1、第八章第八章 基因操作技术及其应用基因操作技术及其应用一、重组一、重组DNA技术技术 二二、PCR技术技术 三、基因文库及分子杂交技术三、基因文库及分子杂交技术 l克(clone)-无性繁殖l分子克DNA的无性繁殖技术l重组DNA技术的重大突破带动了现代生物技术的兴起，并很快产生了许多生命科学的高技术产业二、重组DNA技术是基因工程的核心技术一、重组一、重组DNA技术技术 重组重组DNA技术，又称为基因克或分子克技术。它是技术，又称为基因克或分子克技术。它是基因工程的核心技术。基因工程的核心技术。应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）
2、与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克或重组DNA(recombinant DNA)。DNADNA克定义克定义（1）获得目的基因；（2）与克载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。重组重组DNA操作一般步骤操作一般步骤：（1）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库，从中钓取目
3、的基因。（2）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立全长cDNA文库或EST文库；从文库直接筛选所需基因。（3）根据同源克等原理克需要的目的基因片段。（4）直接化学合成。(一一)、获得目的基因的方法：、获得目的基因的方法：(二二)、限制酶的发现和应用则是、限制酶的发现和应用则是DNA重组的关键重组的关键限制性内切核酸酶(restrictive endonucle-ases)，又称限制酶。是识别并特异性地切割双链DNA序列的一种核酸内切酶。（“分子手术刀分子手术刀”）发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶
4、。限制酶（限制酶（“基因剪刀基因剪刀”）根据其来源命名。如：根据其来源命名。如：属名属名 菌株名菌株名 E co R I 种名种名 编号编号EcoRI来源于大肠杆菌来源于大肠杆菌E.coli的的RY13菌株菌株,I指在该菌株中指在该菌株中分离的第一个限制酶。分离的第一个限制酶。命名命名每种限制酶能识别和切割的通常48个核苷酸序列，称为限制性位点（restriction sites）或切点。（回文结构）如：Hare III 5-GGCC-3 3-CCGG-5 Bam HI 5-GGATCC-3 3-CCTAGG-5 平末端(blunt end)对称轴切，连接效果差切割形式 粘性末端（sticky
5、 end）交错切切割形式切割形式 l 不论不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如重组。如人和质粒人和质粒DNA等。等。l 用于人类基因组的用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。分析，具特定的酶切位点。l Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。长度。应用于限制性片段多态性分析。根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重
6、要用途：诊断中的重要用途：载体（载体（Vector）:将外源目的将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。复制和增殖的工具。（三）、基因转运载体及其选择（三）、基因转运载体及其选择常用载体：常用载体：质粒、噬菌体、粘粒、大片段克载体（BAC，YAC等）。克载体克载体(cloning vector)(cloning vector)为使插入的外源为使插入的外源DNADNA序列被扩增而特意设计的载体序列被扩增而特意设计的载体称为克载体。称为克载体。表达载体表达载体(expression vector)(expression vector)为使插入的外源为使插入的外
7、源DNADNA序列可转录翻译成多肽链而特序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。意设计的载体称为表达载体。1、能自主复制；且插入外源DNA后，不影响其复制能力；2、具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；3、有克位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克位点；4、分子量小，以容纳较大的外源DNA；5、具生物安全性。载体的选择标准载体的选择标准1.1.质粒质粒 (plasmid)(plasmid)2.-2.-噬菌体噬菌体(phage)置换载体 溶解途径 载体和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克23kb的外源DNA。插入载体 裂解途径 DNA在宿主细胞中复制
8、，然后包装成噬菌体，裂解宿主，释放噬菌体。可克5kb的cDNA。是一种可在体外包装的细菌病毒,可高效感染大肠杆菌。-噬菌体DNA是线状双链DNA分子，全长约50kb，每条链各带12bp长的单链互补末端-粘末端(COS序列)。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对环化。可包装3752kb DNA分子。改建后的噬菌体发展了多种较大型的克载体，如：3.3.柯斯质粒柯斯质粒(cosmid vector)：粘粒粘粒 是将质粒和噬菌体改建的一种载体.它含COS序列,插入一小plasmid 而得名Cosmid。改建后的粘粒含有噬菌体的复制起点和cos末端，全长8kb。可感染大肠杆菌。大片段外源DNA插入后，
9、在体外包装进而被克。可包装3050 kb长的DNA片段，多用于基因文库构建。4.4.其他载体：大片段其他载体：大片段DNADNA克载体克载体 细菌人工染色体细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome,BAC)(bacterial artificial chromosome,BAC)约约300kb300kb噬菌体噬菌体PIPI人工染色体人工染色体（PI artificial chromosome,PACPI artificial chromosome,PAC）约约100kb 100kb 酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chr
