1、Approaches and Techniques in Research on TumorA course for Ph.D.candidates肿瘤的实验动物和细胞研究技术肿瘤的实验动物和细胞研究技术The animal model and in vitro research of tumor常用研究方式：常用研究方式：In Vitro:体外研究，细胞、组织培养下进行In Vivo:体内研究，人类疾病的动物模型Ex Vivo:细胞经体外实验处理后，再回输到体内 体外处理：转染基因或改变环境(用一些因子)使其分化等 体外研究(In Vitro)原代培养肿瘤细胞原代培养肿瘤细胞:从肿瘤组织中分
2、离得到的细胞在体外成功地进行从肿瘤组织中分离得到的细胞在体外成功地进行 培养称为原代培养培养称为原代培养(primary culture)肿瘤细胞系肿瘤细胞系:原代培养肿瘤细胞能连续传代（约原代培养肿瘤细胞能连续传代（约710天传代一次）天传代一次）半年以上半年以上,生长稳定生长稳定,并能保持肿瘤细胞的特性，并能保持肿瘤细胞的特性，称为肿瘤细胞系称为肿瘤细胞系(cell line)肿瘤细胞株肿瘤细胞株:细胞系经细胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性细胞系经细胞克隆或其它方法获得具有某种生物学特性 的纯谱系的细胞称为肿瘤细胞株的纯谱系的细胞称为肿瘤细胞株(cell strain),细胞具有细胞
3、具有 相同的基因型和表型相同的基因型和表型(单克隆单克隆)肿瘤细胞株的建立：肿瘤细胞株的建立：1、直接从人的肿瘤或动物的自发及诱发肿瘤组织分离培养直接从人的肿瘤或动物的自发及诱发肿瘤组织分离培养 建系和建株建系和建株;(从自发或诱发瘤从自发或诱发瘤)2、从人或动物的移植肿瘤、从人或动物的移植肿瘤(如人肿瘤裸鼠移植瘤如人肿瘤裸鼠移植瘤)组织分离组织分离 培养建系及建株培养建系及建株;(从移植瘤从移植瘤)3、用化学或生物、用化学或生物(病毒病毒)方法在体外转化正常的人或动物的方法在体外转化正常的人或动物的 细胞株而获得肿瘤细胞株。细胞株而获得肿瘤细胞株。(体外转化体外转化)肿瘤细胞株的鉴定肿瘤细胞
4、株的鉴定：1.有关的原始资料有关的原始资料,包括供瘤病人的包括供瘤病人的姓名姓名、年龄年龄、性别性别、病历号病历号、临床诊断（临床诊断（TNM）、活检病理诊断活检病理诊断,手术切除日期手术切除日期、最后病理诊断最后病理诊断等等 2.形态学观察形态学观察:普通倒置相差光镜普通倒置相差光镜:活细胞的形态活细胞的形态,细胞间桥细胞间桥,分泌颗粒分泌颗粒,重叠生长重叠生长,Giemsa染色或染色或H.E.染色的光镜染色的光镜 形态与肿瘤细胞的生长条件有一定关系形态与肿瘤细胞的生长条件有一定关系:HeLa:高浓度血清高浓度血清长梭形长梭形;低浓度血清低浓度血清圆形细胞圆形细胞,排列如鹅卵石路面排列如鹅卵
5、石路面;透射和扫描电镜透射和扫描电镜 3D组织结构组织结构 3.核型及染色体观察核型及染色体观察:整倍体整倍体,异倍体异倍体,染色体畸变染色体畸变、标记染色体标记染色体,染色体分带分析染色体分带分析,相隔一定时间重复观察数次相隔一定时间重复观察数次 4.生长特性生长特性:分裂指数分裂指数（3H-thymidine或或5-BrdU的的labeling index）、）、生长曲线生长曲线、细胞群体倍增时间细胞群体倍增时间、集落形成或贴壁率（集落形成或贴壁率（plating efficiency）半固体培养介质中的集落形成率半固体培养介质中的集落形成率 5.组织特性的鉴定组织特性的鉴定:免疫细胞化学
6、方法免疫细胞化学方法 上皮性肿瘤标志上皮性肿瘤标志:CK、上皮膜抗原（、上皮膜抗原（EMA）、）、癌胚抗原（癌胚抗原（CEA）;淋巴瘤抗原标志淋巴瘤抗原标志:人白细胞分化抗原簇（人白细胞分化抗原簇（CD）,有有274个以上个以上,T淋巴细胞淋巴细胞:UCHL-1(CD45RO),B淋巴细胞淋巴细胞:L26（CD20）,软组织肿瘤标志：软组织肿瘤标志：波形蛋白（波形蛋白（Vm）肌源性：肌源性：结蛋白（结蛋白（Dm）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白）、肌动蛋白、肌凝蛋白、肌红蛋白 神经源性：神经源性：神经微丝（神经微丝（NF）、）、S-100蛋白、蛋白、Leu-7、神经元特异性烯醇化酶（神经元特异性
