1、生化实验技术专题生化实验技术专题 主要内容：介绍生物大分子分离纯化的一主要内容：介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和原则；介绍层析技术、电泳技术、离般步骤和原则；介绍层析技术、电泳技术、离心技术、超过滤技术的原理及其应用；总结蛋心技术、超过滤技术的原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。第一节第一节 生物大分子物质的制备生物大分子物质的制备第二节第二节 几类主要的生化实验技术几类主要的生化实验技术第三节第三节 蛋白质、核酸的检测蛋白质、核酸的检测第一节第一节 生物大分子物质的制备生物大分子物质的制备一一一般过程和原则一般过程和原则二二注意事项
2、注意事项三纯化方案的设计和评价三纯化方案的设计和评价例：例：宇佐美曲霉宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化酸性蛋白酶的纯化确立有效成分的测定方法确立有效成分的测定方法材料的选择和预处理材料的选择和预处理细胞的破碎和细胞组分分离细胞的破碎和细胞组分分离有效成分的抽提有效成分的抽提有效成分的纯化和浓缩有效成分的纯化和浓缩层析法层析法 电泳法电泳法 超离心法超离心法 透析和超滤透析和超滤盐析（盐析（硫酸铵盐析硫酸铵盐析）等点电沉淀等点电沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀离心离心前处理前处理 粗分级粗分级 细分级细分级 材料选择与处理材料选择与处理细胞破碎（机械破细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、碎、溶账和自溶、
3、酶解、化学处理）酶解、化学处理）生物组织生物组织 提取液提取液 粗产品粗产品结晶结晶分子大小分子大小溶解度溶解度电荷性质电荷性质吸附性质吸附性质生物亲和力生物亲和力依据原理依据原理注意事项注意事项基本原则：防止生物分子变性、降解基本原则：防止生物分子变性、降解 1控制适当的控制适当的pH 2控制低温控制低温 3注意提取过程中的溶液环境注意提取过程中的溶液环境 4防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基宇佐美曲霉宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤纯化步骤 总蛋白总蛋白 总活力总活力 比活力比活力 纯化倍数纯化倍数 回收率回收率 （mg）（U
4、）（U/mg蛋白）蛋白）（%）1、粗酶液、粗酶液 80 4320 54 1 1002、乙醇沉淀、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 833、醋酸钙沉淀、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 694、盐析、盐析 4 1771 464 8.52 415、丙酮沉淀、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 276、结晶、结晶 0.12 130 1072 19.70 3一、一、层析技术层析技术二二、电泳技术电泳技术三三 、离心技术离心技术四四 、透析透析和和超过滤超过滤1层析技术一般原理层析技术一般原理2层析技术分类层析技术分类3常用层析技术及应用常用层析技术及应用 层析技术是一种
5、物理的分离方法。无论何种层析层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析,都是由互不都是由互不相溶的两个相组成相溶的两个相组成:一是固定相一是固定相(固体或吸附在固体上的液体），固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化一是流动相（液体或气体）。层析时，利用混合物中各组分理化性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、溶解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动解度等）的差异，使各组分不同程度地分布在两相中，随着流动相从固定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。相从固
6、定相上流过，不同组分以不同速度移动而最终被分离。混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的分配情况，一般用分配系数分配情况，一般用分配系数(distribution coefficient,Kdistribution coefficient,Kd d）来）来描述。混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。描述。混合物各组分的分配系数差异越大，越容易分离开。物质在层析系统中的行为并不直接决定于其物质在层析系统中的行为并不直接决定于其K Kd d，而取决于它的，而取决于它的有效分配系数有效分配系数K Keffeff :K Kef
