1、血栓形成及栓塞模型的实验方法血栓形成及栓塞模型的实验方法 血栓形成及栓塞是危害人类健康的常见多发病。在探索这类疾病的病因发病过程中，动物模型的建立是不可少的手段之一，尤其在临床治疗学方面的应用更具有重要的地位。因此，本文将一些有关血栓形成及栓塞的方法学作一综合介绍，以供参考。一、外周血管血栓形成模型的复制方法一、外周血管血栓形成模型的复制方法二、器官血栓形成及栓塞模型的复制方法二、器官血栓形成及栓塞模型的复制方法三、栓塞模型三、栓塞模型 一、外周血管血栓形成模型的复制方法一、外周血管血栓形成模型的复制方法（一）实验性动脉血栓形成 1动脉吻合法：在麻醉大鼠颈部切口，分离20mm长的左颈总动脉。用
2、动脉夹夹住其远端，继而夹住近端，于两夹之间切断动脉，生理盐水冲洗后，在手术显微镜下行动脉吻合术。当缝合第6或第7针时，自股静脉注入药物。缝合完毕后移去远端夹子，待反流性出血止住（23分钟），便移去远端夹子，血流能顺利通过吻合处即可。30分钟后，再次夹住动脉，用10%缓冲甲醛复盖固定，处死动物后取样本作组织学检检（连续切片，厚7）。用含100个小方格的目镜，按下式测量血栓形成百分率：血栓所占的格子数血栓形成率（%）=100 管腔内总的格子数管腔内总的格子数血栓所占的格子数 2电刺激法：分离大鼠一侧颈总动脉15mm长，用两个不锈钢电极轻轻托起动脉，以1.5 mA电流刺激7.5分钟。用稳压器使电流保
3、持恒定。电热变阻温度计一直与动脉头端接触，从而连续记录血管的表面温度。也可用半导体点温计间段测量血管表面温度，伤口附近用小塑料而遮盖以免受组织温度的影响。从刺激开始至温度突降的时间即血小板血栓形成使动脉堵塞的时间（OT），用于药物效力分析，并作组织学检查。本实验若用家兔进行，则全过程以压力换能器监测血压、电磁流量计测其血流量，持续刺激120分钟或至动脉血流停止为止。3动脉袢法：将20cm长的聚乙烯管（内径1mm，外径2mm）置于热水中折成袢状，并扎线以固定。用时剪去两端，硅化后灌满肝素即可使用。在麻醉大鼠左腹部备皮，行左旁正中切口，长3cm，分离肾动脉至髂腰动脉一段，于精索内动脉和髂腰动脉处上
4、夹；分别将动脉袢的两端插入腹主动脉内，结扎固定后移去夹子恢复血流，缝合肌层并夹住皮肤，使部分袢凸出体外以便观察。动物颈部用塑料硬领圈住（外径12cm，内径2.53.0cm），以防动物咬断动脉袢，注意观察袢的色泽变化，记录堵塞时间（OT）。4、硝酸银刺激法：分离家兔腹主动脉，用一根1.5cm长的塑料槽套住动脉，以使动脉受到一定长度的损伤。在塑料槽内滴加20%硝酸银溶液。，当血小板和纤维蛋白原标记后1小时内，即可诱发血栓形成。3小时后，小心切开血管，取出血栓，立即（30秒）称重并测其放射活性。cpm/血栓具有放射性的栓子大小=x100%Cpm/ml血浆（二）实验性静脉血栓形成 1静脉结扎法将大鼠麻