7、烯醇化酶（NSE）、髓磷脂碱性蛋白）、髓磷脂碱性蛋白(MBP)组织细胞源性：组织细胞源性：-1抗胰蛋白酶、抗胰蛋白酶、-1抗糜蛋白酶、抗糜蛋白酶、CD68 血管源性：血管源性：八因子相关抗原、八因子相关抗原、CD34、荆豆凝集素、荆豆凝集素(UL)基膜源性：基膜源性：纤连蛋白（纤连蛋白（FN）和层粘连蛋白（）和层粘连蛋白（LN）体外培养时肿瘤细胞株有可能会失去原本表达的某些组织抗原体外培养时肿瘤细胞株有可能会失去原本表达的某些组织抗原,抗原标志要抗原标志要多选用几种抗体多选用几种抗体,以减少假阴性结果以减少假阴性结果;6.其他特性：其他特性：(a)分泌激素和异位激素分泌激素和异位激素:绒毛膜癌
8、绒毛膜癌HCG 垂体瘤垂体瘤生长激素生长激素 肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌肺燕麦细胞癌和一些甲状腺癌ACTH 人肺巨细胞癌细胞株（人肺巨细胞癌细胞株（PLA-801）促性腺激素促性腺激素 肝癌肝癌HCG (b)肿瘤细胞的受体表达肿瘤细胞的受体表达:ER PR AR (c)酶及同工酶活性酶及同工酶活性:酶活性保持酶活性保持(HTC酪氨酸氨基转移酶酪氨酸氨基转移酶)、变化变化 诱导剂诱导剂 糖皮质激素、多肽激素糖皮质激素、多肽激素 改变培养条件：改变培养条件：谷氨酸替代谷氨酰胺谷氨酸替代谷氨酰胺脑星形胶质细胞谷氨酰合成酶脑星形胶质细胞谷氨酰合成酶 活性活性增增7倍倍左右左右 特异的同工酶谱：特异的同
9、工酶谱：绒癌绒癌T3M-3表达胎盘性碱性磷酸酶表达胎盘性碱性磷酸酶 (d)癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达：癌基因及抑癌基因核酸及蛋白的表达：高转移人卵巢细胞系高转移人卵巢细胞系HO-8910PM 表达：表达：p53 p16 bcl-2 nm-23 CD44v6 c-erbB-2 EGFR 等基因的蛋白产物等基因的蛋白产物 不表达：不表达：Bax基因的蛋白产物基因的蛋白产物 7.细胞株交叉污染的检测：细胞株交叉污染的检测：细胞遗传学方法：细胞遗传学方法：染色体分析染色体分析 特异的染色体标志探针作特异的染色体标志探针作FISH G带核型分析鉴别同种肿瘤细胞带核型分析鉴别同种肿瘤细胞 Q带分析检
10、测人带分析检测人Y染色体染色体 免疫学方法：免疫学方法：HLA或动物的组织相容性抗原的测定或动物的组织相容性抗原的测定 生化方法：生化方法：同工酶谱或其它生化指标同工酶谱或其它生化指标 8.微生物污染的检测：微生物污染的检测：细菌：细菌：培液混浊，高倍镜下隐约可见均匀散在细小菌体培液混浊，高倍镜下隐约可见均匀散在细小菌体 真菌：真菌：培液混浊，高倍镜下可见菌丝或孢子培液混浊，高倍镜下可见菌丝或孢子 病毒：病毒：病毒核酸和蛋白产物病毒核酸和蛋白产物 支原体：支原体：以核酸（以核酸（DNA）荧光染色即）荧光染色即H-stain(Hoechst 33258，即二苯并咪唑染色即二苯并咪唑染色)较为常用
11、较为常用,356nm光的激发下光的激发下 可发出可发出458nm的强荧光的强荧光,体外正常细胞恶性转化的鉴定体外正常细胞恶性转化的鉴定 正常细胞体外恶性转化的鉴定指标正常细胞体外恶性转化的鉴定指标(14项指标项指标)（第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过）（第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过）核型分析出现非整倍体核型分析出现非整倍体 能在软琼脂培养基中增殖并形成集落能在软琼脂培养基中增殖并形成集落 异种动物接种能生成肿瘤异种动物接种能生成肿瘤 端粒保持不变或延长以及端粒酶活性的增高端粒保持不变或延长以及端粒酶活性的增高 指标指标 正常细胞正常细胞 转化的纤维母细胞转化的纤维母细胞 转化的
12、上皮细胞转化的上皮细胞 形态形态 伸展良好伸展良好,折光较弱折光较弱;核质比小核质比小,梭形梭形,伸展较差伸展较差,折光较强折光较强;核质比大核质比大,与正常细胞之间差别不如纤维母细胞与正常细胞之间差别不如纤维母细胞 胞质嗜碱性弱胞质嗜碱性弱;核仁较小较少核仁较小较少;胞质嗜碱性强胞质嗜碱性强,核仁较大较多核仁较大较多;多核巨细胞多核巨细胞 大大;多形性较常见多形性较常见 多核巨细胞较少多核巨细胞较少 较多较多 粘附性粘附性 细胞间粘附性较强细胞间粘附性较强,紧贴瓶壁生长紧贴瓶壁生长 粘附性差粘附性差,易脱落易脱落 差别不明显差别不明显生长特性生长特性 排列有方向性排列有方向性,单层生长单层生