10、omosome,YAC)(yeast artificial chromosome,YAC)200kb 2000kb 200kb 2000kb动物病毒动物病毒DNADNA改造的载体改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）（四）、外源（四）、外源DNA片断和载体的连接片断和载体的连接1.1.粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接 (2)(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接配伍末端连接配伍末端连接非配伍末端连接非配伍末端连接Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连
11、接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG目的基因用目的基因用 Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG载体载体DNA用用Bam H切割切割GCCTAGGCCTAGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGATCCGGATCCG重组体重组体GCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCGGCCTAGGCCTAGGATCCGGATCCG载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接GAATTCCTTAAGAGA
12、TCTTCTAGAEco R切割位点切割位点GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTABg l切割位点切割位点AATTCGATCTAGAATTCGGATCTAAATTCGATCTAGEcoR+Bg l双酶切双酶切Eco R+Bg l双酶切双酶切GCTTAAATCTAGAATTCGGATCTAT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的连配伍末端的连接情况和同一限制接情况和同一限制酶切位点连接相似。酶切位点连接相似。2.2.平端连接平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因目的基因载体载体限
13、制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连3.3.同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)(terminal transferase)的作的作用下，在用下，在DNADNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。性末端，再进行粘端连接。5 3 3 5 载体载体DNA5 3 3 5 目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 5 3 3 5 5 3 T(T)nT T(T)nT 3 5 5 3
14、 3 5 5 3 A(A)nA A(A)nA3 5-核酸外切酶核酸外切酶-核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+dATP末端转移酶末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体4.4.人工接头人工接头(linker)(linker)连接连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。末端，而进行粘端连接。人工接头及其应用人工接头及其应用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco REco REco REco R受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全
15、宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent)(competent)导入方式导入方式转化转化 (transformation)(transformation)转染转染 (transfectiontransfection)感染感染 (infection)(infection)（五）重组（五）重组DNADNA导入受体菌导入受体菌感受态细胞：感受态细胞：受体细胞经处理后处于最适摄取和容忍重组体的状态。转染（转染（infectioninfection）：是特殊形式的转化，是离体状态的）：是特殊形式的转化，是离体状态的完整的病毒噬菌体完整的病毒噬菌体DNA/RNA
16、DNA/RNA感染受体菌而引起的后者遗传感染受体菌而引起的后者遗传型和表型发生的变化。型和表型发生的变化。转导（转导（transduction）：当病毒从被感染的（供体）细）：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。转移及基因重组即为转导作用。转化（转化（transformation）通过自动获取或人为地供给外）通过自动获取或人为地供给外源源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化
17、作用。称为转化作用。（五）重组体的筛选（五）重组体的筛选(1)(1)抗药性标记选择抗药性标记选择(2)(2)标志补救标志补救(marker rescue)(marker rescue)(3)(3)分子杂交法分子杂交法 原位杂交原位杂交 Southern blotSouthern blot四四环环素素标标记记筛筛选选抗抗药药标标记记蓝蓝白白斑斑筛筛选选标志补救标志补救重组重组DNADNA技术操作过程总结：技术操作过程总结：分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 三、三、PCR技术：
