聚合酶链式反应技术及应用课件.pptx

1、2022-10-9xxx1聚合酶链式反应技术及应用聚合酶链式反应技术及应用 检验医学院生命科学学院检验医学院生命科学学院2022-10-9xxx2聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCRpolymerase chain reaction,PCR）技术是生命科学界的重大发明，是生物技术领域中最重要的四项生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。PCRPCR的最大特点，是能将微量的的最大特点，是能将微量的DNADNA大幅增加。大幅增加。通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高

2、核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。2022-10-9xxx31.PCR发展简史发展简史PCR的发明人，一般公认是凯的发明人，一般公认是凯利利穆利斯（穆利斯（K.Mullis,在在Cetus公司工作期间，发明了公司工作期间，发明了PCR。1983年4月穆利斯萌发了PCR的构想;1985 关于PCR 的文章首次由Cetus公司Saiki等人在 Science 上 发 表;1987 当年7月Cetus 公司在美国获得PCR基本技术专利批准,并于当年11月推出了第一 个PCR试剂产品及第一台热循环仪；1989 Science 报道了耐热性DNA多聚酶 Ta

3、q 酶的 发现,预示着分子时代的到来；1990 Cetus科学家 D.Gelfand和S.Stoffel发明了纯 化Taq DNA 多聚酶的方法；1991 TaqMan 技 术 发 表；九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开；1998年 实时荧光PCR技术开始在中国较广泛的应用于临床检测。2022-10-9xxx4引物引物引物引物2022-10-9xxx5 2022-10-9xxx6PCR的应用 研究基因克隆，DNA测序，分析突变 诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断 人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱 法医犯罪现场标本分析 肿瘤各种肿瘤检测 其他2022-10-9xxx7PCR

4、技术的基本原理是技术的基本原理是DNA的半保留复制的半保留复制，在模板，在模板DNA、引物和四种、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于存在的条件下，依赖于DNA聚合聚合酶的酶促反应。酶的酶促反应。在体内，DNA复制是周期性的，所以基因扩增的数量有限；PCR技术在体外利用人工合成的引物，再加上DNA聚合酶和一些合适的底物和因子，通过对温度的控制，使DNA不断位于变性、复性和合成的循环中，达到扩增DNA的目的。2.PCR 2.PCR基本原理基本原理2022-10-9xxx8模板模板DNA94变性变性55退火退火72引物延伸引物延伸第二次循环第二次循环模板变性退火模板变性退火延伸延伸图图6-1 P

5、CR6-1 PCR原理示意图原理示意图2022-10-9xxx91234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍2022-10-9xxx10扩增产物扩增产物循环次数循环次数指数扩增期指数扩增期扩增平台期扩增平台期2022-10-9xxx11PCR的特点灵敏度高灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个 PFU(空斑形成单位)细菌检测的

6、最小检出率为3个细菌简便、快速简便、快速一次性加好反应液，24 小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA2022-10-9xxx12 反应体系：（五要素）模板（模板（template）引物引物(primer)人工合成的两段寡核苷酸序列，决定RCP的特异性。3.PCR反应体系和反应条件反应体系和反应条件 DNA RNA：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒RNA基因组DNA质粒DNA2022-10-9xxx13PCR反应成功扩增的一个关键条件在于寡核苷酸引物的正确设计。引物设计的目的是在两个目标间取得

7、平衡：扩增特扩增特异性和扩增效率异性和扩增效率。特异性是指发生错误引发的频率，特异性不好或劣等的引物会产生额外无关和不想要的PCR扩增子；引发效率是指在每一PCR循环中一对引物扩增的产物与理论上成倍增长量的接近程度。2022-10-9xxx14引物的长度引物的长度 典型的引物为18-24个核苷酸，在一定范围内引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性；引物长度的上限主要与反应效率有关，所以一般又不能太长，因为过长会导致其延伸温度大于72，即Taq酶的最适温度。引物设计基本原则引物设计基本原则2022-10-9xxx15PCR产物长度产物长度 一般来说，PCR产物长度