13、长,存在密度存在密度 方向性消失方向性消失,多层重叠多层重叠,密度依赖性抑制消失密度依赖性抑制消失 差别不明显差别不明显,某些细胞株呈重叠生长某些细胞株呈重叠生长 依赖性抑制依赖性抑制 对血清的依赖对血清的依赖 较高较高 较低较低 差别不明显差别不明显 扫描电镜观察扫描电镜观察 微绒毛少微绒毛少 微绒毛丰富微绒毛丰富 微绒毛不稳定微绒毛不稳定,有时增多有时增多 植物凝集素引起的凝集植物凝集素引起的凝集 弱弱 较弱较弱 较强较强 细胞表面的糖蛋白和糖脂细胞表面的糖蛋白和糖脂 正常正常 糖基化不完全糖基化不完全 糖基化不完全糖基化不完全 纤维连接蛋白纤维连接蛋白 正常存在正常存在 减少或消失减少或
14、消失 纤溶酶原激活酶纤溶酶原激活酶 较低较低 增高增高 不稳定不稳定,某些株增高某些株增高 胞质中微丝微管的排列胞质中微丝微管的排列 规则规则 紊乱紊乱 不稳定不稳定 胞质胞质cAMP浓度浓度 较高较高 较低较低 核型核型 二倍体二倍体 非整倍体或假二倍体非整倍体或假二倍体 非整倍体非整倍体 琼脂培养琼脂培养 不生长不生长 生长生长 生长生长 接种异种易感动物接种异种易感动物 不长肿瘤不长肿瘤 长肿瘤长肿瘤 长肿瘤长肿瘤 世界各国的细胞库（世界各国的细胞库（cell bank）及索引）及索引 美国美国 美国典型培养细胞库美国典型培养细胞库（American Type Culture Colle
15、ction,即即ATCC,Rockville,MD）人与动物细胞培养目录人与动物细胞培养目录（Catalog of Human and OtherAnimal Cell Cultures,Naval Biosciences Laboratory,Cell Culture Department,Naval Supply Center,Oakland,CA)人基因突变细胞及老年细胞培养库人基因突变细胞及老年细胞培养库（Human Genetic Mutant Cell Culture and Ageing Cell,Culture Repositories,Institute for Medica
16、l Research,Camden,NJ)欧洲欧洲 真核细胞培养库真核细胞培养库(Culture de Cellules Eucaryotes,Repertoire des Utilisateurs.,M.Adophe,D.Gourdji,A.Tixier-Vidal,R.Robineaux,Inserm Publications,101 Rue de Tobiac,75654 Paris,Cedex 13 医学病毒学系（医学病毒学系（Department of Medical Virology,Institute de Pasteur,Paris)欧洲动物细胞培养库欧洲动物细胞培养库（Eur
17、opean Collection for Animal Cell Cultures,即即ECACC,PHLS/CAMR,Porton,Salisbury,England)欧洲人类基因突变细胞库欧洲人类基因突变细胞库(European Human GeneticMutant Cell Bank,Department of Clinical Genetics,Erasmus University,Rotterdam)日本日本 癌细胞系库癌细胞系库(Collection of Cancer Cell lines,National Institute of Hygenic Sciences,Tokyo
18、)普通细胞库普通细胞库(General Cell Bank,Institute of Physical and Chemical Research of RIKEN,Saitama)Flow Laboratories;GIBCO特殊表型肿瘤细胞系（株）：特殊表型肿瘤细胞系（株）：高转移高转移 人肝细胞性肝癌细胞株人肝细胞性肝癌细胞株MHCC97 人黑色素瘤细胞株人黑色素瘤细胞株MV3、卵巢癌细胞株卵巢癌细胞株HO-8910PM、肺巨细胞癌细胞株肺巨细胞癌细胞株PGBE1 高度耐药高度耐药 人红白血病细胞株人红白血病细胞株K562/ADM对阿霉素的抗性增对阿霉素的抗性增114.7倍倍 分泌产生激
19、素、蛋白、酶或一些因子分泌产生激素、蛋白、酶或一些因子 人肺小细胞癌细胞株人肺小细胞癌细胞株LU-165抗利尿激素抗利尿激素;人肺腺癌细胞株人肺腺癌细胞株LC-2/ad1-抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶 人红白血病细胞株人红白血病细胞株K562高表达端粒酶高表达端粒酶 体内研究体内研究(In Vivo)肿瘤动物模型：肿瘤动物模型：自发性肿瘤自发性肿瘤 诱发性肿瘤诱发性肿瘤 移植性肿瘤移植性肿瘤.一、自发性肿瘤一、自发性肿瘤 种系种系：大鼠的自发肿瘤不如小鼠多见，大动物更为少见大鼠的自发肿瘤不如小鼠多见，大动物更为少见 Sinclair猪到一岁时有猪到一岁时有85%可发生恶性黑色素瘤可发生恶性黑色素瘤 品
