射剂K=0.2 EU/(kgh),M为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(kgh)、mg/(kgh)、U/(kgh)表示，人均体重按60Kg计算，注射试剂若不足1小时，按1小时计算。6、相关参数的计算2007-9-10Bita
12、b18（2 2）内毒素限值计算举例）内毒素限值计算举例-注射用的头孢曲松钠舒巴坦钠，成人最大剂量为1500mg/次 L=0.20EU/mg-注射用人头孢孟多酯钠，成人每日剂量为2.0至8.0g，分3至4次给药，一日最高剂量不超过12g L=0.075EU/mg-对于大输液（LVP）,美国药典（USP）通常都取L值为0.5EU/ml 5 EU/(kgh)1500 mg/(60kgh)5 EU/(kgh)(12000mg/3)/(60kgh)2007-9-10Bitab192 2）最大有效稀释倍数）最大有效稀释倍数-供试品最大有效稀释倍数（MVD）按以下公式计算 MVD=CL/C为供试品溶液的浓度
13、，其中当L以EU/ml表示时，C为1.0ml/ml;当L以EU/mg或EU/U表示时,C的单位为mg/ml或 U/ml。凝胶发中，为鲎试剂的灵敏度光度测定法中，为标准曲线最低浓度-如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴钠（浓度为10mg/ml,L=0.2EU/mg）的最大有效稀释倍数为 MVD=8(倍)10mg/ml x 0.2EU/mg0.25EU/ml2007-9-10Bitab203 3）最低有效稀释浓度）最低有效稀释浓度(MVC)(MVC)-MVC=/L-如使用鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml，注射用头孢曲松钠舒巴钠的最低有效浓度为 MVC=1.25mg/ml4)
14、4)样品稀释过程中加液量的计算样品稀释过程中加液量的计算-稀释过程中，假设从溶液S1取（x）ml溶液稀释（n）倍至S2，加液量为（y）,则满足：y=(n-1)X x-如从溶液S1取0.5ml稀释3.8倍至S2,则加液量为：y=(3.8-1)X 0.5=1.4ml 即0.5ml的S1加1.4ml稀释液即得S1的3.8倍稀释液S20.20EU/mg0.25EU/ml2007-9-10Bitab217、试验相关知识1)1)内毒素标准品的使用内毒素标准品的使用（1 1）复溶）复溶-复溶2ml安瓿装的内毒素标准品，为了避免溶液再混合时溢出安瓿，我们建议在安瓿颈部上方开口加液。复溶液的体积一般为1ml,或
15、根据使用说明书加液。（2 2）效价）效价-厂家必须向用户提供一份效价分析证书（Certificate of Analysis,CoA）效价分析证书应注明：RSE/CSE _EU/mg;_ng/瓶2007-9-10Bitab222)2)鲎试剂的使用鲎试剂的使用-使用前，应将鲎试剂置于室温环境下使其大道室温温度鲎再复溶使用-复溶鲎试剂鲎，应避免强烈振动产生泡沫-由于鲎试剂与内毒素凝集反应的不可逆性，反应过程中必须避免反应试管的振动造成假阳性3）内毒素的清除）内毒素的清除（1）冲洗冲洗适用于器械组件、塞子等可用于加热等方法提高清除效率（2）蒸馏）蒸馏，折流系统和地心引力阻止大分子量的LPS转变为蒸汽
16、状态逸出（3）反渗）反渗透 （4）超滤 （5）活性炭吸附2007-9-10Bitab234）内毒素的灭活）内毒素的灭活（1 1）酸酸/碱水解碱水解（2 2）氧化）氧化 -H2O2（3 3）干热）干热 -250，30分钟的干烤2007-9-10Bitab24二、BET试验前的准备1.在细菌内毒素检查试验中，凡是与试验样品或试剂接触的器具必须经过除热原处理。n玻璃器皿一般用洗液浸泡4小时后，用自来水冲洗，再用真馏水冲洗、晾干。最后在280干烤至少120分钟。2007-9-10Bitab252.试验所试用的器具主要包括有：n无热原稀释管n无热原玻璃移液管n无热原玻璃毛细管n稀释试管架n安瓿试管架n反