5、醉固定，剖腹分离下腔静脉，于左肾静脉分枝处结扎下腔静脉，随后关腹。结扎后2小时重新开腹，夹住远端，用注射器吸尽结扎处与夹子之间血管内的血液，纵剖该段血管并取出栓子，置真空干燥器内24小时，测其干重（结扎后6小时，100%成栓），并计算血栓形成百分率。本实验可在家兔颈静脉进行，即夹住游离的颈静脉近端使之闭塞，血流充盈后再结扎其远端。30分钟后切开该段静脉，按以下标准判定结果，即：O级无血栓形成；I级显微镜下纤微蛋白丝；级数个小栓子；级两个或两个所上较大的栓子；级单个大栓子。2凝血酶促凝法：分离狗股静脉5cm长，结扎小分枝，肌皮枝除外，由该静脉插入5cm长的导管，并向静脉腔内引入一根4cm长的毛线
6、，止血后用夹子夹住游离的股静脉近端和远端，经侧枝插管并排空余血，便注入生理盐水，立即注入含放射活性的纤维蛋白原血液，并快速注入0.1ml凝血酶（100 NIH u/ml），凝块便很快形成。此后，移去两端夹子，血同侧足背静脉注入60%泛影葡胺5ml作静脉造影术，并测凝块的放射活性。（三）动-静脉短路法 将麻醉的家兔进行人工通气，无菌条件下暴露颈外静脉和颈总动脉（或股动），在动脉近端放一个内径为3或3.5mm的流量换能头以描记动脉血流量后，分别夹住动、静脉，切开插入A-V短路管（充满生理盐水）并固定之。A-V短路装置:分别作动脉和静脉插管。静脉端插管用可调节夹夹住，以控制通过短路的血流量。各接头应
7、与血管中心线相一致，勿弯曲。短路插入后，将流量调整为200ml/分，记录稳定后，小心夹住管道，拔出接头，在此处安置一块22cm，含40m小方格的聚酯网后再次接上，聚酯网被绷在管腔面上，移去夹子，恢复A-V短路血流量，并记录血流开始至停止时间。短路闭塞时间取决于聚酯网上闭塞的血栓形成。用电磁流量计监测。3钢线诱导法：在麻醉大鼠腹部手术，暴露左肾静脉处下腔静脉，将一根带尖的不锈钢导线自下腔静脉分枝徐徐插入，朝髂静脉方向轻轻捻导线，使之倾斜于腔静脉内，导线由23个螺旋（平均间隔0.7mm）和尖端组成，直径0.1mm，外径0.80.4mm，内径0.70.3mm（逐渐变细），长20mm。导线后端需固定以
8、防流向右心房。插入管腔的导线为19mm，此后，缝合切口并消毒包扎。血栓的测量：于插入导线后不同时间（任选）处死动物，在3.8%枸椽酸冲洗下，纵剖血管，小心取出附着栓子的导线，生理盐水冲洗后，置碱性溶液（20%Na2CO3于0.1N NaOH中）内沸水浴3分钟，比色测定其蛋白含量。二、器官血栓形成及栓塞模型的复制方法二、器官血栓形成及栓塞模型的复制方法（一）血栓形成模型：1冠状动脉血栓形成；在麻醉狗颈部手术，插管接正压呼吸，于左胸廓第4肋间开胸，打开心包，在右心耳处插管以供输药用。钝性分离冠状动脉左旋枝12cm长，使之与周围组织游离，将电磁流量探头固定在该动脉上以监测左旋枝血流理。冠状动脉刺激电
9、极与头皮针针尖焊接而成，将电极插入左旋枝管壁23cm，使之与血管内膜层紧密接触,电极与250,000 的电位计，9V的镉-镍电池及数字电流计相串联，将盘形电极缝合于胸部皮下，接通电流。刺激电线的设计在于能恒定监测并易于调整正电流，以直接刺激左旋枝内膜表面。6 6小时小时后，剖开左旋枝取栓称湿重，并作心肌组织切片、左旋枝动脉光镜及电镜检查。花生四烯酸诱导法：分离家兔右颈动脉，并插入聚乙烯管，其尖端位于右颈外动脉开口处，给动物注入0.7mg/kg的花生四烯酸钠（或ADP30mg/ml/kg）后10分钟，1mg的依文氏半溶液自股动脉注入，并在动物颅骨中线两侧行开窗术，于外科显微镜下观察大脑表面的变化