20、系品系：C3H小鼠小鼠 乳腺癌发病率为乳腺癌发病率为97%BALB/c 乳腺癌发病率低乳腺癌发病率低 AKR小鼠小鼠 淋巴细胞性白血病发病率为淋巴细胞性白血病发病率为70%90%近交系近交系SJL/J小鼠小鼠 淋巴瘤淋巴瘤(何杰金病何杰金病)自发率高达自发率高达91%缺点缺点：发病迟发病迟,发病时期不集中发病时期不集中,发病率也不稳定发病率也不稳定 二、诱发性肿瘤二、诱发性肿瘤 优点：优点：发生率、发病时间、发生部位及组织学类型均易控制发生率、发病时间、发生部位及组织学类型均易控制 实验结果重复性相对较好实验结果重复性相对较好 1.化学诱癌动物肿瘤模型化学诱癌动物肿瘤模型 1775年英国医师年
21、英国医师Pott 扫烟囱扫烟囱 阴囊癌阴囊癌 1914年年,日本学者日本学者山极和市川山极和市川 煤焦油煤焦油 皮肤癌皮肤癌 1934年年Yashida用邻氨基偶氮甲苯诱发大鼠肝癌成功用邻氨基偶氮甲苯诱发大鼠肝癌成功 我国从我国从1960年代开始进行化学诱癌动物模型的研究年代开始进行化学诱癌动物模型的研究 1956年年亚硝胺亚硝胺和和1961年年黄曲霉毒素黄曲霉毒素的致癌作用相继被发现的致癌作用相继被发现 (1)化学致癌物化学致癌物 诱发时间相对较短诱发时间相对较短 有剂量有剂量-效应关系效应关系 基因毒化学致癌物一般具有高度亲电子性，基因毒化学致癌物一般具有高度亲电子性，与生物大分子中富于电
22、子的亲核残基相结合与生物大分子中富于电子的亲核残基相结合,影响硷基对的正常配位或大分子的结构与功能影响硷基对的正常配位或大分子的结构与功能 正常细胞的癌变正常细胞的癌变.直接致癌物和前致癌物（间接致癌物）直接致癌物和前致癌物（间接致癌物）常见化学致癌物常见化学致癌物:1)多环碳氢化合物多环碳氢化合物:25种以上种以上,以煤焦油的主要成分以煤焦油的主要成分3,4-苯并芘苯并芘 和和3-甲基胆蒽的致癌性最强甲基胆蒽的致癌性最强 2)氨基偶氮化合物氨基偶氮化合物:二甲基氨基偶氮苯亦称二甲基黄二甲基氨基偶氮苯亦称二甲基黄(奶油黄奶油黄),3-甲基甲基-4,4-二甲基氨基偶氮苯二甲基氨基偶氮苯(3-Me
23、-DAB)3)芳香胺类芳香胺类:苯胺印染工厂苯胺印染工厂 吸入乙萘胺在肝变为氨基苯经肾排出吸入乙萘胺在肝变为氨基苯经肾排出 联苯胺联苯胺膀胱癌膀胱癌 2-乙酰氨基芴乙酰氨基芴(2-AAF)4)亚硝胺类亚硝胺类:亚硝酸盐亚硝酸盐+二级胺二级胺亚硝胺类化合物亚硝胺类化合物 强致癌物强致癌物 致癌谱甚广致癌谱甚广 不同分子的亚硝胺化合物仍有一定的器官亲和性不同分子的亚硝胺化合物仍有一定的器官亲和性 对称衍生物如二烷基亚硝胺对称衍生物如二烷基亚硝胺肝癌肝癌 不对称的亚硝胺不对称的亚硝胺食管癌食管癌 5)霉菌毒素霉菌毒素:种类较多种类较多 首推首推黄曲霉毒素黄曲霉毒素(aflatoxin),存在于霉变的
24、花生、存在于霉变的花生、玉米及谷物中玉米及谷物中,6)金属元素金属元素:砷、铬、镍砷、铬、镍、肺癌肺癌 镉镉前列腺癌前列腺癌.(2)影响化学致癌的因素影响化学致癌的因素 1)动物方面动物方面品系品系:诱发肝癌时：诱发肝癌时：F-344大鼠对大鼠对DEN和和2-AAF的敏感性要比其它品系的大鼠高的敏感性要比其它品系的大鼠高 诱发皮肤肿瘤：诱发皮肤肿瘤：BALB/c和和SENCAR品系小鼠对品系小鼠对DMNU、DENU的敏感性的敏感性 大大高于大大高于Swiss品系小品系小鼠鼠性别性别:2AAF诱发肝癌：小鼠诱发肝癌：小鼠60%发生肝癌发生肝癌,小鼠不敏感小鼠不敏感.F-344大鼠大鼠,比更敏感比
25、更敏感年龄年龄:一般而言一般而言,动物年龄越小动物年龄越小,对化学致癌物越敏感对化学致癌物越敏感,敏感性：敏感性：胎鼠胎鼠新生鼠新生鼠成年鼠成年鼠2)化学致癌物方面化学致癌物方面剂量阈值剂量阈值:启动因子（启动因子（initiator）不表现明显的剂量阈值）不表现明显的剂量阈值 促癌因子（促癌因子（promotor）则有剂量阈值）则有剂量阈值 一般的化学致癌物往往兼有启动和促癌的作用一般的化学致癌物往往兼有启动和促癌的作用,因此仍可表现有剂量阈值因此仍可表现有剂量阈值 如如3-Me-DAB(60ppm)致癌强度致癌强度:诱发大鼠肝癌总剂量诱发大鼠肝癌总剂量:DAB为为1000mg 3-Me-D