7、f eff=某一物质在某一物质在A A相中的总量相中的总量某一物质在某一物质在B B相中的总量相中的总量 纸层析纸层析 薄膜层析薄膜层析 柱层析柱层析洗脱液洗脱液样品样品填充物填充物分部收集分部收集玻璃柱玻璃柱AspThrThrLysGlyGluSerProAlaCysValMetIleLeuTyrPheHisNH3Arg0.20.41.00.60.8光光吸吸收收流出液流出液(mL)150cm柱柱，pH3.25，0.067mol/L柠檬酸钠柠檬酸钠150cm柱柱，pH4.25，0.067mol/L柠檬酸钠柠檬酸钠15cm柱柱，pH5.25，0.12mol/L柠檬酸钠柠檬酸钠缓冲液泵缓冲液泵显色
8、反显色反应管应管茚三酮泵茚三酮泵已分开的已分开的氨基酸氨基酸离子交换柱离子交换柱样品注入口样品注入口记录仪记录仪光电倍光电倍增管增管光源光源层析柱层析柱恒温装置恒温装置载气（流动相）载气（流动相）样品）样品）进样室进样室检测器检测器记录仪记录仪出口出口层层析析柱柱恒恒温温装装置置溶剂储瓶溶剂储瓶溶剂过滤器溶剂过滤器进样室进样室检测器检测器记录仪记录仪各类层析的原理和载体各类层析的原理和载体类别类别 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝、羟基磷酸、羟基磷酸分配层析分配层析 两溶剂相中的溶解效应两溶剂相中的溶解效应 纤维素、
9、硅藻土纤维素、硅藻土、硅胶、硅胶凝胶层析凝胶层析 分子筛效应的排阻效应分子筛效应的排阻效应 sepharose 、sephadex离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反应离子基团的交换反应 离子交换树脂离子交换树脂 、纤维素、纤维素、葡聚糖葡聚糖亲和层析亲和层析 分离物与配体之间有分离物与配体之间有 带配基的带配基的sepharose 特殊亲和力特殊亲和力 或或sephadex聚焦层析聚焦层析 等电点和离子交换作用等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的荷基团的配体相偶联的 sepharose 6B）吸附层析吸附层析分配层析分配层析凝
10、胶过滤凝胶过滤（分子筛层析（分子筛层析）离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析 聚焦层析聚焦层析原理：原理：载体载体：硅胶硅胶 氧化铝氧化铝 羟基磷石灰羟基磷石灰应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸 等生化物质等生化物质以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解定相上流过时，各组分也就不
11、同程度地被溶解（解吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。同速度随流动相向前移动。原理：原理：载体载体：纤维素纤维素 硅藻土硅藻土 硅胶硅胶应用：应用：各种生化物质的分离鉴定各种生化物质的分离鉴定 分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均样品点中的溶质在水和有
12、机相中溶解度不同而不均匀地分配在两相中，各种组分按其各自的匀地分配在两相中，各种组分按其各自的分配系数分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。物质物质Y(Kd=1)的分配情况的分配情况溶剂溶剂 A物质物质Z(Kd=3)的分配情况的分配情况溶剂溶剂 B总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量平衡后平衡后转移转移 1转移转移 2转移转移 3分溶管号分溶管号转移转移 4上相转移上相转移下相转移下相转移上相转移上相转移管管中中蛋蛋白白质质总总量量物质物质Y物质物质Z分溶曲线分溶曲线管号管号有效分配系数（有效分配系数（Keff）某一物质在某一物质在
