1、种子检验学实验种子检验学实验 种子检验学种子检验学实验四实验四 品种真实性的品种真实性的SSRSSR分子标记分析分子标记分析 一、目的要求一、目的要求(1)(1)通过实验操作或现场参观了解品种真实性通过实验操作或现场参观了解品种真实性SSRSSR分子标记分分子标记分析的基本仪器设备、引物和步骤。析的基本仪器设备、引物和步骤。(2)(2)学会识别分子标记电泳图谱或照片图谱，能识别和判断学会识别分子标记电泳图谱或照片图谱，能识别和判断品种图谱的差异。品种图谱的差异。3二、实验原理二、实验原理 简单重复序列简单重复序列(simple sequence repeats,SSR)(simple sequ
2、ence repeats,SSR)分布于小麦分布于小麦基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位数目及序列基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位数目及序列可能不同。由于每个重复序列两侧的序列是高度保守和单拷贝的，可能不同。由于每个重复序列两侧的序列是高度保守和单拷贝的，因而可以根据两侧的序列设计一对特异引物，利用因而可以根据两侧的序列设计一对特异引物，利用PCRPCR技术对重技术对重复序列进行扩增，得到的复序列进行扩增，得到的PCRPCR产物在电泳过程中的电场作用下，产物在电泳过程中的电场作用下，由于分子量大小不同得到分离，经硝酸银染色或者荧光染料标记由于分子量大小不同得到分离，经
3、硝酸银染色或者荧光染料标记检测区分开。检测区分开。4 由于不同品种的遗传组成不同，所以根据引物由于不同品种的遗传组成不同，所以根据引物DNADNA序列序列存在差异或引物结合部位之间的存在差异或引物结合部位之间的DNADNA片段大小存在差异，即片段大小存在差异，即可鉴定小麦品种。可鉴定小麦品种。5三、材料和用具三、材料和用具 （见实验过程）（见实验过程）四、方法和步骤四、方法和步骤(一一)种子或幼苗种子或幼苗DNADNA提取纯化提取纯化1.CTAB1.CTAB法法2.SDS2.SDS法法3.3.试剂盒法试剂盒法6（二）（二）PCRPCR扩增扩增反应组分原浓度 终浓度 反应体积（10L）8ddH2
4、O（L）3.0524.410Buffer（不含Mg2+）10 1 1.08MgCl2(mmol/L)25 1.25 0.54dNTPs(mmol/L)10 0.2 0.21.6Tag酶U/L 2 0.05 U 0.252引物(mol/L)1.25 0.25 2.016DNA(ng/L)50 15 3.0-PCRPCR扩增反应体系扩增反应体系PCRPCR扩增反应体系扩增反应体系7反应组分原浓度 终浓度 反应体积（15L）10ddH2O（L）4.5MIX 2 0.05 U 7.5引物(mol/L)1.25 0.25 2.0DNA(ng/L)50 15 1.0-PCRPCR扩增反应体系扩增反应体系简
5、化简化PCRPCR扩增反应体系扩增反应体系8反应程序反应程序预变性：预变性：9494 5min5min；变变 性性：949430s30s，退退 火火：50-6850-68（依据引物的退火温度改变）（依据引物的退火温度改变）45s45s，延延 伸伸：727260s60s，进行，进行3030次循环；次循环；终延伸：终延伸：7272 10min10min。扩增产物于扩增产物于4 4保存保存9（三）扩增产物分离（三）扩增产物分离-变性变性PAGEPAGE垂直板电泳垂直板电泳PCRPCR扩增反应体系扩增反应体系1.1.制胶制胶 玻璃板反复擦洗干净，再用双蒸水、玻璃板反复擦洗干净，再用双蒸水、75%75%
