1、检验学院 何 涛教学目的要求：掌握免疫荧光显微镜技术 掌握时间分辨荧光免疫技术 了解荧光免疫测定的临床应用1、概述、概述荧光免疫技术是将抗原抗体荧光免疫技术是将抗原抗体反应的特异性与荧光技术的敏感反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法，是免疫性结合起来的一种方法，是免疫标记技术中发展最早的一种检测标记技术中发展最早的一种检测方法。方法。近年来，随着科学技术的发展，一系列新的近年来，随着科学技术的发展，一系列新的仪器和技术问世，使荧光技术不断完善，已仪器和技术问世，使荧光技术不断完善，已从原来仅限于检测固定标本，如检测组织切从原来仅限于检测固定标本，如检测组织切片或细胞表面的抗原，扩大
2、到进行活细胞分片或细胞表面的抗原，扩大到进行活细胞分类检测及多种成分定量检测。荧光技术已被类检测及多种成分定量检测。荧光技术已被广泛应用于临床检测和科学研究。广泛应用于临床检测和科学研究。2、技术分类：荧光抗体技术(荧光显微镜技术)抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判 定结果的检测方法。免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法第一节荧光免疫技术的特点第一节荧光免疫技术的特点 荧光物质在吸收激发光的能量后，使原来处于基态的电子跃迁到激发态，当其回复至基态时，激发态的电子以发射光的形式释放出能量，这种发射光称为荧光（fluorescence）。一、荧光的基
3、本知识（一）发射光谱（一）发射光谱 指固定激发波长，在不同波长下所记录到的样品发射荧光的相对强度。（二）（二）激发光谱激发光谱 指固定检测发射波长，用不同波长的激发光激发样品所记录到的相应的荧光发射强度。（三）荧光的效率：荧光物质分子将光能转变（三）荧光的效率：荧光物质分子将光能转变成荧光的百分率成荧光的百分率荧光效率荧光效率发射荧光的光量子数（荧光强度）发射荧光的光量子数（荧光强度）吸收光的光量子数（激发光强度）吸收光的光量子数（激发光强度）（四）荧光寿命（四）荧光寿命 荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。（五）荧光的淬灭（五）荧光的淬灭 荧光物
4、质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退成为荧光淬灭。例如紫外线照射、高温、苯胺、硝基苯、酚、I-等。（六）荧光偏振（六）荧光偏振二、荧光物质二、荧光物质第二节 荧光抗体的制备一、抗体要求二、荧光素要求三、荧光素标记抗体的方法四、荧光素标记抗体的纯化五、荧光抗体的鉴定六、荧光抗体的保存第三节免疫荧光显微技术第三节免疫荧光显微技术 免疫荧光显微技术的免疫荧光显微技术的基本原理基本原理是：荧光抗是：荧光抗体可与标本切片中组织或细胞表面的抗原体可与标本切片中组织或细胞表面的抗原结合，洗涤除去未结合的荧光抗体后，于结合，洗涤除去未结合的荧光抗体后，于荧光显微镜下观察，在黑暗背景上可见明荧光显微镜下
5、观察，在黑暗背景上可见明亮的特异荧光，即可对标本中的抗原物质亮的特异荧光，即可对标本中的抗原物质进行鉴定。进行鉴定。一、标本的制作一、标本的制作荧光显微技术主要是靠观察切片标本上荧荧光显微技术主要是靠观察切片标本上荧光抗体的染色结果来对抗原进行鉴定和定光抗体的染色结果来对抗原进行鉴定和定位。因此，标本制作的好坏直接影响到检位。因此，标本制作的好坏直接影响到检测结果。测结果。常见的临床标本有：组织、细胞和细菌三大常见的临床标本有：组织、细胞和细菌三大类，可分别制成切片、印片和涂片。类，可分别制成切片、印片和涂片。组织切片：组织切片：冷冻切片、石蜡切片（最常用）冷冻切片、石蜡切片（最常用）印片：印
6、片：肝、脾、淋巴结等器官或组织肝、脾、淋巴结等器官或组织 涂片：涂片：各种体液、穿刺液、细菌培养物和各种体液、穿刺液、细菌培养物和细胞悬液细胞悬液 培养细胞：培养细胞：单层培养细胞（人喉癌上皮细单层培养细胞（人喉癌上皮细胞胞HEP-2)标本的固定和保存：标本的固定和保存：固定剂：固定剂：乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等乙醇、甲醇、丙酮、甲醛等保存：保存：4、-20 二、荧光抗体染色与结果判断二、荧光抗体染色与结果判断于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光于已固定的标本上滴加经适当稀释的荧光抗体抗体 置置25-37 30min或或4 过夜过夜 用用PBS充分洗涤充分洗涤 镜检。镜检。试验类型试验类型 1
