1、LOGOContents1玻片凝集实验玻片凝集实验+二免疫二免疫2琼脂免疫扩散试验琼脂免疫扩散试验+三免疫三免疫 34ELISA测定测定动物免疫血清制备动物免疫血清制备LOGO动物免疫血清制备技术动物免疫血清制备技术吉林大学人兽共患病研究所吉林大学人兽共患病研究所 授课人授课人 卢士英卢士英20102010级生物技术专业级生物技术专业LOGOv概念概念v免疫原的制备免疫原的制备v免疫动物免疫动物v免疫血清的纯化免疫血清的纯化v免疫血清的鉴定免疫血清的鉴定LOGO抗原与抗体的相互作用是免疫学检测的基础，抗体作为重要的特异性免疫分子，已广泛用于科学研究、临床诊断、治疗及预防中。在免疫学检测中，抗体
2、的质量直接关系到实验方法的特异性和灵敏度。因此，高质量的抗体应具备高特异性、高亲和性和高效价等特性。常用抗体：多抗、单抗LOGO1 1.概念概念 能与淋巴细胞抗原受体能与淋巴细胞抗原受体TCRTCR或或BCRBCR特异性结合，刺激特异性结合，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并与相应免疫应机体免疫系统产生特异性免疫应答，并与相应免疫应答产物在体内外发生特异性结合的物质答产物在体内外发生特异性结合的物质，即，即抗原抗原(AntigenAntigen，AgAg)。2 2.特性特性 (1)(1)免疫原性免疫原性(immunogenecityimmunogenecity)(2)(2)抗原性抗原性(a
3、ntigenicityantigenicity)又称免疫反应性又称免疫反应性(immunoreactivityimmunoreactivity)免疫原免疫原LOGO3.3.表位表位（epitopeepitope）或抗原决定簇或抗原决定簇（antigenic antigenic determinantdeterminant）是指存在于抗原分子中决定抗原特是指存在于抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团。其异性的特殊化学基团。其性质、数量和空间构象性质、数量和空间构象决决定了抗原的特异性。定了抗原的特异性。表位表位是免疫细胞识是免疫细胞识别的标志及免疫反别的标志及免疫反应具有特异性的物应具有特异性
4、的物质基础。质基础。LOGO B B细胞细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞产接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞产生的与相应抗原能够特异性结合的糖蛋白。又生的与相应抗原能够特异性结合的糖蛋白。又称称免疫球蛋白免疫球蛋白(immunoglobulin(immunoglobulin，IgIg)抗体抗体(antibody(antibody，AbAb)LOGO多多克克隆隆抗抗体体单克隆抗体单克隆抗体BALB/cABCLOGO抗血清为含有某一类具有特异免疫功能的抗体分子的血清，抗血清为含有某一类具有特异免疫功能的抗体分子的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。高效一般为动物被人工注射某类抗原后制
5、备的动物血清。高效价的抗血清用于研究工作以及疾病的诊断和治疗。价的抗血清用于研究工作以及疾病的诊断和治疗。一种抗原能否引起抗体生成反应，一方面取决于抗原分子一种抗原能否引起抗体生成反应，一方面取决于抗原分子表面有无抗原决定簇（表面有无抗原决定簇（Antigenic determinantAntigenic determinant），另一），另一方面取决于机体的免疫状态，当具备以上两个条件后，抗方面取决于机体的免疫状态，当具备以上两个条件后，抗体生成将遵循抗体生成的一般规律体生成将遵循抗体生成的一般规律初次反应和再次反初次反应和再次反应。应。LOGOLOGOv免疫原免疫原天然抗原、人工或合成抗原