8、对扩增效率有影响。扩增片段长度在普通PCR以200500bp为宜；实时荧光PCR则为50150bp。2022-10-9xxx16引物的均衡性和引物的均衡性和GCGC含量含量 引物中碱基组成应尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶碱基堆积现象。有效引物中(G+C)的比例为40-60%，过高(非特异性扩增)或过低（特异性降低）都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。2022-10-9xxx17引物溶解温度（引物溶解温度（TmTm值）值）引物的Tm值一般控制在55-60度度,尽可能保证上下游引物的上下游引物的Tm值一致值一致,一般不一般不超过超过2度度.如果引物中的G+C含量相对偏低,则可以

9、使引物长度稍长,而保证一定的退火温度.Tm=2(A+T)+4(C+G)2022-10-9xxx18引物自身引物自身 引物间3端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败;引物3端的几个碱基与模板DNA需严格配对，并最好为低稳定性结构。5端序列对PCR影响不如3端大，常用来引进修饰位点或标记物。2022-10-9xxx19-DNA 聚合酶聚合酶(DNA polymerase)PCR发明初期，不耐热的发明初期，不耐热的Klenow片段片段耐热的耐热的Taq DNA聚合酶聚合酶良好的热稳定性良好的热稳定性：92.5、95、97.5时，半衰期分别为时，半衰期分别为130、40、56 min；良好

10、的延伸效率良好的延伸效率：在：在7580 时延伸效率最高，每个时延伸效率最高，每个酶蛋白分子的延伸速度可达酶蛋白分子的延伸速度可达150个核苷酸个核苷酸/s；无无35外切酶活性，缺乏校正功能外切酶活性，缺乏校正功能；2022-10-9xxx20-dNTP:包括包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP-PCR buffer:一般组成：50mM KCl,10-50mM,Tris-Cl(室温PH8.3)，1.5mM MgCl2 KCl：促进引物退火，高浓度KCl抑制Taq DNA聚合酶活性；Tris-Cl：调节pH值，使反应体系偏碱性；MgCl2：调节Taq DNA聚合酶活性、影响引物退火，PCR

11、产物的特异性等2022-10-9xxx212022-10-9xxx22水生栖热菌2022-10-9xxx232022-10-9xxx24 2022-10-9xxx252）循环参数(1)变性 使双链DNA解链为单链 94,30s1min。(2)退火 温度由引物长度和GC含量决定，一般比引物Tm值约低5。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性，但特异性低热启动：在第一轮扩增前必须使模版DNA完全变性，一般94，变性5分钟2022-10-9xxx262022-10-9xxx274.PCR4.PCR扩增产物的检测方法扩增产物的检测方法 凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺

12、凝胶电泳法 PCR-限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）核酸探针杂交法 PCR产物测序 荧光PCR2022-10-9xxx28(一一)琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法 基本原理：DNA在电泳缓冲液中带负电荷，将PCR产物点样于负极端的加样孔，在电场力的作用下DNA涌向正极，并且由于电荷效应和分子筛效应，不同DNA分子量及构型的DNA涌动率不同；在电泳过程中，凝胶中的EB将嵌入DNA分子中，在紫外线照射下，EB-DNA复合物发出橙红色荧光，荧光强度与DNA含量成正比；不同浓度的凝胶分辨DNA的有效范围不同。操作简单，但存在操作简单，但存在EBEB

13、污染。污染。2022-10-9xxx29聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途聚丙烯酰胺凝胶电泳特点及用途 特点：分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，而且避免EB易退色的弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。2022-10-9xxx30(二二)PCR-)PCR-限制性片段长度多态性分析法限制性片段长度多态性分析法（polymerase chain reaction based on restriction frag