7、直接法 2 间接法 3 双标记法 两种荧光素分别标记的两种不同的特异性抗体，与同一标本反应，荧光显微镜观察两种颜色。返回荧光抗体染色结果判断荧光抗体染色结果判断 设立实验对照设立实验对照:阳性对照和阴性对照阳性对照和阴性对照 区分特异和非特异染色区分特异和非特异染色 阳性细胞显色分布阳性细胞显色分布:胞质型、胞核型和膜表胞质型、胞核型和膜表面型面型抗核抗体抗核抗体(均质型均质型)抗核抗体抗核抗体(斑点型斑点型)抗核抗体抗核抗体(核膜型核膜型)“-”：无或仅见极微弱荧光。无或仅见极微弱荧光。“+”：荧光较弱但清楚可见。荧光较弱但清楚可见。“+”：荧光明亮。荧光明亮。“+”：耀眼强荧光。耀眼强荧光
8、。特异荧光强度特异荧光强度“+”以上判定为阳性，对照以上判定为阳性，对照光应呈光应呈“-”或或“”。根据呈根据呈+的血清最高稀释度判定特异性抗的血清最高稀释度判定特异性抗体效价。体效价。三、荧光显微镜检查三、荧光显微镜检查 利用一定波长的激发利用一定波长的激发光对样品进行激发，产光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对生一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察定性、定位、定量观察检测。检测。经荧光抗体染色的标本，经荧光抗体染色的标本，需要在荧光微镜下观察。需要在荧光微镜下观察。一般要求染色后立刻镜一般要求染色后立刻镜检，以防荧光消褪，造检，以防荧光消褪，造
9、成假阴性结果。成假阴性结果。荧光显微镜的基本结构荧光显微镜的基本结构 光源：光源：高压汞灯、氙灯或卤素灯高压汞灯、氙灯或卤素灯 滤光片滤光片：隔热、激发和吸收滤光片隔热、激发和吸收滤光片 光路光路：透射光、落射光透射光、落射光 聚光器：聚光器：明视野、暗视野和相差荧光聚光明视野、暗视野和相差荧光聚光器器 镜头：镜头：消色差镜头消色差镜头 隔热滤光片：隔热滤光片：阻断红外线通过而隔热。阻断红外线通过而隔热。激发滤光片：激发滤光片：位于光源和物镜之间，能选位于光源和物镜之间，能选择性地透过紫外线可见波长择性地透过紫外线可见波长 的光域，提供的光域，提供合适的激发光。合适的激发光。吸收滤光片：吸收滤
10、光片：位于物镜和目镜之间，阻断位于物镜和目镜之间，阻断激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。激发光而使发射的荧光透过，保护眼睛。返回透射荧光显微镜光路透射荧光显微镜光路(a)落射荧光显微镜光路落射荧光显微镜光路(b)透射光：透射光：照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。照明光线从标本下经聚光器透过标本进入物镜。落射光：落射光：照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经照明光线从标本上经垂直照明器落射到标本，经标本反射进入物镜。标本反射进入物镜。基本原理：基本原理：将抗原抗体反应与荧光将抗原抗体反应与荧光物质发光分析相结合，用荧光检测物质发光分析相结合，用荧光检测仪检测抗原抗体复合物中特异性荧
11、仪检测抗原抗体复合物中特异性荧光强度，对液体标本中微量或超微光强度，对液体标本中微量或超微量物质进行定量测定。量物质进行定量测定。第四节第四节 荧光免疫分析荧光免疫分析荧光免疫测定的方法类型荧光免疫测定的方法类型 非均相荧光免疫测定：非均相荧光免疫测定：时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定、荧光酶免疫测、荧光酶免疫测定定 均相荧光免疫测定：均相荧光免疫测定：荧光偏振免疫测定荧光偏振免疫测定 时间分辨荧光免疫测定时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA)基本原理：基本原理：是用镧系稀土元素螯合物（如是用镧系稀土元素螯合物（如Eu3+）标记抗体或抗原，检测标本中的抗）标记抗体或抗原，检测标本中的抗原