6、；天然抗原、人工或合成抗原；v 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原；v具体制备：具体制备：v细胞性抗原、可溶性抗原、半抗原细胞性抗原、可溶性抗原、半抗原二、免疫原的制备二、免疫原的制备LOGO1、细胞性抗原制备：细胞性抗原制备：绵羊红细胞（绵羊红细胞（SRBCSRBC）-溶血素；溶血素；细菌细菌-抗菌抗体（动物免疫血清）抗菌抗体（动物免疫血清）一般用新鲜细胞以无菌生理盐水或磷酸缓冲液洗涤一般用新鲜细胞以无菌生理盐水或磷酸缓冲液洗涤后配成一定浓度。后配成一定浓度。若系细菌抗原，则取新鲜培养物，经集菌作如下处若系细菌抗原，则取新鲜培养物，经集菌作如下处理，理，H H抗原因不
7、耐热用抗原因不耐热用0.30.30.50.5甲醛处理，甲醛处理，O O抗原耐热可加热抗原耐热可加热1002h1002h去除去除H H抗原后应用。抗原后应用。二、免疫原的制备二、免疫原的制备LOGO2、可溶性抗原制备：可溶性抗原制备：可溶性抗原可以是细胞膜、细胞浆、细胞核及核膜可溶性抗原可以是细胞膜、细胞浆、细胞核及核膜等细胞组成部分，也可能是经细胞分泌至体液中等细胞组成部分，也可能是经细胞分泌至体液中的一些可溶性因子。的一些可溶性因子。常见的蛋白质、多糖和脂类常见的蛋白质、多糖和脂类等。等。细胞组成部分常需经过机械或酶解法等破碎、收集细胞组成部分常需经过机械或酶解法等破碎、收集整理离心获得粗制
8、抗原，并通过选择性沉淀（整理离心获得粗制抗原，并通过选择性沉淀（饱饱和硫酸铵、和硫酸铵、PEGPEG）或层析等方法进一步纯化。）或层析等方法进一步纯化。二、免疫原的制备二、免疫原的制备LOGO2、可溶性抗原制备：可溶性抗原制备：二、免疫原的制备二、免疫原的制备抗原鉴定：抗原鉴定：鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、鉴定纯化蛋白的含量、相对分子的质量、纯度以及免疫学活性。纯度以及免疫学活性。蛋白的含量蛋白的含量定氮（紫外光定氮（紫外光280nm280nm等）等）分子的质量分子的质量电泳、质谱电泳、质谱蛋白的纯度蛋白的纯度电泳、高效液相层析电泳、高效液相层析免疫学活性免疫学活性免疫双扩散、免疫印迹
9、免疫双扩散、免疫印迹LOGOv3、半抗原性免疫原的制备半抗原性免疫原的制备半抗原（半抗原（haptenhapten）：）：载体（载体（carriercarrier）：）：蛋白质类：蛋白质类：BSAOVAKLHBSAOVAKLH多肽聚合物：多聚赖氨酸、多聚谷氨酸多肽聚合物：多聚赖氨酸、多聚谷氨酸大分子有机化合物：聚羟甲基纤维素、乳胶、炭末。大分子有机化合物：聚羟甲基纤维素、乳胶、炭末。载体：本身是一种抗原，它们进入体内，可发挥致敏作用，激载体：本身是一种抗原，它们进入体内，可发挥致敏作用，激活免疫系统，从而使半抗原也可以刺激机体产生抗体，另外半活免疫系统，从而使半抗原也可以刺激机体产生抗体，另外
10、半抗原与载体结合后，可适当延迟其降解和排出体外，从而可以抗原与载体结合后，可适当延迟其降解和排出体外，从而可以发挥更久的作用。发挥更久的作用。LOGOv3、半抗原性免疫原的制备半抗原性免疫原的制备半抗原与载体的连接：半抗原与载体的连接：物理法：即利用电荷和微孔吸附半抗原物理法：即利用电荷和微孔吸附半抗原化学法：利用某些功能基团把半抗原连接到载体分化学法：利用某些功能基团把半抗原连接到载体分子上子上 LOGOv3、半抗原性免疫原的制备化学法：化学法：半琥珀酸盐法半琥珀酸盐法 某些带有某些带有羟基羟基的半抗原可与琥珀酸酐反应形成带的半抗原可与琥珀酸酐反应形成带羧基羧基的化的化合物，再与载体上的合物
11、，再与载体上的氨基氨基偶联形成完全抗原偶联形成完全抗原v 碳二亚胺法碳二亚胺法 碳二亚胺碳二亚胺(EDC)(EDC)使羧基与氨基间脱水形成酰胺键，半抗原上使羧基与氨基间脱水形成酰胺键，半抗原上的的羧基羧基先与先与EDC EDC 反应生成一个中间物，然后再与载体上的反应生成一个中间物，然后再与载体上的氨基氨基偶联形成完全抗原偶联形成完全抗原LOGOv3、半抗原性免疫原的制备化学法化学法：半琥珀酸盐法半琥珀酸盐法v 混合酸酐法混合酸酐法 含有含有羧基或酚羟基羧基或酚羟基的半抗原可以在三级胺存在下与氯甲酸的半抗原可以在三级胺存在下与氯甲酸异丁酯反应，产生活性中间体混合酸酐，再与蛋白载体上异丁酯反应，