13、A相中的总量相中的总量某一物质在某一物质在B相中的总量相中的总量基质基质 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（sephadex）琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（sepharose）应用应用 测定分子量测定分子量 脱盐和浓缩脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子分离提纯生物大分子 除去热原物质除去热原物质 原理原理：凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是：凝胶层析也称为排阻凝胶层析、凝胶过滤和分子筛层析。它是60 年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方年代发展起来的，利用凝胶把物质按分子大小不同进行分离的一种方法。由于被分离物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子法。由于被分离
14、物质的分子大小（直径）和形状不同，洗脱时，大分子物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的物质由于直径大于凝胶网孔不能进入凝胶内部，只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质孔隙，随溶剂向下移动，因此流程短，首先流出层析柱，而小分子物质，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，由于直径小于凝胶网孔，能自由进出胶粒网孔，使之洗脱时流程增长，移动速度慢而后流出层析柱。，移动速度慢而后流出层析柱。凝胶颗粒凝胶颗粒收收集集蛋蛋白白质质管管蛋白质混合物蛋白质混合物大分子大分子从柱上面加缓冲溶液从柱上面加缓冲溶液小分子小分子
15、洗脱体积（洗脱体积（Ve）凝胶柱凝胶柱大分子大分子小分子小分子Ve1Ve2V0蛋白质蛋白质Mr=49,000洗出洗出液中液中的蛋的蛋白质白质浓度浓度洗脱体积（洗脱体积（mL）未知未知logMrAndrews的经验公式：的经验公式：logMr=K1-K2(Ve/Vo)G-200G-100logMrKav原理原理基质基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用应用 制备纯化生物物质制备纯化生物物质 定量、定性测定混合物中各组分定量、定性测定混合物中各组分1.平衡阶段平衡阶段:离子交换剂离子交换剂与反离子结合与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离吸附阶段：样品与反离子
16、进行交换子进行交换3、4.解吸附阶段：用解吸附阶段：用梯度缓冲溶液洗脱，先梯度缓冲溶液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质下强吸附物质5.再生阶段：用原始平再生阶段：用原始平衡液进行充分洗涤，既衡液进行充分洗涤，既可重复使用可重复使用12345原始缓冲溶原始缓冲溶液的反离子液的反离子样品溶液样品溶液梯度浓度梯度浓度蛋蛋白白质质浓浓度度洗脱体积洗脱体积带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质收集样品的管收集样品的管收集样品的管收集样品的管带负电荷带负电荷的蛋白质的蛋白质蛋白质混合物蛋白质混合物玻璃柱玻璃柱带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质带负电荷带负
17、电荷的蛋白质的蛋白质带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质收集样品的管收集样品的管NaClNaCl梯度梯度凝胶颗粒凝胶颗粒蛋白质混合物蛋白质混合物大分子大分子小分子小分子储液瓶储液瓶混合瓶混合瓶层层析析柱柱磁力搅拌器磁力搅拌器洗脱剂体积（洗脱剂体积（mL）洗洗脱脱剂剂浓浓度度简单型梯度混合器简单型梯度混合器梯度洗脱曲线梯度洗脱曲线洗脱剂体积（洗脱剂体积（mL）洗洗脱脱剂剂浓浓度度储液瓶储液瓶混混合合瓶瓶复合型梯度混合器复合型梯度混合器梯度洗脱曲线梯度洗脱曲线凸形凸形线形线形凹形凹形离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型）纤维素（弱酸型）羧甲基羧甲
18、基P-纤维素（中强弱酸型）纤维素（中强弱酸型）磷酸基磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型）磺乙基磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型）磺丙基磺丙基AE-纤维素（弱减型）纤维素（弱减型）氨基乙基氨基乙基离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构PAB-纤维素（弱减型）纤维素（弱减型）对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸DEAE-纤维素纤维素 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE-Sephadex 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE-纤维素（强减型）纤维素（强减型）二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基QAE-纤维素（强减型）纤维素（强减型）二乙基（二乙基（2-羟丙羟