17、应试管架n可调移液器n连接胶粒n无热原吸头n安瓿开启器n70%的异丙醇浸泡的无纺布拭布2007-9-10Bitab263.实验中也可用一次性的无热原塑料器械。n如用可调移液器和无热原吸头代替无热院玻璃移液管取液等。n在使用可调移液器连接无热原毛细管吸取微量溶液时，采用多吸少打方式。避免由于毛细管的虹吸作用带来的加样误差；也可避免微量加样时产生气泡。2007-9-10Bitab274.细菌内毒素检查实验的恒温反应在37的恒温器中进行。nTAL-40型试管恒温仪（安度斯设计生产），专门用于细菌内毒素检查的恒温仪器。具有A,温度稳定；B,加热均匀；C,定时报警等特点2007-9-10Bitab28三
18、、凝胶法细菌内毒素检查技术1，凝胶法，凝胶法BET试验程序试验程序2，试验器具，试验器具3，鲎试剂灵敏度复核，鲎试剂灵敏度复核4，干扰初筛试验，干扰初筛试验5，干扰试验，干扰试验6，检查法，检查法2007-9-10Bitab291、凝胶法、凝胶法BET的实验程序的实验程序1）试验准备：试剂、仪器及实验用具等）试验准备：试剂、仪器及实验用具等2）确定供试品的内毒素限值（）确定供试品的内毒素限值（L）3）选择鲎试剂（）选择鲎试剂（）4）计算供试品的最大有效稀释（）计算供试品的最大有效稀释（MVD）或最低有效浓度）或最低有效浓度（MVC）5）鲎试剂灵敏度复核）鲎试剂灵敏度复核6）供试品干扰初筛试验（
19、建议试验）供试品干扰初筛试验（建议试验）7）供试品干扰验证试验）供试品干扰验证试验8）供试品日常检查）供试品日常检查2007-9-10Bitab302、试验器具、试验器具1）器具的要求及处理器具的要求及处理-玻璃器皿需除热原处理，以除去可能存在的外源性内毒素，玻璃器皿需除热原处理，以除去可能存在的外源性内毒素，常用方法是玻璃器皿经清洗后常用方法是玻璃器皿经清洗后250至少干烤至少干烤1小时小时 -塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械塑料器械应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械 -首选硼硅酸盐玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具首选硼硅酸盐玻璃器具或同等作用的聚苯乙烯塑料器具2）
20、孵育反应仪器）孵育反应仪器q温度精确：温度精确：37370.2 0.2 q发热均匀：发热均匀：0.1 0.1 q可定时提示：可定时提示：0 0至至9090分钟可设定定时蜂鸣提示分钟可设定定时蜂鸣提示q试管免封口试管免封口2007-9-10Bitab313、鲎试剂灵敏度复核试验、鲎试剂灵敏度复核试验1）鲎试剂灵敏度复核实验目的）鲎试剂灵敏度复核实验目的1）验证实验室的条件是否满足）验证实验室的条件是否满足BET实验的要求实验的要求2）验证实验人员的操作技能是否满足）验证实验人员的操作技能是否满足BET实验的要求实验的要求 3）验证实验所用试剂（包括鲎试剂、内毒素标准品、）验证实验所用试剂（包括鲎
21、试剂、内毒素标准品、BET用水等）是否满足用水等）是否满足BET实验的要实验的要求求2）鲎试剂灵敏度复核实验的步骤）鲎试剂灵敏度复核实验的步骤1）恒温仪器预热）恒温仪器预热2）C溶液（标准内毒素溶液）的制备溶液（标准内毒素溶液）的制备3）鲎试剂制备）鲎试剂制备4）加样及恒温反应）加样及恒温反应5）结果判断）结果判断6）数据处理）数据处理2007-9-10Bitab32稀释为稀释为2、0.5、0.25内毒素标准溶液内毒素标准溶液C溶液反应：溶液反应：0.1mlTAL0.1mlCSE(RSE)，平行，平行4管管D溶液反应：溶液反应：0.1mlTAL0.1mlBET水，平行水，平行2管管单次管：原安
22、瓿单次管：原安瓿多次管：反应试管多次管：反应试管轻轻转动瓶壁摇匀轻轻转动瓶壁摇匀每步稀释于旋涡混合器混合每步稀释于旋涡混合器混合30s旋涡混合器混合旋涡混合器混合15min混匀混匀混合混合BET水复溶水复溶BET水复溶水复溶RSE或或CSE鲎试剂鲎试剂TAL371，60min60min2min2min混匀（水浴恒温需封口）混匀（水浴恒温需封口）3）操作步骤示意图）操作步骤示意图2007-9-10Bitab334）灵敏度复核试验举例）灵敏度复核试验举例 (1)试剂试剂试剂名称 厂 家规格标示效价数 量TAL 安度斯0.1ml/支 0.25EU/ml18内毒素标准品CSE 安度斯10ng/瓶 10