26、AB为为600mg,2-AAF为为250mg,DMN只需只需100mg;诱癌潜伏期诱癌潜伏期:诱发肝癌：诱发肝癌：AFB1需时约需时约1年年,3-Me-DAB与与2-AAF约半年左右约半年左右,DEN一般只需一般只需3个月个月;诱癌靶器官诱癌靶器官:诱癌谱：相对专一，如诱癌谱：相对专一，如3-Me-DAB一般只引起肝癌一般只引起肝癌,较广，如亚硝胺类可诱发多器官肿瘤较广，如亚硝胺类可诱发多器官肿瘤;化学致癌物的相互作用化学致癌物的相互作用:多数多数 协同作用而加速致癌协同作用而加速致癌,少数少数 会产生拮抗作用会产生拮抗作用.有的化学物质单独使用时本身不致癌有的化学物质单独使用时本身不致癌,但
27、可增强致癌物作用（促癌物）但可增强致癌物作用（促癌物）3)3)诱癌方案（诱癌方案（carcinogenic regimen）和方法）和方法 半年后半年后12周后周后喂正常饲料喂正常饲料(代表代表1周周)喂含喂含0.06%3Me-DAB的饲料的饲料喂含喂含0.02%2-AAF的饲料的饲料部分肝切除部分肝切除苯并蒽苯并蒽(Benzanthracene)直接涂擦皮肤直接涂擦皮肤注射至皮下注射至皮下产生皮肤癌产生皮肤癌产生纤维肉瘤产生纤维肉瘤 非基因毒致癌物非基因毒致癌物(non-genotoxic carcinogen)美国公布的美国公布的301种化合物中种化合物中,162种可致鼠类肿瘤种可致鼠类肿
28、瘤 其中其中 36%不引起细胞不引起细胞DNA的改变的改变 44%不引起细胞突变不引起细胞突变 致癌机制？致癌机制？促进细胞增殖？促进细胞增殖？抑制细胞凋亡？抑制细胞凋亡？其它未知？其它未知？2 生物因子诱发动物肿瘤模型生物因子诱发动物肿瘤模型 (1)病毒诱发动物肿瘤模型病毒诱发动物肿瘤模型 1908年年Ellermann和和Bang 白血病鸡的无细胞滤液诱发鸡白血病获成功白血病鸡的无细胞滤液诱发鸡白血病获成功 白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、皮肤癌、肾癌白血病、淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌、皮肤癌、肾癌等等,与与病毒感染病毒感染有关有关 1)DNA病毒病毒 多瘤病毒多瘤病毒(PyV)疱疹病毒疱疹病毒(
29、herpes virus sylvilagas)2)RNA病毒病毒 急性急性RNA肿瘤病毒：肿瘤病毒：潜伏期较短潜伏期较短(34周周),大部分肉瘤病毒、禽白血病病毒、大部分肉瘤病毒、禽白血病病毒、个别小鼠白血病病毒个别小鼠白血病病毒(如如Abl-MuLV)都属于本组都属于本组.该组病毒基因组结构常有缺陷该组病毒基因组结构常有缺陷,需辅助病毒协助才能复制需辅助病毒协助才能复制 慢性慢性RNA肿瘤病毒：肿瘤病毒：潜伏期较长潜伏期较长(412月月)，大部分动物白血病病毒属于本组，大部分动物白血病病毒属于本组 （2）其它生物因子诱发的动物肿瘤模型）其它生物因子诱发的动物肿瘤模型 幽幽门螺杆菌感染门螺杆
30、菌感染SPF级的级的BALB/c小鼠小鼠,22月以后月以后,38%的实验小鼠胃有淋巴滤泡增生的实验小鼠胃有淋巴滤泡增生,25%的小鼠胃出现形态类似人胃粘膜相关淋巴瘤的病变的小鼠胃出现形态类似人胃粘膜相关淋巴瘤的病变 （B细胞淋巴瘤）细胞淋巴瘤）3.转基因动物肿瘤模型转基因动物肿瘤模型 Stewart等获得等获得13个个MMTV-LTR/myc融合基因的转基因小鼠系融合基因的转基因小鼠系,其中两株其中两株c-myc启动子启动子为为MMTV-LTR启动子中启动子中糖皮质激素受体糖皮质激素受体 反应元件反应元件所取代所取代,在在早期妊娠时即发生自发性乳腺癌早期妊娠时即发生自发性乳腺癌。Chisari
31、等等 HHBV的的S基因、病毒增强子和基因、病毒增强子和X基因基因转基因小鼠转基因小鼠,HBsAg的积聚的积聚引起内质网明显扩张引起内质网明显扩张,出现出现肝细胞毛玻璃样改变肝细胞毛玻璃样改变,100%小鼠发生小鼠发生肝脏肿瘤肝脏肿瘤 X基因和病毒增强子的质粒基因和病毒增强子的质粒X基因转基因小鼠基因转基因小鼠,21月龄时月龄时,两个品系转基因小鼠两个品系转基因小鼠肝肿瘤肝肿瘤发生率分别为发生率分别为 75%82.8%三、移植性肿瘤三、移植性肿瘤 可移植瘤株可移植瘤株：将一种动物肿瘤移植到同系同种或异种动物将一种动物肿瘤移植到同系同种或异种动物,经传经传 代（代（20代）代）,组织形态特征逐渐