12、产生活性中间体混合酸酐，再与蛋白载体上的伯胺基反应，形成酰胺交联键的伯胺基反应，形成酰胺交联键 LOGOv3、半抗原性免疫原的制备化学法：v高碘酸钠法高碘酸钠法v某些带某些带羰基羰基的半抗原可以通过高碘酸钠的氧化作的半抗原可以通过高碘酸钠的氧化作用形成带双用形成带双醛基醛基的化合物，再与载体表面的的化合物，再与载体表面的氨基氨基偶联形成含偶联形成含Schiff Schiff 碱的共价结构的完全抗原碱的共价结构的完全抗原LOGO3 3、半抗原性免疫原的制备、半抗原性免疫原的制备化学法：化学法：重氮化法重氮化法含有含有芳香胺芳香胺的半抗原也可通过与的半抗原也可通过与亚硝酸亚硝酸反应形成反应形成重重
13、氮盐氮盐，再与蛋白质的，再与蛋白质的酪氨酸残基上的酚羟基酪氨酸残基上的酚羟基、组氨组氨酸残基上的咪唑环酸残基上的咪唑环或或色氨酸残基的吲哚环色氨酸残基的吲哚环反应。该反应。该偶联方法可以通过重氮化后颜色的变化偶联方法可以通过重氮化后颜色的变化(红棕色红棕色)判判断是否偶联成功。但该方法重氮化连接键不稳定、断是否偶联成功。但该方法重氮化连接键不稳定、副反应严重，可能引起蛋白大量的沉淀，需特别注副反应严重，可能引起蛋白大量的沉淀，需特别注意。意。LOGO3 3、半抗原性免疫原的制备、半抗原性免疫原的制备化学法：化学法：曼尼希法曼尼希法曼尼希反应（曼尼希反应（MannichMannich反应，简称曼
14、氏反应），也反应，简称曼氏反应），也称作称作胺甲基化胺甲基化反应，是含有反应，是含有活泼氢活泼氢的化合物与的化合物与甲醛甲醛和二级和二级胺胺或或氨氨缩合，生成缩合，生成-氨基（羰基）化合物的氨基（羰基）化合物的有机化学反应。有机化学反应。LOGO佐 剂v是一种非特异性免疫增强剂，预先或同抗原一齐注射到机体，能增强对该抗原的免疫应答或改变免疫应答的类型，此种物质被称为佐剂（adjuvant）。v一、种类一、种类v1.1.无机佐剂无机佐剂 氢氧化铝、明矾氢氧化铝、明矾v2.2.有机佐剂有机佐剂 微生物极其代谢产物微生物极其代谢产物v3.3.合成佐剂合成佐剂 多聚肌苷酸、胞苷酸多聚肌苷酸、胞苷酸v4
15、.4.弗氏佐剂弗氏佐剂 不完全佐剂、完全佐剂不完全佐剂、完全佐剂v5.5.新型佐剂新型佐剂 C3dC3d、CpgCpg基序、脂质体基序、脂质体LOGO不完全不完全弗氏佐剂（弗氏佐剂（FreundadjuvantFreundadjuvant）它是将抗原水溶液与油剂（石蜡油或植物油）等量它是将抗原水溶液与油剂（石蜡油或植物油）等量混合，再加乳化剂（羊毛脂或叶吐温混合，再加乳化剂（羊毛脂或叶吐温8080）制成油包）制成油包水抗原乳剂，称之为不完全弗氏佐剂。水抗原乳剂，称之为不完全弗氏佐剂。完全弗氏佐剂：在不完全佐剂中加入分枝杆菌（如完全弗氏佐剂：在不完全佐剂中加入分枝杆菌（如死卡介苗）死卡介苗）LO
16、GOv佐剂的作用机理佐剂的作用机理v1.1.改变抗原的物理性状改变抗原的物理性状v2.2.使抗原易被吞噬细胞吞噬使抗原易被吞噬细胞吞噬v3.3.促进淋巴细胞增殖、分化，从而增强机体的免疫促进淋巴细胞增殖、分化，从而增强机体的免疫应答。应答。LOGO三、免疫动物v1 1、免疫动物的选择：、免疫动物的选择：抗原来源与动物种属的关系（越近越差）抗原来源与动物种属的关系（越近越差）动物个体的选择（年龄、体重与健康，性别）动物个体的选择（年龄、体重与健康，性别）抗原性质与动物种类抗原性质与动物种类 抗血清要求：抗血清要求：R R型型 能和很小量抗原结合形成沉淀线能和很小量抗原结合形成沉淀线 H H型型