23、EU/ng1BET水 安度斯50ml/瓶 0.003EU/ml12007-9-10Bitab34（2）实验前，将恒温仪器预热至）实验前，将恒温仪器预热至37（3）标准内毒素溶液（）标准内毒素溶液（C溶液）的制备溶液）的制备0.25EU/ml30s30s1EU/ml30s5min2.0ml100EU/ml0.4mlCSEBET水水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml2.0ml3.6ml2.0ml2.0ml0.125EU/ml30s2.0ml2.0ml0.06EU/ml30s2.0ml2.0ml2007-9-10Bitab35（4）鲎试剂的准备）鲎试剂的准备取0.1ml装量
24、，灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂18支，在安瓿颈部折断，按照阴性对照溶液D两支，标准内毒素溶液每浓度平行4管排列：用精确移液器准确吸取0.1mlBET水分别加入每支鲎试剂中，使鲎试剂全部溶解0.5U/ml阴性对照溶液D0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/ml2007-9-10Bitab36CSETAL0.1ml0.5EU/ml0.1ml0.1ml0.25EU/ml0.1ml0.1ml0.125EU/ml0.1ml0.1ml0.06EU/ml0.1ml0.1mlNC0.1ml（5）加）加 样样 用精确移液器分别吸取0.1ml的0.06EU/ml、0.125EU/ml、0.25
25、EU/ml、0.5EU/ml的标准内毒素溶液，加入已复溶的鲎试剂中，每平行4管，吸取0.1mlBET用水（D溶液）加入另外两支鲎试剂内，作为阴性对照。加样顺序一般从低浓度到高浓度2007-9-10Bitab37（6 6）恒温反应）恒温反应 -将加样完的混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），将加样完的混合液轻轻摇匀（避免产生气泡），放入放入37371 1 的恒温器中孵育的恒温器中孵育60602 2分钟（孵育过程中分钟（孵育过程中避免振动影响凝胶形成）避免振动影响凝胶形成）-若保温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将若保温装置是水浴恒温箱，那么在加样后需将反应管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染。的反应
26、管封口，避免水蒸气进入反应管内造成污染。的混合液需封口后再将其放入水浴中恒温反应混合液需封口后再将其放入水浴中恒温反应2007-9-10Bitab38 （6）结果判断）结果判断将反应试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转将反应试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，记录为“”；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性，记录为记录为“-”。阳性阳性阴性阴性结果判断：反应管缓缓倒转结果判断：反应管缓缓倒转180 阳性阳性
27、(+)(+)：凝胶不变形，不从管壁滑脱者：凝胶不变形，不从管壁滑脱者阴性阴性(-)(-)：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者：凝胶不能保持完整，从管壁滑脱者实验符合要求的基本条件：实验符合要求的基本条件：NCNC管全部阴性管全部阴性 （）（）22管全部阳性管全部阳性 （）（）0.250.25管全部阴性管全部阴性 （）（）2007-9-10Bitab39（7）数据处理）数据处理c=lg-1（X/4）=lg-1(0.903)(0.602)(0.602)(0.602)/4 =0.210EU/ml 即在本批号鲎试剂的复核灵敏度（即在本批号鲎试剂的复核灵敏度（c）为）为0.21EU/ml 药典要求：药典要求