32、稳定，即成为同种组织形态特征逐渐稳定，即成为同种 或异种动物的可移植瘤株。或异种动物的可移植瘤株。移植瘤来源：移植瘤来源：动物自发性肿瘤或诱发性肿瘤动物自发性肿瘤或诱发性肿瘤 我国用我国用615近交系小鼠的自发瘤近交系小鼠的自发瘤建立了：建立了：肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病等移植瘤株肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病等移植瘤株 用用诱发瘤诱发瘤建立了：建立了：小鼠宫颈癌（小鼠宫颈癌（U27及及U14）小鼠前胃癌（小鼠前胃癌（Fc）肝细胞癌等移植瘤株。肝细胞癌等移植瘤株。近交系动物的应用近交系动物的应用：1962年年,苏格兰医师苏格兰医师Dssacson和和 Cattanach发现（裸小鼠）发现（裸小鼠）
33、*移植性人肿瘤裸鼠模型广泛应用移植性人肿瘤裸鼠模型广泛应用 1、免疫缺陷动物、免疫缺陷动物 (1)T细胞免疫功能缺陷动物细胞免疫功能缺陷动物 裸小鼠裸小鼠：*先天性先天性胸腺发育不良胸腺发育不良(妊娠妊娠1415天可见少量胸腺天可见少量胸腺 痕迹痕迹,并非全无胸腺并非全无胸腺)*胸腺依赖性胸腺依赖性T细胞细胞明显减少或缺乏明显减少或缺乏,*B细胞细胞仍然存在仍然存在,但功能低下但功能低下,免疫球蛋白以免疫球蛋白以IgM为主为主,*NK细胞细胞有较强活力。有较强活力。纯合子的裸大鼠纯合子的裸大鼠：基因符号：基因符号rnu。特征与裸小鼠相似。特征与裸小鼠相似 无胸腺大鼠无胸腺大鼠(2)B细胞免疫功
34、能缺陷动物细胞免疫功能缺陷动物 B细胞细胞功能衰退功能衰退,血浆血浆IgM、IgG低下低下,T细胞功能尚属正常细胞功能尚属正常 CBA/N系小鼠系小鼠 Arabian和和Quarter马马(3)联合免疫缺陷及其它免疫缺陷动物联合免疫缺陷及其它免疫缺陷动物 CBA/NNU小鼠小鼠 T、B淋巴细胞淋巴细胞功能均缺陷功能均缺陷;严重联合免疫缺陷小鼠（严重联合免疫缺陷小鼠（SCID）：突变基因：突变基因scid位于第位于第16对染色体对染色体 纯合子小鼠纯合子小鼠T、B淋巴细胞淋巴细胞极度低下极度低下,NK细胞和抗原传递细胞功能尚正常细胞和抗原传递细胞功能尚正常 先天性联合免疫缺陷型小鼠：先天性联合免
35、疫缺陷型小鼠：NK细胞、细胞、T、B细胞细胞功能联合缺陷裸小鼠：功能联合缺陷裸小鼠：缺点：缺点：*需在需在 germ-free或或SPF条件下饲养，较苛刻条件下饲养，较苛刻 *平均寿命仅平均寿命仅1430d。2、人肿瘤免疫缺陷动物模型、人肿瘤免疫缺陷动物模型 移植成功率移植成功率:取决于取决于 移植方法移植方法：人癌组织直接移植的成功率平均为人癌组织直接移植的成功率平均为30%人癌细胞株为人癌细胞株为6070%肿瘤本身肿瘤本身：成功率最高成功率最高结肠癌、胃癌、黑色素瘤结肠癌、胃癌、黑色素瘤;其次其次胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植、宫颈癌、食管癌等胰腺癌裸小鼠胰腺内原位移植、宫颈癌、食管癌等;较低
36、较低前列腺癌、乳腺浸润癌、淋巴网织系统肿瘤和白血病前列腺癌、乳腺浸润癌、淋巴网织系统肿瘤和白血病 裸小鼠品系裸小鼠品系：人前列腺癌人前列腺癌BALB/c成功率仅成功率仅2%（3/150）NMRI裸小鼠可达裸小鼠可达35%（6/16）其它其它：接种部位接种部位 宿主遗传背景宿主遗传背景 年龄和建康状况等年龄和建康状况等(1)人组织裸鼠人组织裸鼠诱癌诱癌模型模型 诱发鼻咽癌诱发鼻咽癌 青少年慢性鼻咽增殖体炎青少年慢性鼻咽增殖体炎鼻咽活检鼻咽活检或或刮除组织刮除组织移植于移植于NC系裸小鼠系裸小鼠 二亚硝基哌嗪二亚硝基哌嗪（NDP）为致癌剂）为致癌剂 鼻咽上皮增生鼻咽上皮增生 巴豆油巴豆油A因子因子
37、（TPA）为促癌剂）为促癌剂 乳头状增生、不典型增生乳头状增生、不典型增生 原位癌原位癌 诱发肺癌诱发肺癌 裸鼠体内人类气管、支气管培养成功也为用人材料诱发肺癌的实验奠定了基础裸鼠体内人类气管、支气管培养成功也为用人材料诱发肺癌的实验奠定了基础(2)人肿瘤裸鼠移植模型人肿瘤裸鼠移植模型 *1969年丹麦的年丹麦的Ryggard 人结肠癌移植于裸小鼠人结肠癌移植于裸小鼠 *100余种人类恶性肿瘤裸小鼠移植模型：余种人类恶性肿瘤裸小鼠移植模型：癌肿癌肿 肝、肺、胃、结肠、食管、胰腺、乳腺、肝、肺、胃、结肠、食管、胰腺、乳腺、前列腺、鼻咽、前列腺、鼻咽、淋巴造血系统肿瘤淋巴造血系统肿瘤 软组织肿瘤软