14、ment length polymorphism，PCR-RFLP）不同的限制性核酸内切酶可识别特异DNA序列，所以用特定的限制性核酸内切酶对目的DNA分子进行消化，得到的酶切片段其大小和数量可以在一定程度上反应出目的DNA分子的序列信息用途：传染病病原体基因分型用途：传染病病原体基因分型 人类基因的变异性研究。人类基因的变异性研究。是诊断遗传病和传染病病原体基因分型的常用方法是诊断遗传病和传染病病原体基因分型的常用方法2022-10-9xxx31PCR-RFLP法：限制性内切酶恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因突变限制性内切酶2022-10-9xxx32(三三

15、)单链构型多态性分析法（单链构型多态性分析法（PCR-Single Strand PCR-Single Strand Conformation PolymorphismConformation Polymorphism，简称，简称PCR-SSCPPCR-SSCP）本法就是将PCR 产物双链DNA（dsDNA）变性为单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于由于DNA DNA 分子在凝胶中的电泳迁移率分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与ssDNAssDNA序列有关。序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带位

16、置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。2022-10-9xxx33PCR-SSCPPCR-SSCP过程过程 -primer -32P-dNTP掺入掺入 PCR扩增扩增 产物产物 变性变性 单链单链DNA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影自显影 1.为正常 结果分析结果分析 2、4、5纯合患者 3.为杂合子 .解链构像DAN原 理过 程2022-10-9xxx34优点及作用：优点及作用：方法简便、快速、灵敏，不需要特殊的仪器，适合临床实验的需要。该方法和其他方法相比有较高的检测率。首先，它可以发现靶DNA片段中未知位置的碱基突变。经实验证明小于经实验证明

17、小于300bp的的DNA片段中的单碱基突变，片段中的单碱基突变，90%可可被被SSCP发现发现，另外，SSCP方法可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将不同迁移率的突变单链DNA分离，并且还可以进一步提纯。用这种方法可以最终从DNA序列水平上鉴别突变DNA片段。不足之处不足之处：只能作为一种突变检测方法，要最后确定突变的要最后确定突变的位置和类型，还需进一步测序位置和类型，还需进一步测序；电泳条件要求较严格；另外，由于SSCP是依据点突变引起单链DNA分子立体构象的改变来实现电泳分离的，这样就可能会出现当某些位置的点突变对单链DNA分子立体构象的改变不起作用或作用很小时，再加上其他条件的影响，使聚丙烯酰胺

18、凝胶电泳无法分辨造成漏检。2022-10-9xxx35(四四)核酸探针杂交法核酸探针杂交法(1)点杂交（dot blot）(2)反向点杂交（reverse dot blot）(3)微孔板夹心杂交（microplate hybridization）(4)荧光探针杂交(5)Southern印迹杂交（Southern blot）2022-10-9xxx36样品样品正对照正对照 负对照负对照标准分子量标准分子量5.PCR常见问题及分析常见问题及分析2022-10-9xxx37(1)(1)假阳性假阳性PCR产物是最主要的污染源。阳性对照的污染。标本之间的交叉污染。在采集标本时，其他污染源带来的污染。使用

19、带有污染的试剂。预防措施：预防措施：2022-10-9xxx38(2)(2)假阴性假阴性假阴性是PCR反应中另一个易出现的问题。造成的原因也比较多。可以归纳以下几方面原因。1)1)标本处理的原因。标本处理的原因。处理标本时，靶DNA丢失。处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）。2022-10-9xxx39 2)PCR2)PCR试剂问题。试剂问题。引物设计不合理。Taq DNA聚合酶失活。Mg2+浓度过低或是没有加。3)PCR3)PCR扩增过程中的问题扩增过程中的问题 PCR扩增仪故障。PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。4