28、：c在在0.5 2.0（包括包括0.5和和22）时，方可用于细菌内毒素检）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度值。为该批鲎试剂的灵敏度值。结论：本批结论：本批TALTAL的灵敏度标示值符合规定，按标示值使用的灵敏度标示值符合规定，按标示值使用!平平行行管管C溶液溶液(EU/ml)D溶溶液液反应终反应终点浓度点浓度X（lg反应终反应终点浓度）点浓度）0.50.250.1250.0610.1250.90320.250.60230.250.60240.250.6022007-9-10Bitab404、干扰初筛试验1 1）目的及原理：）目的及原理：-本试验是
29、药品与鲎试剂相容性的筛选试验，通过对一系列含2内毒素浓度的样品溶液与鲎试剂的反应，初步筛选出对鲎试验无干扰的浓度。-本试验可减少干扰试验的盲目性2 2）试验步骤）试验步骤 供试品限值的确定供试品限值的确定 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品最大有效稀释倍数的确定 试剂的选择试剂的选择 反应溶液的制备反应溶液的制备 加样及反应加样及反应 结果判断结果判断2007-9-10Bitab41（1）供试品限值）供试品限值 -硫酸庆大霉素，100ml/瓶，20000U/ml；-药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U（2）最大有效稀释倍数的确定）最大有效稀释倍数的确定 -最大有效稀释倍数MVD
30、=cL/；-使用=0.5EU/ml灵敏度的鲎试剂时，MVD0.5=20 倍 -由此可计算出使用不同时所对应的MVD:3)干扰初筛试验举例干扰初筛试验举例20000U/ml x 0.5EU/1000U0.5EU/ml2007-9-10Bitab42 灵敏度（EU/ml）0.50.250.1250.060.03对应的MVD(倍)204080160320 -由此可计算出使用不同时所对应的MVD:（3）试剂）试剂试剂名称 厂 家规格标示效价数 量TAL 安度斯0.1ml/支 0.25EU/ml24内毒素标准品CSE 安度斯10ng/瓶 10EU/ng1BET水 安度斯50ml/瓶 0.003EU/ml
31、12007-9-10Bitab43 （4）各反应溶液的制备）各反应溶液的制备 溶液编号AD溶液内容 S20 S40 S80 S160 S320W平行管溶液编号BC溶液内容 S20 E2 S40 E2 S80 E2 S160 E2 S320 E2 E2 平行管2007-9-10Bitab44溶液溶液C的制备的制备E100 E10 E1 E0.5溶液溶液A的制备的制备S原液 S10 S20 S40 S80 S160 S3203.6ml W3.6ml W0.5ml0.4ml0.5ml W3.6ml W0.4ml1.4ml0.4ml1.4ml1.4ml1ml1.4ml1.4ml W 1ml W1.4m
32、l W1.4ml W1.4ml W溶液C:E 2 溶液A2007-9-10Bitab45溶液溶液B的制备的制备E1 E1 E1 S20 E0.5 S40 E0.5 S80 E0.5 S10 S20 S40 E1 E1 S160 E0.5 S320 E0.5S80 S160 注意事项：制备溶液C和B时，每一步的混合液需在旋涡混合器上混合至少30秒 0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml2007-9-10Bitab46 （5）加样及反应加样及反应 用移液器准确吸取0.1mlBET水将鲎试剂复溶 取0.1ml相应溶液C、B、A加入鲎试剂反
33、应管，每浓度平行2管 另外取0.1mlBET水作为阴性对照溶液D加入鲎试剂反应管2007-9-10Bitab47 （4）结果判断）结果判断 溶液编号AD溶液内容 S20 S40 S80 S160 S320W平行管溶液编号BC溶液内容 S20 E2 S40 E2 S80 E2 S160 E2 S320 E2 E2 平行管-+-+-+-2007-9-10Bitab48-当溶液当溶液A A、D D均为阴性；溶液均为阴性；溶液C C均为阳性时，试均为阳性时，试验有效。验有效。-溶液溶液B B系列中，第一个出现阳性结果的浓度即系列中，第一个出现阳性结果的浓度即初步将其判断为样品的无干扰浓度。本试验初步将