19、丙基）基）-氨基乙基氨基乙基（中弱减型）（中弱减型）（中弱减型）（中弱减型）应用应用 分离纯化酶、分离纯化酶、抗原、抗体抗原、抗体 分离纯化核酸分离纯化核酸 研究酶的结构与功能研究酶的结构与功能+待纯化分子待纯化分子配体配体a.理论依据理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质基质b.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质杂质c.待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d.偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子原理原理：基质基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、纤
20、维素、聚丙烯酰胺凝胶、sepharose、sephadex蛋白质混合物蛋白质混合物配体配体与配体结合的与配体结合的蛋白质蛋白质加入的可溶性加入的可溶性配基配基专一性结专一性结合蛋白质合蛋白质没有结合的没有结合的蛋白质蛋白质非专一性结非专一性结合蛋白质合蛋白质蛋蛋白白质质浓浓度度洗脱体积洗脱体积与配体专一性与配体专一性结合蛋白质结合蛋白质加入配基加入配基基质基质 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进
21、行排梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。列的过程叫做聚焦效应。pH梯度的形成梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时梯度的层析柱上时,由于由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的迁移到与它等电点相同的pH处。从此位处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被时被洗出。在聚焦层析过程中洗出。在聚焦层析过程中,一
22、种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且并且有一定的时间进行聚焦有一定的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。其聚焦过程都能顺利完成。pH梯度溶液的形成示意图梯度溶液的形成示意图蛋白质蛋白质1（pI=7）蛋白质蛋白质2（pI=8）流速流速移动速率移动速率层析时的聚焦效应示意图层析时的聚焦效应示意图 1电泳的一般原理电泳的一般原理 2.电泳技术的类别电泳技术的类别 3、常用电泳技术常用电泳技术4、电泳技术的拓展电泳技术的拓展电泳的一般原理电泳的一般原理 电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极电泳是
23、带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象移动的现象 。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的决于分子组成、性质及其所在介质的pHpH。如果混合物中各组。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一分的结构组成不同，在某一pHpH溶液中，各组分所带电荷性质溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。的目的。垂直板电泳垂直板
24、电泳毛细管电泳毛细管电泳水平板电泳水平板电泳电电泳泳支支持持物物滤纸滤纸凝胶凝胶薄膜薄膜圆盘电泳圆盘电泳1、醋酸纤维薄膜电泳、醋酸纤维薄膜电泳2、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳3、琼脂糖电泳琼脂糖电泳 4、毛细管电泳毛细管电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE）1、一般、一般PAGE2、SDS-PAGE3、PAGE等电点聚焦等电点聚焦polyacrylamidegelpolyacrylamidegel electrophoresis electrophoresis，PAGEPAGE是在区带电泳原理的基础上