20、)PCR4)PCR产物鉴定中的问题产物鉴定中的问题 电泳时没有加溴化乙锭。电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。凝胶浓度过低，使扩增带跑散。2022-10-9xxx40(3)(3)引物二聚体引物二聚体形成引物二聚体的原因有：两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3端有互补区。引物比例太高，可增加模板用量。退火温度过低。热循环次数过多。2022-10-9xxx41(4)(4)非特异性非特异性PCRPCR产物产物造成非特异性PCR产物的常见原因及其预防措施：引物特异性不高或用量太大，应更换引物或降低用量；TaqDNA聚合酶质量不好或用量太大，应更换酶或降低酶使用量；Mg2+浓度过高，可

21、适当调整其浓度；退火温度过低，可提高退火温度；延伸时间过长，可减少延伸时间；热循环次数过多，应适当增加模板量，减少循环次数。2022-10-9xxx426.PCR6.PCR技术的发展技术的发展 巢式PCR（nested PCR）逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）多重PCR(multiplex PCR)重组PCR(recombinant PCR)锚定PCR（anchored PCR,A-PCR）不对称PCR（asymmetric PCR）反向PCR（inverse PCR）扩增长片段PCR（long PCR，long-distance PCR）免疫P

22、CR(immuno-PCR)原位PCR(in situ PCR)差示PCR（DD-PCR）定量PCR 2022-10-9xxx43图6-3 巢式PCR原理示意图外引物1外引物2内引物1内引物2第一次 PCR第二次 PCR（一）巢式（一）巢式PCR PCR（nested PCR nested PCR）2022-10-9xxx44提高反应提高反应的特异性的特异性2022-10-9xxx45RNA 模板模板逆转录酶逆转录酶DNA-RNA 杂化双链杂化双链RNA酶酶单链单链c cDNA聚合酶聚合酶双链双链c cDNA（二）逆转录（二）逆转录PCRPCR（reverse transcription-PC

23、Rreverse transcription-PCR，RT-PCRRT-PCR）2022-10-9xxx46one-step RT-PCRone-step RT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、Taq DNA聚合酶、PCR引物、dNTP和缓冲液，直接以mRNA 为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法RT-PCR。TthTthDNADNA聚合酶具有逆转录功能和聚合酶具有逆转录功能和DNADNA聚合功能聚合功能。常用的逆转录酶有AMVAMV逆转录酶逆转录酶（最适温度为42）和MoMLVMoMLV逆转录酶逆转录酶（最适温度为37），常用的逆转录引物有三种：随机引物；Oligo（dT）

24、，只适合于3端带有poly(A)尾的mRNA；特异性引物，只适合于逆转录目的RNA序列。以逆转录产物cDNA为模板，再做PCR。2022-10-9xxx47经济2022-10-9xxx48（三）多重（三）多重PCRPCR（multiplex PCRmultiplex PCR）PCR一般由一对引物扩增产生一个核酸片段，以此手段诊断疾病的效率低。为提高效率，常采用多重PCR技术。该技术是在一个反应体系中加入多对引物，同时扩增出多个核酸片段，由于每对引物扩增的片段长度不同，可用电泳加以鉴别。多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或病原微生物、遗传病及癌基因的分型鉴定。2022-10-9xxx49

25、用于检测特定基因序列的存在或缺失。2022-10-9xxx50乳头瘤病毒（）检验及分型乳头瘤病毒（）检验及分型 宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，发病率在女性中仅次于乳腺癌。我国每年有宫颈癌新发病例.万，占世界宫颈癌新发病例总数的.。临床科学研究表明，持续感染是导致宫颈癌的直接原因。可分为高危型和低危型两种，不同的亚型在致癌性方面存在很大的差别。至今发现的至今发现的病毒约有种，至少有种高危型会病毒约有种，至少有种高危型会构成子宫颈癌。构成子宫颈癌。所以提早诊断感染，对尤其是高危型进行检验和分型极为重要。2022-10-9xxx51（四）重组（四）重组PCRPCR（recombinant PCRr