34、其判断为样品的无干扰浓度。本试验中的样品无干扰浓度为中的样品无干扰浓度为S S40402007-9-10Bitab49 5、干扰试验 -通过比较鲎试剂与内毒素在水溶液和供试品溶液中反应的差异程度，来确定供试品在该浓度下是否对BET检查有干扰。-至少对3批样品进行干扰试验。1）试验步骤：）试验步骤：-供试品限值的确定。-鲎试剂的选择 -最大有效稀释倍数的确定 -反应溶液的制备 -加样及反应 -结果判断2007-9-10Bitab50何种情况下要做干扰试验？何种情况下要做干扰试验？干扰试验是一个验证实验干扰试验是一个验证实验新品种建立新品种建立BET方法方法鲎试剂的来源改变鲎试剂的来源改变鲎试剂的
35、配方、生产工艺改变鲎试剂的配方、生产工艺改变供试品的来源改变供试品的来源改变供试品的配方、生产工艺改变供试品的配方、生产工艺改变试验环境中发生了其它任何有可能影响试验试验环境中发生了其它任何有可能影响试验结果的变化结果的变化2007-9-10Bitab51（1 1）供试品限值）供试品限值 -硫酸庆大霉素，20000U/ml；药典要求内毒素限值L=0.5EU/1000U（2 2）试剂选择）试剂选择试剂名称 厂 家规格标示效价数 量TAL 安度斯0.1ml/支 0.125EU/ml36内毒素标准品CSE 安度斯10ng/瓶 10EU/ng（CoA）1BET水 安度斯25ml/瓶 0.003EU/m
36、l12007-9-10Bitab52 -根据干扰初筛试验的结果，供试品在40倍稀释（对应鲎试剂灵敏度为0.25EU/ml）时无干扰。-一般不选择第一个出现阳性结果的供试品浓度作干扰试验。本试验我们选择灵敏度为0.125EU/ml的鲎试剂进行干扰验证试验。（3 3）最大有效稀释倍数的计算）最大有效稀释倍数的计算 MVD=cL/=80（倍）MVD-=80(倍)20000U/ml X 0.5EU/1000U0.125EU/ml2007-9-10Bitab53 （4）各反应溶液的制备）各反应溶液的制备 溶液编号溶液编号B BA A溶液内容溶液内容S S80 80 E E0.250.25 S S80 8
37、0 E E0.1250.125 S S80 80 E E0.060.06 S S80 80 E E0.030.03S S8080平平行行管管溶液编号溶液编号C CD D溶液内容溶液内容E E0.250.25 E E0.1250.125 E E0.060.06 E E0.030.03 w平平行行管管2007-9-10Bitab54 溶液溶液C的制备的制备0.25EU/ml30s30s1EU/ml30s5min1.8ml100EU/ml0.4mlCSEBET水水1.0ml10EU/ml0.4ml3.6ml0.5EU/ml1.8ml3.6ml1.8ml1.8ml0.125EU/ml30s1.8ml1
38、.8ml0.06EU/ml30s1.8ml1.8ml2007-9-10Bitab55 溶液溶液A的制备（供试品的制备（供试品的稀释）的稀释）硫酸庆大霉素注射液0.3ml20000U/ml0.6ml1.0mlBET水水3.0ml2.7ml1:101:400.6ml1:80S10S40S802007-9-10Bitab56 溶液溶液B的制备的制备E0.5 E0.25 S80 E0.25 S80 E0.125 S40 S40 E0.125 E0.0625 S80 E0.0625 S80 E0.03125S40 S40 0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml0.5ml2