25、，以孔径大小不同的聚丙烯是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶酰胺凝胶(PAG)(PAG)作为支持物，采用电泳基质的作为支持物，采用电泳基质的不连续体系不连续体系(即凝即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pHpH的不连续性的不连续性及电位梯度的不连续性及电位梯度的不连续性)或或 连续体系连续体系（一层凝胶、一种（一层凝胶、一种pHpH和一和一种缓冲溶液），进行电泳分离一种方法。种缓冲溶液），进行电泳分离一种方法。PAGPAG是用丙烯酰胺是用丙烯酰胺(acrylamideacrylamide，AcrAcr)和交联剂亚甲基双丙烯
26、和交联剂亚甲基双丙烯酰胺酰胺(N N，N N-methylen-methylen。bisacrylamidebisacrylamide，BisBis)在催化剂的作用在催化剂的作用下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。下聚合而成，聚合反应的催化系统有两种。化学聚合化学聚合:催化剂过硫酸铵催化剂过硫酸铵(AP)(AP)，加速剂，加速剂TEMEDTEMED 光聚合光聚合:催化剂核黄素，加速剂催化剂核黄素，加速剂TEMEDTEMED 不连续不连续PAGEPAGE三种效应：电荷效应、分子筛效应和三种效应：电荷效应、分子筛效应和浓缩效应浓缩效应的浓缩效应的浓缩效应样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶快离子快离
27、子慢离子慢离子蛋白质蛋白质A AB BC C+-样品样品浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶电极缓电极缓冲液冲液低电位低电位梯度梯度E E1 11高电位高电位梯度梯度E E2 21+-原理：原理：当当SDSSDS（Sodium DodecylSodium Dodecyl Sulfate Sulfate）与蛋白质结合后，蛋白质）与蛋白质结合后，蛋白质分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使分子即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白天然蛋白质分子间的电荷差别就降低乃至消除了。与此同时蛋白质在质在SDSSDS的作用下结构变得松
28、散，形状趋向一致，所以各种的作用下结构变得松散，形状趋向一致，所以各种SDS-SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直异。在此条件下，样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。可用下式表示：线关系。可用下式表示：Log Mr=a bmr应用应用:测定蛋白质分子量测定蛋白质分子量 测定蛋白质亚基数测定蛋白质亚基数Mr（相对迁移率）（相对迁移率）mr（相对迁移率）（相对迁移率）Log Mr原理原理:在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体在一定抗对流介
29、质（如凝胶）中加入两性电解质载体(Ampholyte,是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系是一种多氨基多羧基的混合物，由异构物和同系物组成，其物组成，其pK和和pI值各自相异却又相近值各自相异却又相近），当直流电通过时），当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其合物在此电泳过程中，就被浓集在与其pI相等的相等的pH区域，从区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。应用：应用：高效率分离纯化蛋白质高效率分离纯化蛋白质 测定蛋白质分子量测定
30、蛋白质分子量pH10pH3pI1=pH8pI2=pH7pI3=pH5-+线线性性梯梯度度琼脂糖电泳琼脂糖电泳 琼脂糖是由琼脂糖是由D-D-半乳糖和半乳糖和3 3、6 6脱水的脱水的L-L-半乳糖连接构成的多糖半乳糖连接构成的多糖链，这种多糖链在链，这种多糖链在1001000 0C C左右时呈液态，当温度下降到左右时呈液态，当温度下降到45450 0C C以下以下时，它们之间以氢键方式相互连接就成了线性双链单环的琼脂时，它们之间以氢键方式相互连接就成了线性双链单环的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。琼脂糖凝胶用作电泳的固相支持物具有分子筛效应，其对生琼脂糖凝胶用