18、聚合酶链式反应技术：聚合酶链式反应（polymerase chain eaction,PCR）1993，Kary B.MullisPCR是模拟体内是模拟体内DNA复制条复制条件，应用件，应用DNA聚合酶反应，特聚合酶反应，特异性扩增某一异性扩增某一DNA片段的技术。片段的技术。体外程序化的体外程序化的DNA合成技术。合成技术。1)原理：原理：模拟体内模拟体内DNA复制条件，应用复制条件，应用DNA聚合酶反应，特聚合酶反应，特异性扩增某一异性扩增某一DNA片段。片段。2)反应体系：反应体系：DNA模板，引物，模板，引物，dNTP，Taq DNA聚合酶，聚合酶，buffer3)反应程序：反应程序：
19、变性变性 (9495oC)退火退火 延伸延伸 (3755 oC)(7072 oC)72 oC延伸延伸10min 30-35cycles DNA扩增扩增100万倍万倍PCR特点及应用特点及应用优点：（优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速；（2）微量的模板）微量的模板DNA即可扩增大量产物。即可扩增大量产物。应用：（应用：（1）基因组）基因组DNA分析；分析；（2）遗传物质的鉴定；）遗传物质的鉴定；（3）遗传病的诊断。）遗传病的诊断。缺点：（缺点：（1）需靶）需靶DNA序列的信息；序列的信息；（2）产物短小，）产物短小，DNA复制不精确。复制不精确。
20、四、基因文库与分子杂交技术四、基因文库与分子杂交技术（一）、（一）、基因文库基因文库基因组文库基因组文库cDNA文库文库（一）、（一）、基因文库基因文库Southern blot（二）、（二）、分子杂交技术分子杂交技术Northern blotWestern blot基因组基因组DNADNA文库（文库（genomic DNA librarygenomic DNA library）将某一基因组将某一基因组DNADNA用适当的限制酶切断后，与载用适当的限制酶切断后，与载（质粒或噬菌体）体（质粒或噬菌体）体DNADNA重组，再全部转化宿主细胞，重组，再全部转化宿主细胞，存在于转化细胞内由克载体所携带
21、的所有基因组存在于转化细胞内由克载体所携带的所有基因组DNADNA的集合称为的集合称为G G文库文库（一）、（一）、基因文库基因文库组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNA基因片断基因片断克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌基基因因组组文文库库构构建建流流程程图图限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包
22、装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库cDNAcDNA文库文库(cDNA library)(cDNA library)以某种细胞的全部以某种细胞的全部mRNAmRNA为模板，利用逆转录酶合为模板，利用逆转录酶合成与成与mRNAmRNA互补的互补的DNADNA（cDNAcDNA）再复制成双链）再复制成双链cDNA,cDNA,与适与适当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因当的载体连接后转化入受体菌，得到含全部表达基因的种群，称为的种群，称为C-C-文库文库(cDNA l
23、ibrary)(cDNA library)。C-C-文库具有组织细胞特异性文库具有组织细胞特异性。组织或细胞组织或细胞RNA提取提取反转录反转录cDNA(double strand)克隆载体克隆载体重组重组DNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌受体菌受体菌cDNA文库文库构建流程图构建流程图cDNA library construction（二）、（二）、分子杂交技术分子杂交技术 分子杂交（分子杂交（molecular hybridization）：标记的探针标记的探针DNA变性后与变性后的靶变性后与变性后的靶DNA/RNA通过碱基互补配对结合，通过碱基互补配对结合，形成杂种分子的
24、过程。形成杂种分子的过程。分子杂交包括：分子杂交包括：DNA-DNA杂交（杂交（Southern blot）;DNA-RNA杂交（杂交（Northern blot）;蛋白蛋白-蛋白杂交（蛋白杂交（Western blot）。）。1、基因探针（、基因探针（gene probe）基因探针（基因探针（probeprobe）：是指与一段目的基因或）：是指与一段目的基因或DNA/RNADNA/RNA片片段特异杂交的核苷酸序列。可以是整个基因，或是基因段特异杂交的核苷酸序列。可以是整个基因，或是基因的一部分，是的一部分，是DNADNA，也可以是，也可以是RNARNA。1）、探针标记）、探针标记 同位素：同
25、位素：32P,35S,3H-dNTP等；等；非同位素：地高辛非同位素：地高辛-dNTP，生物素，生物素-dNTP。2）探针制备方法）探针制备方法缺口平移法（缺口平移法（Nick translation）随机引物法（随机引物法（Random primer）末端标记法（末端标记法（Random primer）Nick TranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTP Bio-dNTP随机引物标记探针53553DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bp primerKlenow,dNTP变性变性-复姓复姓DNA末端标记2、Southern blot
26、原原理理和和步步骤骤提取提取T、Cell DNA 限制酶消化限制酶消化 DNA片段片段电泳分离电泳分离变性转移至尼龙膜变性转移至尼龙膜变性、杂交变性、杂交洗膜、放射自显影、结果分析洗膜、放射自显影、结果分析Southern blotSouthern blot2、Northern blot原原理理和和步步骤骤提取提取T、Cell 总总RNA 提纯分离提纯分离mRNA凝胶电泳分离凝胶电泳分离RNA变性转移至尼龙膜变性转移至尼龙膜杂交杂交洗膜、放射自显影、结果分析洗膜、放射自显影、结果分析3、Western blot原原理理和和步步骤骤提取提取T、Cell 蛋白蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白变性转移至尼龙膜变性转移至尼龙膜抗体杂交抗体杂交Western blot
