1、冷冻保存技术-胚胎冷冻保存 胚胎冷冻保存是将胚胎保存在-196超低温的液氮（或其他抗冻保护剂）中做长期保存。可使胚胎移植不受时间地点的限制，从而达到提高胚胎移植效率，长期保存优良基因的目的。胚胎冷冻技术为建立优良品种的胚胎库提供了条件，还可以长期保存珍贵或濒临灭绝的动物资源。研究和优化胚胎冷冻保存技术对胚胎工程的发展有重要的意义。抗冻保护剂v胚胎冷冻的关键是减少细胞内冰晶形成对胚胎的损伤。对于胚胎的冷冻和解冻，一50-15是一个致死温度区。在这个温度区细胞容易形成大的冰晶。加入抗冻保护剂能避免冰晶的形成。v分类：渗透型冷冻保护剂；非渗透性冷冻保护剂渗透型冷冻保护剂v属于细胞内冷冻保护剂，一般小
2、分子物质，在0以上很容易通过细胞膜进入细胞质。v机理：在进行胚胎冷冻时，保护剂使水分子从细胞内渗透出，减少了细胞内冰晶的形成；同时保护剂与水分子形成氢键，降低了冻结部分的电解质浓度从而减少了冷冻过程对细胞的损伤。v常见的渗透型冷冻保护剂有：甘油、二甲基要亚砜（DMSO）、丙二醇和乙二醇等。非渗透型冷冻保护剂v属于细胞外冷冻保护剂，一般为高分子物质，能够溶解于水，但不能进入细胞。v机理：风渗透型冷冻保护剂主要通过该百年渗透压引起细胞脱水，发挥非特异性保护作用。v常见的非渗透型冷冻保护剂包括：单糖（如葡萄糖）、二糖（如蔗糖）、三糖（如棉子糖）、聚乙烯吡咯烷酮等。冷冻方法v冷冻保护液常用pH7.27
3、.4的磷酸盐缓冲液（PBS）来配制，也可用生理盐水或M199来配制。v在实际应用中，缓慢冷冻法经常只使用一种抗冻保护剂；快速冷冻和玻璃化冷冻常应用多种康冷冻保护剂，如甘油、丙二醇和乙二醇或者乙二醇和丙二醇，再加入葡萄糖、蔗糖或半乳糖。v现有保存方法有4种：常规冷冻法；一步冷冻法；程序冷冻法和玻璃化冷冻化。（书本中着重讲述后两种）常规冷冻法v也叫慢速冷冻法、逐步降温法。v基本步骤：将采集到的胚胎用培养液洗涤后置入有不同冷冻保护剂(甘油或二甲亚枫(DMSO)等)浓度的三种冷冻液中(冷冻液浓度由低到高，最终浓度14M)，每种冷冻液中平衡5分钟。然后将胚胎和冷冻液装入细管中封口、标记，放入冷冻仪中进行
4、冷冻。冷冻速率先以13C分下降至-6-7，在此温度诱发结晶，平衡10分钟。然后，以03分的速率降温至-35_38，之后投入液氮中保存。胚胎解冻后，需按胚胎进入冷冻液时的相反浓度，即从高到低浓度脱除冷冻保护剂，每步5分钟，最后置入含20血清的PBS保护液中洗涤3次，彻底脱除冷冻保护剂。或者将解冻后的胚胎放入05M(或10M)的蔗糖溶液中平衡10分钟，再用上述PBS液洗涤3次。一步冷冻法v也叫一步细管法。v该方法是由慢速冷冻法改进而来，细管内的冷冻液和蔗糖液是分开的，因此，在细管内用蔗糖液可一步脱除甘油抗冻剂，从而利于在生产中推广应用。程序冷冻法v也叫慢速冷冻法、逐步降温法。v所用冷冻保护剂一般为
5、：二甲亚砜（DMSO）、氨基酸、丙三醇（甘油）、1,2-丙二醇等。该法采用较低浓度的冷冻保护剂，对胚胎毒性损害小，解冻后存活率较高。但因其操作繁琐，降温速度慢，致使所需时间长，需要特殊的降温装置，在不具备实验条件的场所不能使用此法进行胚胎冷冻。目前国内外均较少使用。v影响因素包括：抗冻保护剂的选择与浓度、植冰和降温速度、解冻方法、抗冻的脱出等v大致基本步骤如下：v将采集到的胚胎在含20%小牛血清的PBS溶液中洗涤2次v讲洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol|L甘油和20%小牛血清的PBS的冷冻中平衡20minv将胚胎和冷冻液装入0.25ml胚胎冷冻细管中，封口，并在细管外标记供体号、胚胎
6、数量、等级、冷冻日期等v将装入胚胎的习惯放入冷冻仪中，在0平衡10min，以1|min的速度降至-7-6，并在此温度下诱发洁净，平衡10min，然后0.3的速度降温至-38-35，投入液氮保存v解冻时从冷冻液中取出装胚胎的细管，在空气中平衡10s，立即至于37水浴解冻，1min后取出完成解冻过程v将细管中的冷冻液及胚胎推出，在现实镜下找到胚胎并移入解冻液。采用三步法脱除甘油，每步57min。最后用PBS液将胚胎洗35遍，供移植备用。v不论是细胞渗透性还是细胞非渗透性的保护剂都主要是为了给细胞造成脱水状态，但脱水的同时不能影响到细胞的生存；减少细胞外大冰晶的形成对细胞造成的损害也是冷冻应注意的方
7、面之一。v业已证实，单纯就低温保存而言，影响细胞冷冻保存的关键因素，是细胞冷冻和复温过程中，必须两次经过冰晶形成和重结晶的中间损伤温度区。在冷冻过程中，如果含水量过多，细胞可能毁于过度冰晶形成。但脱水过度，细胞也可能死亡。v理想的冷冻方案是：找到细胞含水过多和脱水过度之间的平衡点；合适剂量的冷冻保护剂，既可以取代细胞质膜周围的水分子，又避免“溶质效应”；合适的冷冻速率。玻璃化冷冻法v将胚胎在适当的冷冻保护剂混合液中作短暂处理后，直接投入液氮。冷冻保护剂在急剧降温到很低温度时能被浓缩而不结晶，而且液体的粘性增强，由液态变为透明的固态，形成玻璃化。v用这种方法冷冻，无需冻前分步添加抗冻剂和冻后分步
8、脱除抗冻剂的繁琐步骤，简化了冷冻过程，是一种简便、快速、有效的冷冻方法，不需要冷冻仪器。v是近年来发展起来的一种新的方法。v大致基本步骤如下：v将胚胎在含20%小妞血清的PBS溶液中清洗两次v将洗涤过的胚胎在室温条件下加入含1.4mol|L甘油和20%小牛血清的PBS的冷冻液中平衡10minv将胚胎专一到含有10%甘油+20%小牛血清的PBS溶液中，立即转入胚胎冷冻习惯v将习惯在液氮冠颈部预冷5min后投入液氮中保存v解冻时将液氮中取出细管，在空气中平衡7s，迅速投入20温水中，摇动细胞管使其解冻均匀v将解冻后的胚胎移入含1.0mol|L蔗糖+20%小牛的PBS溶液中平衡10min，出去保护剂；再用含20小牛血清的PBS溶液洗涤2次后用于移植