38、组织肿瘤 其它其它 黑色素瘤、视网膜母细胞瘤黑色素瘤、视网膜母细胞瘤*1978年年Festing首次进行裸大鼠人癌异种移植首次进行裸大鼠人癌异种移植*1983年我国建成甲胎蛋白阳性裸大鼠人肝癌模型年我国建成甲胎蛋白阳性裸大鼠人肝癌模型LTNR与与LTMR2两株两株(3)人肿瘤转移裸鼠模型人肿瘤转移裸鼠模型 我国始于我国始于80年代中期年代中期 肺癌肺癌、肝癌肝癌转移及转移及胃癌肝转移胃癌肝转移和和淋巴道转移淋巴道转移等等1)人肺癌高转移裸小鼠模型人肺癌高转移裸小鼠模型 吴秉铨等将吴秉铨等将6株人肺癌细胞系移植株人肺癌细胞系移植BALB/cA,nu/nu/JCLB裸小鼠裸小鼠 其中一株肺巨细胞癌
39、细胞系移植建成高转移模型其中一株肺巨细胞癌细胞系移植建成高转移模型,定名为定名为PG 带瘤带瘤存活存活30天以上裸小鼠天以上裸小鼠中中 淋巴结转移淋巴结转移(29/30)肺转移肺转移(26/30)传传17代后代后,瘤组织瘤组织再移植裸小鼠再移植裸小鼠(存活存活30天天)淋巴结转移淋巴结转移(12/12)肺转移肺转移(9/12)转移率达转移率达100%2)人肝癌高转移裸小鼠模型人肝癌高转移裸小鼠模型 孙肪宪孙肪宪,汤钊猷等用汤钊猷等用30例人肝癌组织直接移植于例人肝癌组织直接移植于46周龄的周龄的BALB/cA,nu/nu裸小鼠裸小鼠,移植移植部位部位在小鼠在小鼠肝实质肝实质内或内或肝包膜下肝包
40、膜下 其中一例其中一例39岁男性岁男性(巨块型肝细胞癌伴肝内播散和淋巴结转移巨块型肝细胞癌伴肝内播散和淋巴结转移)其移植瘤育成其移植瘤育成 人肝癌高转移裸鼠模型人肝癌高转移裸鼠模型,定名为定名为LCI-D-20 鼠间连续传代鼠间连续传代(16代代)成功率成功率100%,间期为间期为20天天 肺、淋巴结及肝内转移肺、淋巴结及肝内转移(72/72),腹腔种植转移腹腔种植转移(50/72),转移率达转移率达100%3)其它其它 胃癌肝转移胃癌肝转移 杨善民等用杨善民等用人低分化人低分化胃粘液腺癌胃粘液腺癌细胞系细胞系MGC80-3在在BALB/c裸小鼠建成移植瘤后裸小鼠建成移植瘤后 再用再用移植瘤单
41、细胞悬液移植瘤单细胞悬液接种于裸小鼠接种于裸小鼠脾包膜脾包膜下下 肝内胃癌转移肝内胃癌转移率达率达60%用用CCl4处理裸小鼠处理裸小鼠,肝内胃癌转移率可达肝内胃癌转移率可达100%,其它脏器则未见转移其它脏器则未见转移 淋巴结转移淋巴结转移 李斯德等将人李斯德等将人小细胞癌小细胞癌NCI-H128细胞系接种裸小鼠细胞系接种裸小鼠 腹股沟、腋窝和颌下淋巴结出现转移腹股沟、腋窝和颌下淋巴结出现转移 淋巴结转移率淋巴结转移率达达100%3 应用应用 肿瘤的生物学特性肿瘤的生物学特性 浸润转移浸润转移 临床治疗临床治疗 基因治疗基因治疗 导向治疗导向治疗 药敏测定法药敏测定法（SRC）实验可评价率为
42、实验可评价率为93%新抗癌药物开发筛选新抗癌药物开发筛选 Molecular Oncology Some Molecular Methodology in Tumor Research一、基因变异的诊断一、基因变异的诊断 基因表达异常基因表达异常 肿瘤肿瘤 基因突变：转位，重排基因突变：转位，重排 Southern blot，PCR 点突变点突变 DGGE 硷基缺失硷基缺失 CDGE SSCP 基因丢失：基因丢失：SSCP Microsatellites analysisDGGE=Denaturing Gradient Gel ElectrophoresisCDGE=Constant Dena
43、turing Gel ElectrophoresisSSCP=Single Strand Conformation PolymorphismPCR-SSCP:year 1989,Orita MGene PCR Homozygote HetrozygoteHeating(50)for 10 min+formamideNon denaturing PAGE(300V,5h,silver staining)PCR-SSCP灵敏度高，一个硷基的改变可在电泳速度上反映出来灵敏度高，一个硷基的改变可在电泳速度上反映出来但但DNA片段的大小与灵敏度有关片段的大小与灵敏度有关100-300 bp 突变检出率突
44、变检出率 97%300-500 bp 检出率检出率 67%以以200 bp 左右为佳左右为佳PCR-SSCP的主要步骤：的主要步骤：1.DNA模板制备（从石蜡组织中提取）模板制备（从石蜡组织中提取）脱蜡：少许石蜡组织放入脱蜡：少许石蜡组织放入Eppendorf管管+1ml 二甲苯二甲苯 65，5 分钟分钟离心，离心，5分钟，弃上清分钟，弃上清 重复一次重复一次 1 ml EtOH,振摇后离心振摇后离心5分钟，弃上清分钟，弃上清 1 ml EtOH(70%),振摇后离心振摇后离心5分钟，弃上清分钟，弃上清 真空离心真空离心5分钟，使干燥分钟，使干燥 消化：消化：180m ml pH8.0 TE+