12、或抗体。此螯合物具有较长荧光寿命，原或抗体。此螯合物具有较长荧光寿命，得用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，得用时间分辨荧光分析仪延缓测量时间，可排除标本中非特异性荧光的干扰，所得可排除标本中非特异性荧光的干扰，所得信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧信号完全是稀土元素螯合物发射的特异荧光。光。时间分辨检测原理示意图时间分辨检测原理示意图 自发荧光寿命自发荧光寿命短短:1ns10ns 镧系元素寿命镧系元素寿命长长:10s1000s 短寿命荧光完全衰变短寿命荧光完全衰变后再测定镧系后再测定镧系 元素特异荧光元素特异荧光时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示意图时间分辨荧光免疫测定（双抗体夹心法）示
13、意图方法评价和临床应用方法评价和临床应用 灵敏度高灵敏度高：最小检出量最小检出量10-18mol/L 标记物稳定：有效使用期长标记物稳定：有效使用期长 测量快速，易自动化测量快速，易自动化 易受污染，本底增高易受污染，本底增高 因此因此,是很有发展前途的超微量物质免疫分是很有发展前途的超微量物质免疫分析技术。析技术。第五节第五节 荧光免疫技术的应用荧光免疫技术的应用荧光抗体技术在临床上可用作肿瘤细荧光抗体技术在临床上可用作肿瘤细胞的诊断；细菌、病毒和寄生虫的检验及胞的诊断；细菌、病毒和寄生虫的检验及自身免疫病的协助诊断等方面。自身免疫病的协助诊断等方面。一、荧光显微镜技术的应用二、荧光免疫测定
14、的应用思考题思考题1 1荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭的概念是荧光、荧光效率、荧光寿命和荧光淬灭的概念是什么？什么？2 2常用的荧光物质有哪些？常用的荧光物质有哪些？3 3荧光免疫技术有哪些类型？荧光免疫技术有哪些类型？4 4荧光抗体技术的基本原理是什么？荧光抗体技术的基本原理是什么？3 3什么是荧光抗体？如何制备、纯化和鉴定荧光抗什么是荧光抗体？如何制备、纯化和鉴定荧光抗体？体？4 4荧光抗体染色有哪些方法？各自的反应原理是什荧光抗体染色有哪些方法？各自的反应原理是什么？么？5 5荧光免疫测定的基本原理是什么？有哪些方法类荧光免疫测定的基本原理是什么？有哪些方法类型型?课堂练习1、用于标
15、记荧光抗体的荧光素应符合下列要求，除外A 与蛋白质分子形成离子键B 荧光效率高，与蛋白结合后仍能保持较高的荧光效率C 荧光色泽与背景组织色泽对比鲜明D 与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化和免疫学性质E 标记方法简单，安全无毒（A）2、荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是 A 光源 B 滤板 C 聚光器 D 目镜 E 物镜（D）3、不能作为荧光显微镜光源的是 A 高压汞灯 B 氚灯 C 紫外灯 D 氙灯 E 卤素灯（C）4、荧光抗体染色技术中，特异性最高，非特异性染色最低的方法是 A 直接法 B 间接法 C 补体结合法 D 双标记法 E 以上都不对(A)5、目前公认的最有效的检测抗核抗
16、体的方法是 A ELISA B 放射免疫技术 C 直接凝集实验 D 直接荧光法 E 间接荧光法(E)6、FITC在紫外光的激发下，所产生的荧光为 A 灰蓝色 B 黄绿色 C 橙色 D 暗红色 E 橙红色（B）7、双标记荧光抗体技术的主要用途是 A 提高荧光强度 B 提高荧光效率 C 可同时检测同一标本中两种抗原 D 使用一种标记物可检测多种抗原 E 减少非特异性荧光（C）8、时间分辨荧光免疫测定特点中不包括 A 标记物荧光衰变时间长 B 测定范围狭窄 C 标记物为镧系元素 D 能排除非特异性荧光的干扰 E 荧光强，灵敏度高（B）9、下列有关时间分辨荧光免疫测定的叙述中，错误的是 A 以镧系螯合物作为标记物 B 镧系螯合物具有超短荧光寿命的特点 C 可以有效的消除非特异性自然本底荧光的干扰 D 增强液的主要成分是B-二酮苯 E 灵敏度较普通荧光抗体技术高（B）10、时间分辨荧光免疫测定所用的荧光标记物为 A FITC B RB200 C TRITC D 镧系元素螯合物 E 4-甲基伞型酮（D）NoImage