6、乙醇分别擦洗两遍。乙醇分别擦洗两遍。1mL 1mL亲和硅烷工作液，均匀涂在长玻璃板上；将亲和硅烷工作液，均匀涂在长玻璃板上；将1mL1mL剥离硅烷工剥离硅烷工作液，均匀涂在带凹槽的短玻璃板上。（防止相互污染）作液，均匀涂在带凹槽的短玻璃板上。（防止相互污染）玻璃板彻底干燥后，将玻璃板彻底干燥后，将0.4mm 0.4mm 厚的塑料隔条整齐放在长玻璃板厚的塑料隔条整齐放在长玻璃板两侧，盖上凹槽短玻璃板，夹子固定；两侧，盖上凹槽短玻璃板，夹子固定；10PCRPCR扩增反应体系扩增反应体系 取取80mL80mL 6%6%聚丙烯酰胺变性凝胶溶液，加入聚丙烯酰胺变性凝胶溶液，加入6060 LTEMEDLT
7、EMED、180180 L 10%L 10%过硫酸铵过硫酸铵，轻轻摇匀，将胶灌入玻璃胶室，灌胶过，轻轻摇匀，将胶灌入玻璃胶室，灌胶过程应防止气泡出现。程应防止气泡出现。待胶室灌满后，在凹槽处将鲨鱼齿梳的平齐端插入胶液约待胶室灌满后，在凹槽处将鲨鱼齿梳的平齐端插入胶液约5 5 mmmm6 mm6 mm，胶聚合时间不少于，胶聚合时间不少于1.5h1.5h。胶聚合后胶聚合后,清理胶板表面溢出的胶液清理胶板表面溢出的胶液,轻轻拔出梳子轻轻拔出梳子,用清水用清水洗干净备用。洗干净备用。11PCRPCR扩增反应体系扩增反应体系2.2.变性变性 取取1010 l l扩增产物，加入扩增产物，加入2 2 L 6
8、L 6加样缓冲液，混匀。加样缓冲液，混匀。在在PCRPCR扩增仪上运行扩增仪上运行9595变性变性5min5min，取出立即置于冰上，冷却取出立即置于冰上，冷却10min10min以上后供备用。以上后供备用。12PCRPCR扩增反应体系扩增反应体系3.3.电泳电泳 将胶板安装于电泳槽上，将胶板安装于电泳槽上，电泳正极槽（下槽）加入电泳正极槽（下槽）加入0.50.5TBETBE缓冲液缓冲液600mL600mL，负极槽（，负极槽（上槽）加入上槽）加入0.50.5TBETBE缓冲液缓冲液600mL600mL，拔出样品梳，拔出样品梳;在在1800V1800V恒压预电泳（恒压预电泳（10102020）m
9、inmin，用塑料滴管清除加样，用塑料滴管清除加样槽孔气泡和杂质，将样品梳插入胶中槽孔气泡和杂质，将样品梳插入胶中1mm-2mm1mm-2mm。每一个加样孔加入每一个加样孔加入5 5 L L变性样品，在变性样品，在1800V1800V恒压下电泳。恒压下电泳。13PCRPCR扩增反应体系扩增反应体系4.4.染色染色 将粘有凝胶的长玻璃板胶面向上浸入将粘有凝胶的长玻璃板胶面向上浸入“固定固定/染色液染色液”中，轻中，轻摇染色槽，使摇染色槽，使“固定固定/染色液染色液”均匀覆盖胶板，染色均匀覆盖胶板，染色5 min5 min10 10 minmin。将胶板移入水中漂洗将胶板移入水中漂洗30 s30
10、s60 s60 s。再移入显影液中，轻摇显影液槽，使显影液均匀覆盖胶板，再移入显影液中，轻摇显影液槽，使显影液均匀覆盖胶板，待带型清晰，待带型清晰，将胶板移入去离子水中漂洗将胶板移入去离子水中漂洗5 min5 min，晾干胶板，放在胶片观察，晾干胶板，放在胶片观察灯上观察记录结果，拍照保存。灯上观察记录结果，拍照保存。14PCRPCR扩增反应体系扩增反应体系4.4.数据分析数据分析 扩增片段大小的读取，统一采用两段式数据记录方式。扩增片段大小的读取，统一采用两段式数据记录方式。纯合位点数据记录为纯合位点数据记录为X/XX/X，小片段数据在前，大片段数据在后，小片段数据在前，大片段数据在后，缺失
11、位点数据记录为，缺失位点数据记录为0/00/0。注注：非纯合：非纯合SSRSSR位点的数据记录为位点的数据记录为X/YX/Y（其中（其中X X、Y Y 分别为该位分别为该位点两个等位基因的扩增片段大小）。点两个等位基因的扩增片段大小）。15五、作业五、作业 (1)(1)统计位点差异记录的结果统计位点差异记录的结果 (2)(2)简述简述SSRSSR分子标记测定品种真实性的原理与步骤分子标记测定品种真实性的原理与步骤 （3)3)实验后思考实验后思考16附：试剂配置附：试剂配置A1 DNAA1 DNA提取提取（1 1）0.5 mol/L EDTA0.5 mol/L EDTA溶液溶液NaNa2 2ED