45、20m ml buffer+10m ml proteinase K(20mg/ml)55,3-5h 加加50m ml Chelex-100(25%水溶液水溶液)55,1h 100,10 min spin,3 min提纯提纯DNA：上清上清+200m ml phenol,剧烈振摇剧烈振摇 离心，离心，3 min 上清上清+phenol/choroform,振摇振摇 离心，离心，3 min 水相水相+25m ml NaOAc 3M,1m ml glycogen,750m mlEtOH(pure)-20,over night spin 15 min,at 4 pellets washed with
46、EtOH70%spin,pellets resuspended in 100-200m ml TE,pH82.Run PCR 注意：注意：PCR产物最好在产物最好在200 bp左右左右 琼脂糖电泳条带清晰琼脂糖电泳条带清晰3.PCR产物产物 run 非变性非变性PAGE 制胶（制胶（36%MDE 胶，胶，or 6%polyacrylamide）稀释样品（稀释样品（1m mlPCR产物产物+4m ml去离子水）去离子水）alkaline denature,(+1m ml NaOH,4m ml去离子水）去离子水）50水浴水浴10min后后+stop solution 2m ml)12m ml/we
47、ll 20恒温，恒温，300伏恒压下电泳伏恒压下电泳5h Alkaline stock solution:0.5 M NaOH+10mMEDTAStop solution:1ml formamide(99%pure)+20m ml 0.5M EDTA(pH8.0)+50m ml 1%bromophenol+25m ml 1%xylene cyanol4.胶染色胶染色 PAGE胶作记号（左下角切去小胶作记号（左下角切去小）入）入10%醋酸固定醋酸固定20min 胶用去离子水洗三次，每次胶用去离子水洗三次，每次2min 胶入硝酸银溶液反应胶入硝酸银溶液反应30min 胶用去离子水洗一次，约半分钟胶
48、用去离子水洗一次，约半分钟 胶入还原液还原显色（时间依需要而定）胶入还原液还原显色（时间依需要而定）胶入胶入10%醋酸终止反应，约醋酸终止反应，约5分钟分钟 胶在胶在80下真空干燥下真空干燥2小时小时P53基因基因exon5突变（突变（PCR-SSCP）N T L N T LPCR-SSCP的应用：的应用：1.经经PCR-SSCP确定确定DNA片段有突变，该片段经测序可确片段有突变，该片段经测序可确定突变的形式和定位，可避免因测序或定突变的形式和定位，可避免因测序或PCR反应出现的反应出现的碱基配对差错造成的假阳性碱基配对差错造成的假阳性 2.在无非特异性电泳条带情况下，可以初步确定有无基因的
49、在无非特异性电泳条带情况下，可以初步确定有无基因的杂合性丢失（杂合性丢失（Loss of Hetrozygote,LOH)二、检测基因的丢失和扩增二、检测基因的丢失和扩增 比较基因组杂交比较基因组杂交 Comparative Genomic Hybridization,CGH 分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合分子生物学技术与细胞遗传学方法相结合 优点：优点：1.新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可新鲜材料和福尔马林固定石蜡包埋材料均可 进行进行CGH研究研究 2.被测样品只需数被测样品只需数m mg甚至不到甚至不到1 m mg的的DNAR/G 低度扩增 高度扩增 丢失不同荧光（红不同荧光
50、（红/绿）绿）标记基因组标记基因组DNA片段片段（500-2000 bp）人人Cot-1 DNA对正常人染色体进行原位分子杂交被测DNA参照DNA退火及预杂交退火及预杂交石蜡包埋材料提取的石蜡包埋材料提取的DNA质量较差，可用变性引物对所提质量较差，可用变性引物对所提取的基因组取的基因组DNA进行整体扩增进行整体扩增Degeneration Oligonucleotide Primed PCR(DOP-PCR)First step:Primer:5CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3(DOP)酶：消除酶：消除35外切酶活性的外切酶活性的T7噬菌体噬菌体DNA聚合酶聚合酶条件：宽松条