26、ecombinant PCR）将两个不相邻的DNA片段重组在一起的PCR称为重组PCR。该技术主要应用于DNA片段的任何位置引入点突变、插入、缺失以及两个不相邻片段引入点突变、插入、缺失以及两个不相邻片段的连接的连接。其基本原理是将突变碱基、插入或缺失片段、或一种物质的几个基因片段的部分碱基设计在引物中，先分段对模板扩增，除去多余的引物后，将产物混合，再用一对引物对其进行PCR扩增。所得到的产物是一重组合的DNA。2022-10-9xxx52引物a引物c引物b引物d53 PCR混合，变性和复性延伸异源部分双链DNA形成5555533333333333555555PCR引物a引物d 再次 PCR

27、5533（四）重组（四）重组PCRPCR（recombinant PCRrecombinant PCR）2022-10-9xxx53（五）锚定（五）锚定PCR（anchored PCR，APCR）用于扩增已知一端序列的目的用于扩增已知一端序列的目的DNA 例如，例如，T细胞受体和细胞受体和免疫球蛋白基因免疫球蛋白基因5端端具有高度可变性。具有高度可变性。2022-10-9xxx54（六）不对称（六）不对称PCRPCR（asymmetric PCRasymmetric PCR）其基本原理是：采用两条不同浓度的引物，即非限制引物（高浓度引物高浓度引物）与限制性引物（低低浓度引物浓度引物），二者之比

28、为二者之比为5050100:1100:1。在PCR最初10-15个循环中，扩增产物主要是双链DNA（dsDNA）；第15个循环以后，限制性引物已被耗尽，非限制性引物介导的PCR就会产生大量的产生大量的单链单链DNADNA（ssDNAssDNA）。）。尽管此时单链DNA仅以线性速率递增，但其浓度已能满足双脱氧链终止法测定DNA序列的要求。2022-10-9xxx55已知序列已知序列PCR用途用途：未知序列的研究未知序列的研究限制酶切点（X）限制酶切点（X）限制酶X酶切连接未知序列（七）反向（七）反向PCRPCR（inverse PCRinverse PCR）2022-10-9xxx56（八）定量

29、八）定量PCR（Quantitive Polymerase Chain Reaction，QPCR）以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR过程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。定量定量PCR定量的理论依据：定量的理论依据：理想的扩增结 果：Y=X2n 其中Y代表扩增产物量，X代表PCR反应体中的原始模板数 n为扩增次数；理 论上PCR扩增效率为 100%，PCR产物随着循环的进行成指数增长，但实际上：DNA的每一 次复制都不完全，即每一次扩增中，模板不是呈 2 的倍增长；实际应为：Y=X(1+E)n，其

30、 中E 代表扩增效率：E=参与复制的模板/总模板，通常E1，E在整个PCR扩增过程中不是 固定不变的。通常X 在 1105 拷贝、循环次数n30 时，E 相对稳定，原始模板以相对固 定的指数形式增加，适合定量分析，这也就是所谓的指数期；2022-10-9xxx571PCR定量DNA 一个或两个拷贝的特定靶序列的细胞株即是标准的一个理想来源，也可使用含特定靶序列的质粒DNA作为对照，将待检样品与一系列稀释的标准对照一起扩增，检测PCR产物，即可推知靶序列的含量。2PCR定量mRNA (1)mRNA相对定量靶基因的扩增产物量与内源性对照的扩增产物量的比值 (2)竞争性PCR定量mRNA (3)cR

31、NA标准曲线法定量mRNA2022-10-9xxx58实时荧光定量实时荧光定量PCR（RT-FQ-PCR）与普通与普通PCR的区别的区别 在在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光，利用荧光信号累积信号累积实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后通过标进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法准曲线对未知模板进行定量分析的方法 对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析；进行定量和定性分析；无无法对起始模板准确定量，法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测普通PCR实时荧光定量PCR利用利用荧光信号

32、的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增每一个循环扩增产物量的变化产物量的变化，通过，通过Ct值值和标准和标准曲线的分析对曲线的分析对起始模板起始模板进行进行定量定量分析分析对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析；进行定量和定性分析；无无法对起始模板准确定量，法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增每一个循环扩增产物量的变化产物量的变化，通过，通过Ct值值和标准和标准曲线的分析对曲线的分析对起始模板起始模板进行