39、007-9-10Bitab57 （5 5）加样及反应）加样及反应 S80 E0.25 （S80E2）0.25EU/ml （2）0.125EU/ml （）0.06EU/ml（1/2）BET水0.03EU/ml（1/4）S80 E0.125 （S80E）S80 E0.06（S80E1/2）S80 E0.03（S80E1/4）S802007-9-10Bitab58 -36支鲎试剂，先用0.1mlBET复溶，再加相应的溶液0.1ml -37 1 反应60 2分钟（6）结果判断）结果判断2007-9-10Bitab59 反应结果反应结果 溶液编号溶液编号B BA A溶液内容溶液内容S S80 80 E
40、E0.250.25 S S80 80 E E0.1250.125 S S80 80 E E0.060.06 S S80 80 E E0.030.03S S8080平平行行管管溶液编号溶液编号C CD D溶液内容溶液内容E E0.250.25 E E0.1250.125 E E0.060.06 E E0.030.03 w平平行行管管+-+-+-+-+-2007-9-10Bitab60结果计算及判断 Es=lg-1（Xs/4）=lg-1=0.125EU/ml Et=lg-1（Xt/4）=lg-1 =0.104EU/ml Es、Et分别为系列C和B的反应终点浓度的几何平均值。Xs、Xt分别为系列C和
41、B的反应终点浓度的对数值（lg）。(lg0.125)x44(lg0.06)+(lg0.125)x442007-9-10Bitab61结论：使用灵敏度=0.125EU/ml的鲎试剂对样品（S）的80倍稀释液（S80）作BET，无干扰。当溶液A和溶液D（阴性对照）的所有平行管都为阴性，且0.5 Es 2时，试验有效。当 0.5 Es Et 2.0 Es时，供试品在该浓度下对检查无干扰。本试验：0.5=0.06，2=0.25 Es=0.125，0.5 Es 2，有效 0.5 Es=0.06，2 Es=0.25 Et=0.104，0.5Es Et 2.0 Es，无干扰药典规定：2007-9-10Bit
42、ab626 6、检查法检查法 1 1）凝胶法限量试验）凝胶法限量试验 （1）反应设置：溶液编号ABCD溶液内容SS E2E2W平行管2007-9-10Bitab63（2 2）试剂选择）试剂选择试剂名称 厂 家规格标示效价数 量TAL 安度斯0.1ml/支 0.125EU/ml8内毒素标准品CSE 安度斯10ng/瓶 10EU/ng1BET水 安度斯25ml/瓶 0.003EU/ml1硫酸庆大霉素(S)-100ml/支 20000U/ml1-根据干扰试验结果，供试品在80倍稀释，使用鲎试剂灵敏度为0.125EU/ml条件下，对BET无干扰-本试验选择TAL灵敏度为0.125EU/ml,供试品稀释
43、80倍检查2007-9-10Bitab64溶液溶液C的制备的制备E100 E10 E1 E0.5 E0.25 溶液溶液A的制备的制备S原液 S10 S40 S80 溶液溶液B的制备的制备 2.7ml W3.6ml W1.6ml0.4ml1.6ml W3.6ml W0.4ml0.6ml0.3ml0.6ml1.8ml W0.6ml W溶液C溶液A0.6ml0.6ml wE0.5 S40S80E0.250.6ml0.6ml溶液B(3)(3)各反应溶液制备各反应溶液制备2007-9-10Bitab65反应项目每管加样内容管数A0.1ml TAL+0.1ml A溶液B0.1ml TAL+0.1ml B溶
44、液C0.1ml TAL+0.1ml C溶液D0.1ml TAL+0.1ml BET水（4）加样及反应）加样及反应试管封口 混合 孵育（37/602分钟）8支鲎试剂，先加0.1mlBET水复溶，再加入相应溶液（如图）2007-9-10Bitab66溶液编号内容溶液编号内容A A（S S8080）B B（S S8080E E0.250.25）C C（E E0.250.25）D DW W合格不合格需复检复检合格复检不合格试验无效试验无效试验无效(5)(5)结果判断结果判断2007-9-10Bitab67举例：注射用头孢拉定的内毒素日常检查举例：注射用头孢拉定的内毒素日常检查试剂名称厂 家剂型复溶体积
