1、免疫分析技术之ELISA王娟免疫学检测技术免疫学检测技术细胞水平细胞水平分子水平分子水平基因水平基因水平体外（或体内）测定体外（或体内）测定各类细胞及其亚群的各类细胞及其亚群的数量和效应，从而了数量和效应，从而了解机体的细胞免疫水解机体的细胞免疫水平平测定各类免疫球蛋白、测定各类免疫球蛋白、补体、细胞因子及其补体、细胞因子及其受体、黏附分子的表受体、黏附分子的表达水平和生物活性，达水平和生物活性，从而了解机体免疫因从而了解机体免疫因子间的相互关系子间的相互关系测定免疫应答相关基测定免疫应答相关基因的表达与调控、免因的表达与调控、免疫分子的遗传多态性疫分子的遗传多态性及基因型别分析及基因型别分析
2、1.1.21.1.2特异性特异性 抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。1.1.31.1.3敏感性敏感性化学比色法的敏感度为化学比色法的敏感度为mg/mlmg/ml水平水平酶反应测定法的敏感度约为酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的
3、免疫敏感度可提高数千倍，达标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/mlng/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可达，其敏感度可达0.1ng/ml0.1ng/ml。1.21.2免疫测定在临床检验中的应用免疫测定在临床检验中的应用由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广。2ELISA的类型的类型ELISA可用于测定抗原，也可用
4、于测定抗体。在这种测定方可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂：法中有三个必要的试剂：（1）固相的抗原或抗体，即）固相的抗原或抗体，即免疫吸附剂免疫吸附剂（immunosorbent）；（2）酶标记的抗原或抗体，称为）酶标记的抗原或抗体，称为结合物结合物（conjugate）；（3）酶反应的底物。）酶反应的底物。可设计出各种不同类型的检测方法。可设计出各种不同类型的检测方法。2.1双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原A.将抗体吸附于固相表面；将抗体吸附于固相表面；B.加抗原，形成抗原加抗原，形成抗原-抗体复合物；抗体复合物；C.加酶标抗体；加酶标抗体；D.加底物。底
5、物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。此法适用于检测各种蛋白质等大分子抗原，例如此法适用于检测各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。2.2 双抗原夹心法测抗体双抗原夹心法测抗体 用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗。乙肝
6、标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。方法。2.3 间接法测抗体间接法测抗体 传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法抗体建立检测相应抗体的方法。A.将抗原吸附于固相载体表面；将抗原吸附于固相载体表面；B.加抗体加抗体,形成抗原形成抗原-抗体复合物抗体复合物;C.加酶标抗体；加酶标抗体；D.加底物。加底物。测定底物的降解量抗体量测定底物
7、的降解量抗体量2.4 2.4 竞争法测抗体竞争法测抗体 当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。抗原时，可用此法检测特异性抗体。2.5 2.5 竞争法测抗原竞争法测抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点小分子抗原或半抗原缺乏可作夹心法的两个以上的位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固式。其原理是标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合
8、在固相上的酶相抗体结合。标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等标抗原愈少，最后的显色也愈浅。小分子激素、药物等ELISAELISA测定多用此法。测定多用此法。2.6 2.6 捕获包被法测抗体捕获包被法测抗体IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固抗体包被固相，以捕获血清标本中的相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异（其中包括针对抗原的特异性性IgM抗体和非特异性的抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。的早期诊断。2.7 ABS-ELISA2.7
9、 ABS-ELISA法法：固相支持物；：固相支持物；：样品；：样品；：特异性：特异性IgGIgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG（BiotinBiotin）；）；：辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶HRP-HRP-酶标链亲和素（酶标链亲和素（AvidinAvidin）；）；：DABDAB显色液；显色液；：显色；：显色；3.ELISA的试剂的试剂(A、B、C三部分三部分)ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原
10、或抗体（结合物）；）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；）洗涤液；（7）酶反应终止液）酶反应终止液ELISA的试剂准备的试剂准备A 固相载体固相载体 聚苯乙烯，具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原聚苯乙烯，具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯，聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空聚氯乙烯，聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但
11、空白值也略高。白值也略高。良好的良好的ELISA板应该是板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近。，各板之间、同一板各孔之间性能相近。3.1.2 包被的方式包被的方式 将抗原或抗体固定的过程称为包被将抗原或抗体固定的过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等的作用。这种物理吸附
12、是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。不易吸附的非蛋白质抗原不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。较多的抗原也可采用捕获包被法。亲和素生物素亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的即用亲和素先包被载体，加入生物素化的