33、进行定量定量分析分析对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析；进行定量和定性分析；无无法对起始模板准确定量，法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测实时荧光定量PCR利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增每一个循环扩增产物量的变化产物量的变化，通过，通过Ct值值和标准和标准曲线的分析对曲线的分析对起始模板起始模板进行进行定量定量分析分析对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析；进行定量和定性分析；无无法对起始模板准确定量，法对起始模板准确定量，无法对扩增反

34、应实时检测无法对扩增反应实时检测普通PCR实时荧光定量PCR利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中扩增反应中每一个循环扩增每一个循环扩增产物量的变化产物量的变化，通过，通过Ct值值和标准和标准曲线的分析对曲线的分析对起始模板起始模板进行进行定量定量分析分析对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析；进行定量和定性分析；无无法对起始模板准确定量，法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测与普通与普通PCR的区别的区别普通PCR实时荧光定量PCR利用利用荧光信号的变化实时检测荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中扩增

35、反应中每一个循环扩增每一个循环扩增产物量的变化产物量的变化，通过，通过Ct值值和标准和标准曲线的分析对曲线的分析对起始模板起始模板进行进行定量定量分析分析对对PCRPCR扩增反应的扩增反应的终点产物终点产物进行定量和定性分析；进行定量和定性分析；无无法对起始模板准确定量，法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测无法对扩增反应实时检测2022-10-9xxx59如何对初始模板定量如何对初始模板定量?荧光信号如何产生？荧光信号如何产生？Real time PCR 实时监测系统实时监测系统2022-10-9xxx60实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR原理定量原理原理定量原理介绍三个概念：介绍三

36、个概念：扩增曲线、荧光阈值、扩增曲线、荧光阈值、CtCt值值如何对起始模板定量？如何对起始模板定量？通过通过Ct值和标准曲线对值和标准曲线对起始模板起始模板进行定量分进行定量分析析2022-10-9xxx61实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -扩增曲线扩增曲线扩增曲线图：扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光基团荧光检测元件荧光检测元件2022-10-9xxx62实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -荧光阈值荧光阈值荧光信号阈值荧光信号阈值 （threshold threshold）：q 前15个

37、循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值q 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍q 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99q 真正的信号:荧光信号超过域值2022-10-9xxx63实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值CtCt值的定义值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数C(t)value 2022-10-9xxx64实时荧光定量实时荧光定量PCR PCR 原理原理 -Ct值的

38、重现性横轴：横轴：PCR反映循环数反映循环数纵轴：荧光信号量纵轴：荧光信号量CtCt值的特点值的特点：相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；Ct值则极具重现性2022-10-9xxx65荧光定量PCR原理 理想的PCR反应：X=X0*2n 非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率XCt=X0(1+Ex)Ct=Nlog X0=-log(1+Ex)*Ct+log NXCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数最后结论：Log X0与Ct呈线性关系，根据样品扩增的Ct值就可计算出样品

39、中所含的模板量2022-10-9xxx66 标准曲线（使用外参照物的定量PCR）将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real time PCR，就会按照起始DNA浓度由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。再由Ct值与起始模版的对数值之间存在的线性关系，就可制作标准标准曲线。曲线。未知浓度的样品与标品一样，也可得到Ct值，并将Ct值代入标准曲线，就可以求出未知浓度样品的起始模版量。2022-10-9xxx67荧光信号如何产生？荧光信号如何产生？非特异性荧光标记：1、SYBR Green 特异性荧光标记：2、TaqMan3、Molecular Beacon2022-10-9xxx68 SYBR Gre