31、作电泳的固相支持物具有分子筛效应，其对生物分子的分离作用不仅与其分子的构象及其相对分子质量大小物分子的分离作用不仅与其分子的构象及其相对分子质量大小有关，而且与凝胶的浓度也有密切关系，故可根据分离对象分有关，而且与凝胶的浓度也有密切关系，故可根据分离对象分子量大小选择适当浓度的凝胶。子量大小选择适当浓度的凝胶。琼脂糖电泳常用于琼脂糖电泳常用于核酸分离核酸分离，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为分离长度为2 2OObPOObP至至5 5OkbOkb的的DNADNA，琼脂糖凝胶还常用作免疫电泳的固相支持物。琼脂糖凝胶还常用作免疫电泳的固相支持物。不同浓度琼脂糖凝胶分离
32、不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA的范围的范围琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度(%)(%)可分辨的线性可分辨的线性DNADNA大小范围大小范围(kb)kb)0.3 60-50.3 60-5 0.6 20-1 0.6 20-1 0.7 10-0.8 0.7 10-0.8 0.9 7-0.5 0.9 7-0.5 1.2 6-0.4 1.2 6-0.4 1.5 4-0.2 1.5 4-0.2 2.0 3-0.1 2.0 3-0.1DNA相对分子质量相对分子质量标准物标准物水平型平板电泳槽水平型平板电泳槽 毛细管电泳毛细管电泳(Capillary ElectrophoresisCapillary Electro
33、phoresis，CE)CE)毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（2-75m2-75m）中装入）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是毛细管电泳是近年来发展起来
34、的一项新技术，被认为是9090年代最有影响年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、研究、分离合成的寡核苷酸、DNADNA序列测定序列测定及及PCRPCR产物的分析鉴定等。产物的分析鉴定等。毛细管电泳原理示意图毛细管电泳原理示意图 毛细管电泳检测技术的发展毛细管电泳检测技术的发展 毛细管电泳分离模式的发展毛细管电泳分离模式的发展30KV高压电源高压电源光光源源光电倍光电倍增管增管数据采集数据采集石英玻璃石英玻璃毛细管毛细管缓冲液缓冲液-样品样品缓冲液缓冲液正极正极负极
35、负极毛细管电泳检测技术的发展毛细管电泳检测技术的发展 （一）紫外可见光吸收（一）紫外可见光吸收 石英毛细管因可透过石英毛细管因可透过20nm波长以下的紫外光，因此不仅允许从紫外到可见光这波长以下的紫外光，因此不仅允许从紫外到可见光这一波长范围内对样品组分进行检测。而且可将透光窗口直接开在毛细管上，进行一波长范围内对样品组分进行检测。而且可将透光窗口直接开在毛细管上，进行“在柱在柱”检测。检测。（二）荧光检测法（二）荧光检测法 是毛细管电泳中一种常见的是毛细管电泳中一种常见的“在柱在柱”检测法，尤其是激光诱导荧光检测法检测法，尤其是激光诱导荧光检测法(LIF)，其灵敏度可高达，其灵敏度可高达10
36、-1210-16mol/L-1，是目前毛细管电泳中最灵敏的一种检测方法，是目前毛细管电泳中最灵敏的一种检测方法。（三）电化学检测方法（三）电化学检测方法电导检测、电位检测、安培检测是电化学检测常用的三种方法，对电活性组分的检电导检测、电位检测、安培检测是电化学检测常用的三种方法，对电活性组分的检测具有灵敏度高、线性范围宽、选择性好以及价格低廉等特点。测具有灵敏度高、线性范围宽、选择性好以及价格低廉等特点。（四）集成毛细管电泳芯片（四）集成毛细管电泳芯片 该项技术以晶体硅、玻璃、塑料该项技术以晶体硅、玻璃、塑料(指有机玻璃指有机玻璃)、陶瓷和硅橡胶为基本材料，借助、陶瓷和硅橡胶为基本材料，借助毛
37、细管电泳技术，将样品进样、反应、分离、检测等过程集成到一起的多功能化的毛细管电泳技术，将样品进样、反应、分离、检测等过程集成到一起的多功能化的技术，该项工作与分析仪器的微型化、小型化和集成化紧密相连技术，该项工作与分析仪器的微型化、小型化和集成化紧密相连,使得其能符合现代使得其能符合现代生物化学、制药工业的低成本和高产出的需求。生物化学、制药工业的低成本和高产出的需求。毛细管电泳分离模式的发展毛细管电泳分离模式的发展 （一）毛细管区带电泳（一）毛细管区带电泳 又称毛细管自由电泳，毛细管内只充入缓冲溶液，在直流高压驱动下，溶质以不又称毛细管自由电泳，毛细管内只充入缓冲溶液，在直流高压驱动下，溶质