13、DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。测定。脂类物质脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的
14、多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。3.1.3 3.1.3 包被用抗原包被用抗原3.1.4 3.1.4 包被用抗体包被用抗体IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结段上，抗体结合点暴露于外。合点暴露于外。取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液，须除去杂抗体后才取材于抗血清或含单克隆抗体
15、的培养液，须除去杂抗体后才能用于能用于ELISA，以保证试验的特异性。，以保证试验的特异性。腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果。，可取得更好的效果。3.1.5 3.1.5 包被的条件包被的条件 pH 9.6碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液 pH 7.2的磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲液 pH 7-8的的Tris-HCL缓冲液缓冲液 加入包被液后，在加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，冰箱中放置过夜，37中保温中保温2
16、小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般般蛋白质的包被浓度为蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。3.1.6 封闭封闭封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂：常用封闭剂
17、：0.05%-0.5%的的BSA;10%的小牛血清或的小牛血清或1%明胶明胶；脱脂奶粉，比较价廉，可以高浓度使用（；脱脂奶粉，比较价廉，可以高浓度使用（5%）。）。所有的所有的ELISA固相均需封闭？固相均需封闭？ELISA的试剂准备的试剂准备B 3.2 3.2 结合物结合物 即酶标记的抗体（或抗原）是即酶标记的抗体（或抗原）是ELISAELISA中关键的试剂中关键的试剂 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2 抗体（或抗原）的免疫活性抗体（或抗原）的免疫活性 3 3 含有或少含有游离的抗体（或抗原）含有或少含有游离的抗体（或抗原）4 4 结合物尚要有良好的稳定性结合物尚要有良好的稳定性3.
18、2.1 结合物用的抗原和抗体结合物用的抗原和抗体 制备结合物时所用纯度较高的制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。求是抗原必须是高纯度的。3.2.2酶酶纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源纯度高，催化反应的转化率高，
19、专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。价格低廉，有色产物易于测定等。在在ELISA中，中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶半乳糖苷酶和脲酶等。和脲酶等。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶HRP是一种糖蛋白，含糖量约为是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子，分子量为量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而
20、成，是一种卟啉蛋白质。铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。酸盐氧化法。（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-70%）和）和重复性好。重复性好。交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗交联反应是随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。体与抗体之间也有可能交联，影响效果。（2）过碘酸氧
21、化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成成chiff氏碱而结合。简便有效氏碱而结合。简便有效.3.2.3 3.2.3 结合物的制备结合物的制备 结合物中混有的游离酶一般不影响结合物中混有的游离酶一般不影响ELISAELISA中最后的酶活性中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的
22、酶和抗体后用于检测，效果更好。检测，效果更好。制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。达到最合适的测定条件和测定费用的节省。酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如等体积的甘油，加入蛋白保护
23、剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，结合物加硫柳泵，AP结合物可结合物可加叠氮钠）。加叠氮钠）。3.2.4 结合物的保存结合物的保存 用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%0.1%牛血清白蛋白，牛血清白蛋白，0.05%0.05%吐温吐温20 20。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在使用时不需再行稀释，在4-84-8保存期可达保存期可达6 6个月。个月。3.2
24、.5 结合物的稀释结合物的稀释试剂准备试剂准备 C 酶的底物酶的底物3.3 3.3 酶的底物酶的底物3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRPHRP结合物最常结合物最常用的底物。用的底物。DH2+H2O2 D+2H2O 上式中，上式中，DH2为供氧体，为供氧体，H2O2为受氢体。为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻
25、苯二胺如：邻苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS。TMBTMB经经HRPHRP作用后共产物显蓝色。作用后共产物显蓝色。TMBTMB性质较稳定，可配成性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与溶液试剂，只需与H H2 2O O2 2溶液混和即成应用液。酶反应终止溶液混和即成应用液。酶反应终止后，后，TMBTMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为收波长为450nm450nm。ABTSABTS虽不如虽不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值极低，也为一些试敏感，但空白值极低，也为一些试剂
