1、酶联免疫吸附双抗体夹心法优选优选酶联联免疫吸附双双抗体夹夹心法一、实验实验目的 1 掌握酶联免疫吸附实验（掌握酶联免疫吸附实验（ELISAELISA）的原理）的原理2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法二、实验原理二、实验原理试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？加底物四甲基联苯胺(TMB)2 熟悉酶联免疫吸附实验的操作方法(八)试验的重复性（精确度）试验中哪些因素可能会对实验结果造成影响？(2)四甲基联苯胺(TMB)：TMB是一种脂溶性较强的基团，由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRP活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。辣根过氧化物酶(HRP)
2、辣根过氧化物酶(HRP)由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。甲胎蛋白（fetoprotein，AFP）辣根过氧化物酶(HRP)待测血清、抗-AFP-L3 抗体、封闭蛋白溶液、辣根过氧化物酶（HRP）、底物四甲基联苯胺（TMB)、显色液、终止液ELISAELISA的三条基本原理的三条基本原理双抗体夹心法双抗体夹心法双抗体夹心法图示双抗体夹心法图示1、已知抗体包 被于载体表面3、加酶标抗体 与抗原结合4、加酶作用的底物产生较深蓝色2、加肿瘤患者血清与抗体结合4、加酶作用的底物 无颜色或蓝色很淡双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原1、已知抗体包 被于载体表面
3、2、加健康人血清与抗体结合3、加酶标抗体 无（少）抗原结合+-E EE EE EE EE EE EE EE EE E三、实验仪器三、实验仪器&试剂试剂v仪器 全自动酶标仪、全自动酶标洗板机四、实验步骤四、实验步骤获得获得AFPAFP未标定抗体未标定抗体将将AFPAFP抗体与固相抗体与固相载体连接形成固相抗体载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的洗涤除去未结合的抗体及杂质抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白洗涤并除去未结合的封闭蛋白加血清形成加血清形成固相抗体抗原复合物固相抗体抗原复合物洗涤除去其他
4、洗涤除去其他未结合的物质未结合的物质 加加HRPHRP酶标抗体生成酶标抗体生成抗体抗体待测抗原待测抗原酶标记抗体酶标记抗体的复合物的复合物 彻底洗涤未结合彻底洗涤未结合 的的HRPHRP酶标抗体酶标抗体 加底物四甲基联苯胺加底物四甲基联苯胺(TMB(TMB)进行酶催化反应进行酶催化反应 根据颜色反应的程度根据颜色反应的程度进行进行AFPAFP的定量测定的定量测定详细步骤详细步骤1.标准品的稀释与加样：在酶标包被板上设标准品孔10 孔，在第一、第二孔中分别加标准品100l，然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50l，混匀；然后从第一孔、第二孔中各取100l 分别加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔
5、分别加标准品稀释液50l，混匀；然后在第三孔和第四孔中先各取50l 弃掉，再各取50l 分别加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul，混匀；混匀后从第五、第六中各取50l 分别加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50，混匀后从第七、第八孔中分别取50l 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分别加标准品稀释液50l，混匀后从第九第十孔中各取50l 弃掉。（稀释后各孔加样量都为50l，浓度分别为（1800ng/L，1200ng/L，600ng/L，300ng/L，150ng/L）。2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、待
6、测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40l，然后再加待测样品10l（样品最终稀释度为5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37温育30 分钟。4.配液：将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 秒后弃去，如此重复5 次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50l，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50l，再加入显色剂B50l，轻轻震荡混匀，37避光显色15 分钟.10.终止：每孔加终止液50l，终止反应（此时蓝色
7、立转黄色）。11.测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。测定应在加终止液后15 分钟以内进行。辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)常用底物：常用底物：(1)(1)邻苯二胺邻苯二胺(OPD)(OPD)：反应显橙黄色，应避光，致癌性。：反应显橙黄色，应避光，致癌性。(2)(2)四甲基联苯胺四甲基联苯胺(TMB)(TMB)：TMBTMB是一种脂溶性较强的基团，是一种脂溶性较强的基团，由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在由于这种高度的脂溶性，使其易形成多聚体，在HRPHRP活性活性部位产生粗大的、深蓝色沉淀物反应后呈蓝色。酶反应用部位产生粗大的、深蓝色
8、沉淀物反应后呈蓝色。酶反应用HCLHCL或或H2SO4H2SO4终止后，终止后，TMBTMB产物由蓝色呈黄色，最适吸收波产物由蓝色呈黄色，最适吸收波长为长为 450nm450nm。五、结果分析五、结果分析以标准物的浓度为横坐标，OD 值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD 值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD 值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD 值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。六、思考题六、思考题（一）固相载体（二）抗原（三）试验样品（四）结合物 (五）洗涤剂与稀释剂（六）底物（七）作用时间 (八)试验的重复性（精确度）（九）对使用仪器要求