40、en I SYBR Green I SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光（SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位）变性时，DNA双链分开，无荧光 在延伸结束阶段采集荧光信号。SYBR Green 也能和非特异的双链DNA结合发光，所以必须在反应结束时做熔解曲线分析2022-10-9xxx69SYBR-Green I5353SGExcitationSGSGSGSGEmission双链荧光染料2022-10-9xxx70SYBR-Green I5353SGSGSGSGSGExcitationEmission2022-10-9xxx71Cycle 1Cycle 3Cyc

41、le 2Molecular Probe公司公司的一个专利的一个专利产品，产品，US Patent5,436,134 1993年年7月月12日申请日申请2022-10-9xxx72 荧光强度的变化是由于温度不断升高双链DNA解离，SGI游离 Tm是熔解曲线的特征值：当双链DNA解链一半时，荧光信号强度急剧下降，此时的温度为溶解温度。Tm值与PCR产物序列有关，对某一PCR扩增产物其值是固定的。溶解曲线的一次曲线溶解曲线的一次曲线溶解曲线的负一次微分曲线溶解曲线的负一次微分曲线2022-10-9xxx73融解曲线的作用采用采用SYBR Green ISYBR Green I荧光嵌合法检测时，可以通

42、荧光嵌合法检测时，可以通过溶解曲线分析，确认过溶解曲线分析，确认PCRPCR反应的特异性反应的特异性特异性产物特异性产物非特异产物非特异产物引物二聚体引物二聚体2022-10-9xxx74 优点优点 对DNA模板没有选择性，适用于任何DNA 使用方便，不必设计复杂探针 灵敏度较高 便宜 缺点缺点 易与非特异性双链结合，产生假阳性 但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高2022-10-9xxx75TaqManTaqMan技术技术探针探针探针探针水解型杂交探针水解型杂交探针53与目标序列互补与目标序列互补5端标记有报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等3端标记有

43、荧光淬灭基团(Quencher,Q)探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有53外切核酸酶活性，可水解探针2022-10-9xxx76TaqMan探针工作原理探针工作原理Taq酶：酶：5外切酶活性外切酶活性每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号2022-10-9xxx77q鉴定鉴定PCR产物产物(定性）定性）q定量起始模板浓度定量起始模板浓度q单核苷酸单核苷酸多态性（多态性（SNP）检测）检测2022-10-9xxx78 优点优点 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定 引物设计相对简单 重复性比较好 缺点缺点 只适合一个特定的目标 价格较高2022-10-

44、9xxx79molecular beacon 技术技术检测靶基因的部分检测靶基因的部分随着每次扩增产物的增加，其荧光强度也增加，因而它可以反映每次扩增末期扩增随着每次扩增产物的增加，其荧光强度也增加，因而它可以反映每次扩增末期扩增产物积累的量。产物积累的量。分子信标分子信标2022-10-9xxx80 荧光定量荧光定量PCR的临床应用的临床应用遗传疾病的早期诊断肿瘤的诊断抗病毒药物疗效的观察、指导病情评估和预后判断新药验证输血源的筛选母婴传播的控制与观察2022-10-9xxx81 PCR技术的最大优点是具有极高的敏感性极高的敏感性，其反应过程与以往其他任何一种检验诊断技术相比，都易受到各种自

45、身和外部因素的影响。所以，制定一套适应当前基因诊断实验的基所以，制定一套适应当前基因诊断实验的基本要求并使本要求并使PCRPCR技术标准化的操作程序已迫在技术标准化的操作程序已迫在眉睫。眉睫。聚合酶链反应方法的标准化2022-10-9xxx82一.PCR实验诊断的基本原则二.PCR操作程序标准化 （一）上岗人员培训制度 （二）标准化PCR诊断实验室 （三）PCR标准化操作程序 1试剂配制、分装及保存 2标本的采集与处理 3基因扩增及其实验条件的选择 4扩增产物检测 5PCR结果的判读 （四）污染的预防及污染源的标准化处理2022-10-9xxx83阈值高度：是基线范围内荧光信号强度标准偏差的阈值高度：是基线范围内荧光信号强度标准偏差的1010倍。倍。