26、盒所采用。剂盒所采用。HRPHRP对氢受体的专一性很高，仅作用于对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2H2O2、小分醇的过、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。APAP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm405nm波长处有吸波长处有吸收峰。用收峰。用NaOHNaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。终止酶反应后，黄色可稳定一时间。APAP也有发荧光底物（磷酸也有发荧光底物（磷酸4-4-甲基伞酮），可用
27、于甲基伞酮），可用于ELISAELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。4 4 对照设定对照设定 阳性对照品阳性对照品(positive control)(positive control)和阴性对照品和阴性对照品(negative(negative control)control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。蛋白保护剂的缓冲液
28、为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。质的量。参考标准品参考标准品定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中。阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如H
29、BsAgHBsAg检测检测的阴性对照品中不可含的阴性对照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是阴性。也是阴性。5 5 标本的采取和保存标本的采取和保存 体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。抗原成份。以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以
30、酶活性的物质，以HRPHRP为标记的为标记的ELISAELISA测定中，可能会增加非测定中，可能会增加非特异性显色。特异性显色。加样加样在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在底物。加样时应将所加物加在LEISALEISA板孔的底部，避免加在孔板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。基本操作注意事项基本操作注意事项保温保温抗原抗体完成反应的保温过程称为温育抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)(incubation
31、)。ELISAELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么生。为什么ELISAELISA反应总是需要一定时间的温育？反应总是需要一定时间的温育？温育常采用的温度有温育常采用的温度有4343、3737、室温和、室温和44（冰箱温度）等（冰箱温度）等。3737是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。的合适温度。洗涤洗涤洗涤在洗涤在ELISAELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。的成败。ELSIAE
32、LSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在可以说在ELISAELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式除某些洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手
33、工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：操作有流水冲洗式和浸泡式两种：（1 1）流水冲洗式）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。（2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合
34、是疏水性的，非离中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。溶液状态，从而脱离固相载体。显色显色显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。温度有助于加速显色进行
35、。TMBTMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。阅读结果。TMBTMB经经HRPHRP作用后，约作用后，约4040分钟显色达顶峰，随即逐分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至渐减弱，至2 2小时后即可完全消退至无色。小时后即可完全消退至无色。比色比色拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的以蒸馏水校零点，测读底物
36、孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。行计算。结果以光密度（结果以光密度（oplical densityoplical density，ODOD），现按规定用吸光），现按规定用吸光度（度（absorbenceabsorbence，A A），两者含义相同。通常的表示方法是），两者含义相同。通
37、常的表示方法是，将吸收波长写于，将吸收波长写于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸收波长为的吸收波长为492nm492nm，表示方法为，表示方法为AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。酶标比色仪酶标比色仪酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISAELISA光度计。针对固相光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。
38、优良的酶标仪的读数复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到一般可精确到0.0010.001，准确性为，准确性为1%1%，重复性达，重复性达0.5%0.5%。操作时室温宜在操作时室温宜在15-3015-30，使用前先预热仪器，使用前先预热仪器15-3015-30分钟，测分钟，测读结果更稳定。测读读结果更稳定。测读A A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPDOPD用用492nm492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。波长。有的酶标仪可用双波长式测读。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说
39、明书。6 6 结果判断结果判断 6.1 6.1 定性测定定性测定定性测定的结果判断作出定性测定的结果判断作出“有有”或或“无无”的回答，分别用的回答，分别用“阳性阳性”、“阴性阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。在间接法和夹心法在间接法和夹心法E