17、较少用于沉淀反应较少用于沉淀反应。LOGO三、免疫动物v2 2、免疫的方法：、免疫的方法：v免疫原的剂量免疫原的剂量抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。细胞性抗原：细胞性抗原：羊：羊：10108 8；兔：；兔：10107 7；小鼠：；小鼠：10106 6。佐剂：附近或对侧，或者先注射佐剂，再注射抗原。佐剂：附近或对侧，或者先注射佐剂，再注射抗原。以免破坏细胞，影响免疫效果。以免破坏细胞，影响免疫效果。可溶性抗原：可溶性抗原：小鼠：小鼠：5050100g100g；大鼠：；大鼠：100100200g200g；兔：；兔：100100
18、1mg1mg，合成免疫原为合成免疫原为2mg2mg；半抗原：；半抗原：2020200g/200g/次次与佐剂混合与佐剂混合LOGO三、免疫动物v2 2、免疫的方法：、免疫的方法：v免疫的途径与其间隔时间免疫的途径与其间隔时间 皮内皮下肌内皮内皮下肌内 腹腔腹腔 静脉口服静脉口服高度特异性的抗血清，高度特异性的抗血清，低剂量抗原短程免疫法；低剂量抗原短程免疫法；高效价的抗血清，大剂量抗原长程免疫法。高效价的抗血清，大剂量抗原长程免疫法。LOGO三、免疫动物v2 2、免疫的方法：、免疫的方法：v免疫动物采血免疫动物采血 颈动脉放血法颈动脉放血法 心脏采血法心脏采血法 断尾采血断尾采血 眼球采血眼球
19、采血 静脉多次采血法静脉多次采血法LOGO免疫血清的鉴定1、抗体效价的测定（凝集、扩散、ELISA）2、特异性的鉴定（免疫印迹、双扩散）3、纯度的鉴定（SDS-PEAG）4、亲和力的鉴定affnity指抗体与抗原结合 的牢固程度，以亲和常数表示。测定方法有平衡透析、ELISA、竞争（非 竞争）结合等。LOGO四、免疫血清的保存v1、4保存（6个月）v2、低温保存（-70 -20 ，5年）v3、真空干燥保存（5 10年）注意点：保存前需经除菌 保存液含防腐剂 避免反复冻融（分装）LOGO实验一、实验一、BSABSA抗血清制备抗血清制备目的要求：目的要求：掌握免疫原和佐剂的制备方法；熟悉免疫血清制
20、备的基本过程。原理：原理：将抗原物质经适当途径，按照预先制定的免疫方案免疫动物，经过一定时间，可刺激机体产生高效价特异性抗体并分泌到血液中，当血中抗体达到预定效价时便可采血，分离血清，低温保存备用，即抗血清。因抗原具有多种表位，可激活多个克隆的B 细胞活化增殖分化产生抗体，因此，又称为多克隆抗体。优质免疫血清的产生，主要取决于抗原的质量和免疫原性，动物应答能力以及免疫程序（免疫途径、剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等）LOGO材料：1.动物：BALB/C小鼠2.抗原：BSA（2mg/mL）3.试剂：佐剂、生理盐水、75%酒精4.器材：小剪刀、镊子、无菌注射器（1ML）、一次性手套，50ML离
21、心管、酒精灯，打火机，记号笔、加样枪（1000，200，50，10ul）、吸头（1000，200，10ul），2ML离心管、250ML烧杯；均质机（乳化抗原用）实验一、实验一、BSABSA抗血清制备抗血清制备LOGO方法方法1.抗原制备：BSA(2mg/mL)配制：与佐剂等量混合，乳化30-60分钟，取一滴于冷水面上，不散开者达到“油包水”合格要求。2.免疫动物：实验一、实验一、BSABSA抗血清制备抗血清制备免疫日期免疫日期一免一免二免二免三免疫三免疫抗原抗原BSA-FCABSA-FCABSA-FIABSA-FIABSABSA途径途径腹腔腹腔/足垫足垫腹腔腹腔/足垫足垫腹腔腹腔剂量剂量100
22、Ug100Ug100Ug100Ug303050Ug50UgLOGO3.3.试血试血尾部采血尾部采血4.4.效价测定效价测定 琼脂扩散：琼脂扩散：1 1：1616 ELISA ELISA：1 1：200020005.5.采血：眼球采血、心脏采血采血：眼球采血、心脏采血6.分离血清：分离血清：一般采血后放一般采血后放37摄氏度一小时，然后放摄氏度一小时，然后放4度过夜。血清较少时可以离心度过夜。血清较少时可以离心（15003000 rpm15003000 rpm，1010分钟）分钟）实验一、实验一、BSABSA抗血清制备抗血清制备LOGO实验设计：实验设计：小鼠抗青霉素免疫血清的制备。小鼠抗青霉素免疫血清的制备。LOGOJxgykj-163