38、以不同的速率在分立的区带内进行迁移而被分离。可用于氨基酸、多肽、离子、对映体同的速率在分立的区带内进行迁移而被分离。可用于氨基酸、多肽、离子、对映体等物质的分析。等物质的分析。（二）毛细管凝胶电泳（二）毛细管凝胶电泳 将板上的凝胶移到毛细管中作支持物而进行的电泳。凝胶具有多孔性将板上的凝胶移到毛细管中作支持物而进行的电泳。凝胶具有多孔性,起类似分子起类似分子筛的作用，溶质按分子大小进行分离。常用聚丙烯酸胺在毛细管内交联制成凝胶柱筛的作用，溶质按分子大小进行分离。常用聚丙烯酸胺在毛细管内交联制成凝胶柱，可用于分离测定蛋白质和，可用于分离测定蛋白质和DNA等，但制备繁琐，使用寿命短。等，但制备繁琐
39、，使用寿命短。（三）毛细管等电聚焦（三）毛细管等电聚焦(CIEF)将普通等电聚焦电泳转移到毛细管中进行，在高压作用下，毛细管内部建立将普通等电聚焦电泳转移到毛细管中进行，在高压作用下，毛细管内部建立pH梯度，蛋白质在毛细管中向各自的等电点聚焦，形成明显的区带，再通过检测器分梯度，蛋白质在毛细管中向各自的等电点聚焦，形成明显的区带，再通过检测器分别加以确认，常用于分离离子型物质。别加以确认，常用于分离离子型物质。（四）亲和毛细管电泳（四）亲和毛细管电泳(ACE)建立在生物分子之间的亲和作用基础上，利用亲和分子（如抗原与抗体、酶与建立在生物分子之间的亲和作用基础上，利用亲和分子（如抗原与抗体、酶与
40、底物、配体与受体等）相互选择性，通过毛细管电泳来测定这些分子，从而具有高底物、配体与受体等）相互选择性，通过毛细管电泳来测定这些分子，从而具有高选择性和灵敏性。传统的亲和分析有很多优点，但在技术上操作繁琐，自动化程度选择性和灵敏性。传统的亲和分析有很多优点，但在技术上操作繁琐，自动化程度低，测定周期长，因而亲和分析与毛细管电泳的联用正可弥补其局限性和缺点。低，测定周期长，因而亲和分析与毛细管电泳的联用正可弥补其局限性和缺点。电泳技术的拓展电泳技术的拓展1、免疫电泳、免疫电泳(immuno electrophoresis)2、单细胞凝胶电泳技术、单细胞凝胶电泳技术(single cell gel
41、 electrophoresis assay，SCGE)，又称彗星试验，又称彗星试验(Cometassay)3、双向电泳双向电泳(two dimensional electrophoresis，2DE)4、脉冲凝胶电泳、脉冲凝胶电泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE)5、连续型逆向色谱电泳连续型逆向色谱电泳(continuous counteraction chromatographic electrophoresis，CACE)6、介体电泳、介体电泳(preparative electrophoresis)7、温度梯度凝胶电泳（、温度梯度凝胶电泳（tem
42、perature gradient gel electrophoresis）正常小鼠结肠组织蛋正常小鼠结肠组织蛋白质组的双向电泳白质组的双向电泳人胃癌人胃癌SGC7901细胞细胞蛋白质组的双向电泳蛋白质组的双向电泳第一向：第一向：PAGE等电点聚焦（等电点聚焦（IEF），第二向：），第二向：SDS PAGE载液载液色色谱谱阳极阳极阴极阴极目标产品富集区目标产品富集区填料填料（排阻区）（排阻区）填料填料（嵌入区）（嵌入区）净速度净速度电泳电泳色色谱谱净速度净速度电泳电泳目标蛋白的迁移情况目标蛋白的迁移情况1离心机离心机类别类别 普通离心机普通离心机 1000转转/分分 高速离心机高速离心机 2-
43、3万转万转/分分 超速离心机超速离心机 3万转万转/分分2沉降系数沉降系数（sedimentation coefficient,s）3超离心法类别超离心法类别 密度梯度离心法密度梯度离心法（density gradient）沉降速度法沉降速度法（sedimentation velocity）沉降平恒法沉降平恒法（sedimentation eguilibrium）转头转头转头腔转头腔沉降样品沉降样品驱动马达驱动马达真空真空冷冻冷冻 沉降系数沉降系数（sedimentation coefficient）生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为沉降系生物大分子在单位离心力场作用下的沉降速度称为
44、沉降系数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态数。即沉降系数是微颗粒在离心力场的作用下，从静止状态到达极限速度所需要的时间。到达极限速度所需要的时间。数学定义式为：数学定义式为：沉降系数单位沉降系数单位：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介：由于蛋白质、核酸、病毒等的沉降系数介于于1 11010-13-13介于介于1010-13-13到到2002001010-13-13s s的范围，为方便起见，把的范围，为方便起见，把1 11010-13-13s s作为沉降系数的一个单位，用作为沉降系数的一个单位，用SvedbergSvedberg单位，用即单位，用即S S表示。表示。沉降系数（沉