40、LSIAELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法法ELISAELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。判断方法不同，分述于下。A.A.阳性判定值：阳性判定值：（cut-off valuecut-off value）一般为阴性对照一般为阴性对照A A值加上值加上一个特定的常数一个特定的常数(0.05)(0.05)，以此作为判断结果阳性或阴性的标，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。准。B.B.标本标本/阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒阴性对照比值：在实验条件（包括试
41、剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（S S）和阴性）和阴性对照（对照（N N）的）的A A值后，计算值后，计算S/NS/N值值。间接法和夹心法间接法和夹心法（2 2）竞争法）竞争法因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出般均用比色计测定，读出S S、P P和和N N的吸光值。的吸光值。a.a.阳性判定值法阳性判定值法 阴性判定值阴性判定值=0.4=0.4NCX+0.6NCX+0.6PCXPCX 阳性阳性 A A阳性判定值阳性判定值 阴性阴性 A A阳性
42、判定值阳性判定值 b.b.抑制率法抑制率法 抑制率（抑制率（%）=（阴性对照（阴性对照A A值值-标本标本A A值）值）100%/100%/阴性阴性对照对照 阳性阳性 抑制率抑制率50%50%为为 阴性阴性 50%50%4.7.2 4.7.2 定量测定定量测定ELSIAELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。作标准曲
43、线。测定大分子量物质的夹心法测定大分子量物质的夹心法ELISAELISA，标准曲线的范围一般较，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S S形，其头、尾部形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。4.ELISA4.ELISA的操作要点的操作要点严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证证ELISAELISA必要条件。必要条件。严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。免疫分
44、析技术之免疫分析技术之液相芯片技术及应用液相芯片技术及应用liquichip 液相芯片系统_ 液相芯片系统有机地整和了有色微球（color-coded microsphere or bead）、激光技术、流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，造就了Luminex 100无与伦比的检测特异性和灵敏度。BenefitsApplicationsFutureTechnologyPrincipleMost bioassays consist of two or more biomolecules interactingPrincipleUsing LiquiChip-Technology t
45、hese biological interactions take place on small,microscopical beadsthese beads are fluorescent(red)PrincipleDetection and Quantitation of these biological interactions is made by fluorescent detection reagentsBeads球形基质球形基质Capture molecule探针分子探针分子Analyte待检测物待检测物Reporter molecule报告分子报告分子Assays on Uni
46、form Polystyrene(聚苯乙烯)BeadsDiameter 5.6 mTwo internal Dyes for Bead ClassificationDefined Mixture Dying in Shrinking in of both Dyes Organic Solvent Aqueous SolventTwo-Color Bead-Coding Based on xMAP technology By using 10 different levels of each of two fluorescent dyes,an array of 100 beads,each w
47、ith a unique color signature,is created 为了便于探针分子的固定，在球形基质的表面进行了一系列的修饰，可适合各种蛋白，肽，核酸等生物分子的固定“Liquid Array”Technology Different bead codes(colors)are used to allow the identification of multiple reactions in a single well“Liquid Array”Technology Different bead codes(colors)are used to allow the identif
48、ication of multiple reactions in a single well“Liquid Array”Technology Different bead codes(colors)are used to allow the identification of multiple reactions in a single well反应主要包括3个步骤 探针分子的固定 将这种标记好探针的球形基质与样品反应。探针可以与相应的目的分子特异性的结合，带有绿色报告荧光的报告分子与目的分子特异性的结合，对反应进行定量 反应结果的检测LiquiChip WorkstationuFlow cy
49、tometer-based technologyuMeasures fluorescenceuComponents:lReaderlMicroplate HandlerlFluid ModuleFlow Cytometer based Analysis Beads are aligned in a single file stream by hydrodynamic focusing Two lasers are used for excitation of fluorescencePrinciple of DetectionnThe red laser is used to identify
50、 the bead codenThe green laser is used to identify the reporter signal 利用这100种球形基质，可以标记上100种不同的探针分子，同时对一个样本中的100种不同的目的分子进行检测。AFHEBGCDBenefits系统的优点 灵活性好，可适用于各种蛋白质分析，可以接受实验室已有的实验方案，使用者可以自行设计分析方案，也可使用成套试剂盒 通量大，可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行分析；在35-60分钟内可对96个不同样本进行检测 液相环境更有利于保持蛋白质的天然构象，也更有利于探针和被检测物的反应 灵敏度高，信噪比好，只需