10、。注入花生四烯酸钠后1小时，在150cmH2O压力下，从左室插管内注入2.5%戍二醛或10%缓冲甲醛固定器官。此后，在外科显微镜下，除去蛛网膜下腔前、中、后动脉，扫描电讯镜观察脑内血管的改变。当花生四烯酸钠剂量大于0.45mg/kg时，EEG显示出规律的急性损伤电波，且脑血流降至365l/秒-1约降50%.三、栓塞模型三、栓塞模型（一）肺栓塞模型 1微聚物栓塞法：将分离出的羊血浆纤维蛋白原加凝血酶使之凝固成纤维蛋白微聚物（FMA）经甲苯磺酰精氨酸甲酯和磷酸缓冲盐冲洗后，制成磷酸缓冲盐混悬液，用高频声裂使凝块沉淀，直至聚合物直径约为50m时为止。将纯化的凝血酶（6013NIH u/kg）和纤维蛋
11、白微聚物(0.320.009g蛋白/kg)自颈静脉导管注入,在右心得以充分混合,从而造成肺栓塞,每30分钟测一次淋巴蛋白、肺血液动力学、WBC、血小板、纤维蛋白原及纤维蛋白原及纤维蛋白降解产物水平。2、颈静脉内成栓法：分离一侧颈静脉及另一侧颈总动脉，颈静脉长度至少4cm，结扎所有小分枝，切勿使静脉主干受损。将动、静脉插管内充满生理盐水，关闭静脉导管与三通和通道，随后夹住游离的颈静脉近端使之充盈，在距静脉夹45cm处结扎颈静脉远端，切开并插入插管探头，用丝线固定，开夹，以排空静脉，并重新夹住待用。栓塞过程：用1ml，10分钟后，移去静脉夹，释放第一枚栓子，并以同样方法做第二枚栓子。于给 药前后不
12、同时间取血测纤溶指标，取栓称重，并作栓子扫描电镜观察。2脑动脉血栓形成：光化学反应法：局部脑血栓形成：将健康雄性Wistar大鼠用2.5%硫喷妥钠麻醉（40mg/kg体重），卧位固定动物并消毒皮肤，切开右顶部头皮肤1cm，暴露右侧颅骨，细心分离软组织以免损伤颅骨表面而影响其透光性。于皮下嵌入一块11.4cm的消毒铜片，其中心留0.50.6cm窗孔，以便光源通过该窗孔直接照射于颅骨表面。铜片以外的组织用避光纸遮盖。自尾静脉一次注入浓度为7.5mg/ml的孟加拉红（Ros Bengal）生理盐水溶液0.133ml/100g体重（可使体内浓度为1mg/100ml）；循环10分钟后，将大鼠置“实验装置
13、”内，在光强度为0.5W/cm2条件下照射20分钟（用时间继电器控制）。此后将动物移至饲养笼内观察，分别于1、4、24小时及3天后再次麻醉动物并检查有关指标。孟加拉红(Rose bengal)吸收光能后产生单线态氧的量子效力为76%，为已知光敏物质中效果最佳的一种其吸吸光能后的反应为：孟加拉红So孟加拉红S1(激发单重态)孟加拉红S1孟加拉红T1(激发三重态)孟加拉红T1+302孟加拉红+02(单线态氧)02+底物氧化反应(即光化学反应）使之生成激发单重态，继而使血管内皮细胞表面的易感分子（如不饱和脂肪酸和某些蛋白质）发生直接过氧化，以致血管内皮细胞受损而诱导血栓形成。3、腔静脉内成栓法：手术