45、降系数（s s）与相对分子量（）与相对分子量（MrMr）的关系）的关系:Mr=RTsD(1-)Svedberg方程方程:d/dt 2 s=s=生物大分子及颗粒的沉降不仅生物大分子及颗粒的沉降不仅决定于它的大小，而且也取决于决定于它的大小，而且也取决于它的密度。颗粒在具有密度梯度它的密度。颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的介质中离心时，质量和密度大的颗粒沉降的快，并且每种蛋白的颗粒沉降的快，并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等的质颗粒沉降到与自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，介质密度梯度时，即停止不前，最后各自在离心管中被分离成独最后各自在离心管中被分离成独立的区带。分成
46、区带的样品可以立的区带。分成区带的样品可以在管底刺一个小孔逐滴放出，分在管底刺一个小孔逐滴放出，分步收集。常用的介质有步收集。常用的介质有蔗糖蔗糖、氯氯化铯等。化铯等。滴加样品滴加样品离离心心管管蔗糖密度梯度蔗糖密度梯度蔗糖浓度蔗糖浓度1、核酸密度的测定、核酸密度的测定 =o+4.2 2(2-02)10-102、测定、测定DNA中中G-C之含量之含量 Rolfe-Meselson公式：公式：=0.100 xG-C+1.6583、溶液中核酸构象的研究、溶液中核酸构象的研究 ：单链：单链DNA 双链双链DNA 蛋白质蛋白质 双链双链DNA RNA4、核酸的制备、核酸的制备 氯化铯密度梯度超离心氯化
47、铯密度梯度超离心经染料经染料-氯化铯密度梯氯化铯密度梯度超离心后，质粒度超离心后，质粒DNA及各种杂质的分布及各种杂质的分布超螺旋超螺旋DNA闭环质粒闭环质粒DNA开环质及开环质及线型线型DNA蛋白质蛋白质石蜡油石蜡油 在离心场的作用下，蛋白质分子将沿旋转中心向外周方在离心场的作用下，蛋白质分子将沿旋转中心向外周方向（径向）移动，并产生沉降界面，界面的移动速度代表蛋向（径向）移动，并产生沉降界面，界面的移动速度代表蛋白质的沉降速度。在界面处由于浓度差造成折射率不同，可白质的沉降速度。在界面处由于浓度差造成折射率不同，可借助适当的光学系统，如借助适当的光学系统，如schlieren光学系统光学系
48、统（也称暗线光学（也称暗线光学照相系统），观察到这种界面的移动。在照相系统），观察到这种界面的移动。在schlieren光学系统光学系统中，利用溶液的折射率梯度（中，利用溶液的折射率梯度（d/d）和样品的浓度梯度）和样品的浓度梯度（dc/d）成正比这一特点，巧妙地设计光路，使移动的界）成正比这一特点，巧妙地设计光路，使移动的界面以峰形曲线呈现在照相图片上，峰顶代表移动界面。离心面以峰形曲线呈现在照相图片上，峰顶代表移动界面。离心机的装置允许在离心机转头旋转时，对界面的移动进行观察机的装置允许在离心机转头旋转时，对界面的移动进行观察和拍照。和拍照。光源光源柔性驱动轴柔性驱动轴热敏温度计热敏温度计
49、样品池样品池准直准直透镜透镜液面液面沉降界面沉降界面溶剂溶剂配衡池配衡池沉降界面沉降界面聚光透镜聚光透镜马达马达滤光片滤光片溶质溶质空气空气沉降方向沉降方向照相机透镜照相机透镜园柱型透镜园柱型透镜底板底板Schlieren光闸光闸真空真空冷冻冷冻12cd/d 在较低速度（在较低速度（8,000-20,000r/min）的离心场中，离心开始）的离心场中，离心开始时，分子颗粒发生沉降，由于沉降的结果造成浓度梯度。因而时，分子颗粒发生沉降，由于沉降的结果造成浓度梯度。因而产生了扩散作用，扩散力的作用方向正与离心力相反，当净离产生了扩散作用，扩散力的作用方向正与离心力相反，当净离心力与扩散平衡时，在离
50、心池内从液面到池低形成一个由低到心力与扩散平衡时，在离心池内从液面到池低形成一个由低到高的恒定浓度梯度。如果测得相关参数即可算出生物分子的分高的恒定浓度梯度。如果测得相关参数即可算出生物分子的分子量。子量。离心力离心力x1轴心轴心液面液面离心轴离心轴扩散力扩散力x2Mr=(1-)2(22-12)2RTdln(c2-c1)计算公式如下：计算公式如下：半透膜袋半透膜袋蛋白质溶液蛋白质溶液透析液透析液磁棒磁棒 磁力搅拌器磁力搅拌器 透析是利用蛋白质等大分子不透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖和其它小分子物质如无机盐单糖等分开