45、或装 量标示灵敏度()或效价数量（支）TAL安度斯冻干品0.5ml/支0.125EU/ml3CSE中检所冻干品1.0ml/支20EU/支1BET水安度斯5ml/支注射用头孢拉定注射用无菌粉末0.5g/支12007-9-10Bitab68参数确定参数确定:供试品的内毒素限值供试品的内毒素限值L：中国药典上规定注射用头孢拉定的内毒素限值L为0.2EU/mg。鲎试剂灵敏度的选择鲎试剂灵敏度的选择根据干扰试验的结果，可选择灵敏度为0.125EU/ml的TAL对注射用头孢拉定按最大有效稀释倍数(MVD)进行日常检查。MVDMVD计算计算:加加5ml BET5ml BET水溶解一支供试品水溶解一支供试品,
46、得浓度得浓度C=100mg/mlC=100mg/ml的供试液。的供试液。倍）(160125.02.0100CLMVD2007-9-10Bitab692）制备供试液制备供试液:供试品溶液（供试品溶液（A）的）的制备制备0.4ml100mg/ml头头孢孢拉拉定定5.0mlBET水水1:801:100.5ml3.6ml3.5ml1.0ml1.0ml1:1602007-9-10Bitab70 内毒素溶液（内毒素溶液（C）的制备的制备0.25EU/ml30s30s15min20EU/ml0.4mlCSEBET水水1.0ml2.0EU/ml0.5EU/ml1.0ml1.0ml3.0ml1.0ml3.6ml
47、E0.5E0.252007-9-10Bitab71 含含2内毒素的供试液（内毒素的供试液（B）的制备的制备1:160 （0.625mg/ml）2CSE2CSE（0.25EU/ml0.25EU/ml）E E0.50.51.0ml注射用头孢拉定稀释液1.0ml1:802007-9-10Bitab72 加样反应加样反应反应项目每管加样内容管数A0.1ml TAL+0.1ml A溶液B0.1ml TAL+0.1ml B溶液C0.1ml TAL+0.1ml C溶液D0.1ml TAL+0.1ml BET水试管封口 混合 孵育（37/602分钟）2007-9-10Bitab732.凝胶法半定量试验 应用举
48、例2007-9-10Bitab741.供试品及试剂1.1 供试品(S):葡萄糖氯化钠注射液，内毒素限值 L=0.5EU/mL1.2 TAL：=0.06EU/mL1.3 CSE1.4 检查用水（W）2007-9-10Bitab752.凝胶半定量试验溶液的制备编号内毒素浓度/加入内毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含内毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液检查用水12482222B2/供试品溶液122C2/检查用水检查用水1248210.50.252222D无/检查用水2注：A为不超过MVD并且通过干扰实验的供试品溶液，从通过干扰试验的稀释倍数 开始用检查用水稀释成1倍，2倍，4倍，8倍，最后的稀释倍数不得
49、超过MVD。B为2浓度标准内毒素的溶液A（供试品阳性对照）C为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 D为阴性对照2007-9-10Bitab763.C溶液的制备3.1 用W复溶CSE3.2 用W把CSE稀释成如下系列浓度溶液：E0.125,E0.06,E0.03,E0.015可以分步稀释：E0.125 E0.06 E0.03 E0.015也可以一步稀释：E0.1251.8ml1.8mlW1.5ml1.0ml1.5mlW1.0mlW1.0ml1.0mlWE0.060.5ml1.5mlWE0.030.4ml2.8mlWE0.015*注意：稀释CSE须按规定漩涡混合溶液。2007-9-10Bitab774.A
50、溶液的制备4.1 假设样品（S）的原液（S1）已经过干扰试验验证是无干扰；4.2 计算MVD:4.3 用W把S稀释成如下系列浓度溶液：S1，S2，S4，S88:106.05.0LMVD(S8)2007-9-10Bitab785.B溶液的制备5.1 由于S1是原液，要添加2浓度的CSE到S1，只能采用近似法；5.2 用W把CSE稀释至E1.25（最好在制备C溶液时一起制备）；5.3 1.8mlS1+0.2mlE1.25 2.0ml S1E0.1252007-9-10Bitab796.反应试管设置及加样反应A(检查管)B(PPC)C(灵敏度验证)D(NC)S1S2S4S8S1E0.125E0.12