14、暴露狗腔静脉至髂静79cm长一段腔静脉，结扎所有分枝，经股静脉插入导管，在肾静脉和髂静脉处用两个夹子夹住腔静脉（须排空），用塑料主射器（含钽粉23ml）自股动脉取血，将血与钽粉充分混匀，用34ml去纤维蛋白的人血浆或60凝血酶诱导血栓形成。振摇混合1015秒，便注入腔静脉内，使其足以恢复原始容积即可。30分钟后，移去静脉夹，释放栓子并作放射摄象、光扫描及肺血液动力学测定。4纤维蛋白原标记法：血栓制备：取全人血0.5ml加81125I标记的人纤维蛋白质(10cpm),25mMCaCl2501加入凝血酶21(终浓度1NIH/m1),注入一根内径为3mm的聚乙烯管内,室温预浴15分钟,切取导管的中间
15、部分(1.5cm长,0.1m1血栓),放于玻璃器皿内,用0.15M NaC1反复洗涤并测定125I含量。然后，游离家兔一侧颈静脉并由上输入血栓，小心缝合静脉以恢复血流，自对侧耳缘静脉输入药物。处死动物后，小心剖开肺动脉，找到具放射活性的血栓，取出测其125I含量。以评价溶栓程度。5体外成栓法：取自体血加凝血酶（10/ml）混合凝固,切凝块为35mm的立方体,并用生理盐水洗涤,此后由右心房输入,以张力计量换能器测量MAP、MPAP、CO、PVR、血气及pH变化，或肺动脉造影。（二）脑栓塞模型：1粥样斑块栓塞法：栓塞物制备即自尸检中取粥样斑块，将其制成125mg/ml的无菌生理盐水悬液，经匀浆机沉
16、淀；于结核菌素注射器上接16号针头,抽取混悬物,剂量为3080mg之间.另备1ml生理盐水和80mg同种肝(125mg/ml)作对照(粥样物剂量分别为:30、40、50、60、80mg。步骤：手术暴露兔右颈总动脉，将粥样物缓缓注入动脉内，轻压穿刺部位2-4分钟止血。注意观察存活动物的行为特征。动物处死，在100mmHg灌注压下取脑，用3%戊二醛磷酸缓冲盐或3%三聚甲醛缓冲液固定24h。将脑切为3mm厚的切片并系列展开，以检查梗塞部位，并作光镜和电镜观察。2血凝块栓塞法：凝块制备：自大鼠心脏取血0.1ml，置室温48小时便形成凝块。用接有26号针头的注射器将凝块吸入并注至生理盐水内，反复抽吸三次
17、，使凝块破碎，即成为各种大小不同的碎片（100）悬液,取0.2ml作脑栓塞用。栓塞过程：手术暴露左颈总动脉分枝颈内、外动脉，勿伤迷走交感神经丛。在颈总动脉分枝上夹，距分枝15mm处穿线备用。经26号针头吸取栓子悬浮并由颈总动脉向其远端注入，拔针后，用外科粘合剂密封注射部位，去夹，恢复血流，作临床观察并处死动物进行组织学检查。以上诸方仅从动物模型的角度加以介绍，有的适用于防栓研究；而有的则为溶栓所借鉴。在观测指标方面，常用的为栓重、血管闭塞时间、成栓率以及纤溶活性测定等，随着现代科技的飞速发展，酶标、放免、电镜及电子计算机技术的应用将给血栓形成及栓塞的治疗监测打开新的局面。基于血栓形成的复杂病因，在建立和应用动物模型方面尚有大量的工作值得研究。血小板颗粒:FgN,TSP,FN致密颗粒：5-HT,ADP,CA血小板聚集三途经:1.ADP途经2.AA途经3.PAF途经3.PAF途经血小板聚集:血小板GPIIb/IIIa-Fgn-GPIIb/IIIa血小板 血小板黏附:血小板GPIb-vWF-胶原（血管)评分小于2 分者将被淘汰而不进行后续的实验。应注意的是,动物神经功能缺失症状与损伤范围并非总呈正相关的关系,若判定时带有主观性,将难于做出客观评价。