12、TA.2HEDTA.2H2 2O 186.1gO 186.1g溶于溶于800mL800mL水中，加固体水中，加固体NaOHNaOH调调pHpH至至8.08.0，加水定容至，加水定容至1000mL1000mL，121121 高压灭菌高压灭菌20 min20 min。（2 2）1 mol/L Tris-HCl1 mol/L Tris-HCl溶液溶液TrisTris碱碱 60.55g60.55g溶于适量水中，加溶于适量水中，加HClHCl调调pHpH至至8.08.0，加水定，加水定容至容至500mL500mL，121121 高压灭菌高压灭菌20 min20 min。（3 3）5 mol/L NaCl
13、5 mol/L NaCl溶液溶液固体固体NaCl 146.1gNaCl 146.1g，加水定容至，加水定容至500mL500mL，121121 高压灭菌高压灭菌20 min20 min。17（4 4）CTABCTAB提取液提取液5mol/L NaCl 280 mL5mol/L NaCl 280 mL、20mL-20mL-巯基乙醇（巯基乙醇（C C2 2H H6 6OSOS）、）、CTAB 20gCTAB 20g、1mol/L Tris-HCl 100mL1mol/L Tris-HCl 100mL和和0.5mol/L EDTA 0.5mol/L EDTA 40mL40mL，加水定容至，加水定容至
14、1000mL1000mL，4 4贮存。贮存。（5 5）5 mol/L KAC5 mol/L KAC称取称取KAC 49.67gKAC 49.67g，用水溶解，冰乙酸调整，用水溶解，冰乙酸调整PHPH至至5.25.2，定容，定容至至100ml100ml，121121 高压灭菌高压灭菌20min20min。（6 6）1 1TE TE 缓冲液缓冲液1mol/L Tris-HCl 5mL1mol/L Tris-HCl 5mL和和0.5mol/L EDTA 1mL0.5mol/L EDTA 1mL，加，加HClHCl调调pHpH至至8.08.0，加水定容至，加水定容至500mL500mL，121121
15、高压灭菌高压灭菌20min20min。18A2 PCRA2 PCR扩增扩增（1 1）dNTPdNTP用超纯水分别配制用超纯水分别配制dATPdATP、dGTPdGTP、dCTPdCTP、dTTPdTTP终浓度终浓度100mmol/L100mmol/L的储存液，分别用的储存液，分别用0.05mol/L0.05mol/L的的 TrisTris碱调整碱调整PHPH值至值至7.07.0。各取。各取8080 L L混合，用超纯水混合，用超纯水480480 L L定容至终浓度定容至终浓度10mmol/L each10mmol/L each的工作液。的工作液。（2 2）SSRSSR引物引物用用1 1TETE
16、分别配制上游引物、下游引物终浓度均为分别配制上游引物、下游引物终浓度均为100100 mol/Lmol/L的储存液，从的储存液，从100100 mol/Lmol/L的储存液中吸取上下的储存液中吸取上下游引物各游引物各12.512.5 L L混合，再加入混合，再加入975975 L 1L 1TETE混匀成混匀成1.251.25 mol/Lmol/L的工作液。的工作液。19A1 A1 电泳电泳(1)(1)6 6上样缓冲液上样缓冲液去离子甲酰胺去离子甲酰胺98mL98mL、0.5mol/L EDTA 2mL0.5mol/L EDTA 2mL、溴酚兰、溴酚兰0.25g0.25g和二甲苯青和二甲苯青0.
17、25g0.25g混合摇匀，混合摇匀，4 4备用。备用。(2)(2)0.5mol/L EDTA0.5mol/L EDTA溶液溶液称取称取18.61 g18.61 g二水合乙二胺四乙酸二钠（二水合乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na22H2OEDTA-Na22H2O）溶于水中，用）溶于水中，用NaOHNaOH颗粒将颗粒将pHpH调至调至 8.08.0，加水定容至，加水定容至100 100 mLmL。在。在121 121 灭菌灭菌20 min20 min。(3)(3)1010TBETBE缓冲液缓冲液(PH=8.3)(PH=8.3)（1000 1000 毫升）：毫升）：108g 108g Tris bas
18、eTris base，55g55g硼酸硼酸 ，7.44gNa2EDTA2H2O7.44gNa2EDTA2H2O，加去离子，加去离子水溶解后定容，室温保存备用。水溶解后定容，室温保存备用。20 (4)(4)6%6%聚丙烯酰胺凝胶母液聚丙烯酰胺凝胶母液(6%(6%胶胶)（1000 1000 毫升）：毫升）：尿素尿素420g420g、1010TBETBE缓冲液缓冲液50mL50mL、丙烯酰胺（、丙烯酰胺（C3H5NOC3H5NO）57 57 g g、甲叉双丙烯酰胺（、甲叉双丙烯酰胺（(H2C=CHCONH)2CH2(H2C=CHCONH)2CH2）3g3g，加水定容，加水定容至至1000mL1000
19、mL。用大漏斗过滤，所配胶保存在棕色瓶中，置。用大漏斗过滤，所配胶保存在棕色瓶中，置于于 44冰箱或室温备用。冰箱或室温备用。21 (5)(5)1%1%亲和硅烷工作液：亲和硅烷工作液：10ul 10ul 亲和硅烷，亲和硅烷，10ul10ul冰醋冰醋酸，酸，980ul980ul无水乙醇混合摇匀。无水乙醇混合摇匀。(6)(6)2%2%剥离硅烷的配制：剥离硅烷的配制：2ml 2ml 剥离硅烷，剥离硅烷，98ml98ml三氯三氯甲烷混合摇匀。甲烷混合摇匀。（7)10%7)10%过硫酸铵溶液过硫酸铵溶液称取称取0.1 g0.1 g过硫酸铵（过硫酸铵（(NH4)2S2O8(NH4)2S2O8）溶于）溶于1
20、 mL1 mL水中。保存水中。保存于冰箱冷冻室中备用。于冰箱冷冻室中备用。（8)0.58)0.5TBETBE工作液工作液1010TBETBE缓冲液缓冲液250mL250mL，加水定容至，加水定容至5000mL5000mL。22A2 A2 银染银染（1)1)固定液固定液/染色液染色液硝酸银（硝酸银（AgNO3AgNO3）2 g2 g、7575乙醇乙醇133 mL133 mL、99%99%乙酸乙酸6 mL6 mL，加水定溶至加水定溶至1000 mL1000 mL。（2)NaOH2)NaOH显影液显影液氢氧化钠（氢氧化钠（NaOHNaOH）20 g20 g，溶于，溶于1 000 mL1 000 mL的蒸馏水中。使的蒸馏水中。使用前加入用前加入6 mL6 mL的甲醛（的甲醛（CHCH2 2O O）溶液。）溶液。
