1、流式细胞术在肿瘤学中的应用内容内容 流式细胞仪概念、原理及应用流式细胞仪概念、原理及应用 流式细胞术优势流式细胞术优势 流式细胞术在肿瘤学中的应用流式细胞术在肿瘤学中的应用流式细胞术（流式细胞术（Flow CytometryFlow Cytometry）是利用流式细胞仪检测细是利用流式细胞仪检测细胞或其它颗粒性物质的物理、化学特性。同时利用荧光染料胞或其它颗粒性物质的物理、化学特性。同时利用荧光染料,激光技术激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展单抗技术以及计算机技术的发展,大大提高了检测速大大提高了检测速度与统计精确性度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数而且从同一个细胞中可
2、以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段。力的手段。流式细胞术流式细胞术流式细胞仪检测流程流式细胞仪检测流程流式细胞术优势（分析型）流式细胞术优势（分析型）u高速测定细胞，大样本计数高速测定细胞，大样本计数u检测稀有细胞检测稀有细胞u多参数分析多参数分析FC500 FC500 流式细胞仪流式细胞仪050001000015000Quantitative cell fluorescenceLeukemia LymphomaDendritic cellsIntracellular signal transdu
3、ctionIntracellular receptorsCell viabilityCell adhesionAutoimmuneStem cellOrgan transplantationCell signalingImmune functionApoptosisHIVActivationCytokinesCell DNACell surface receptors流式细胞术的应用流式细胞术的应用检测特性：大小、颗粒度检测特性：大小、颗粒度 、细胞受体、细胞受体/分子、核酸分子、核酸 (DNA/RNA)(DNA/RNA)、蛋白、蛋白肿瘤学中的应用肿瘤学中的应用v肿瘤免疫肿瘤免疫v肿瘤细胞周期
4、和凋亡肿瘤细胞周期和凋亡v肿瘤干细胞的研究肿瘤干细胞的研究v血液中循环肿瘤细胞的研究血液中循环肿瘤细胞的研究 天然免疫天然免疫中性粒细胞中性粒细胞嗜酸性细胞嗜酸性细胞嗜碱性细胞嗜碱性细胞单核细胞单核细胞 /巨噬细胞巨噬细胞树突细胞树突细胞:mDC-pDC:mDC-pDCNK NK 细胞细胞NKT NKT 细胞细胞 T 淋巴细胞CD5+B CD5+B 细胞细胞获得性免疫获得性免疫B B细胞细胞辅助性辅助性T T细胞细胞Th1Th1Th2Th2细胞毒细胞毒T T细胞细胞调节性调节性T T细胞细胞 CD85k(ILT3)阳性设门培养体系中的细胞因子水平骨髓DC:CD11c+MNC数目、纯度、T亚群、
5、NK、CIK数目及比例肿瘤可使Th1/Th2平衡向Th2偏移,而Th1/Th2偏移又会促进肿瘤的发展,故探讨Th1/Th2功能状况以判断肿瘤患者的免疫状态可为肿瘤生物治疗提供有效的理论依据。化疗药物可能通过抑制肿瘤微环境中血管生成,促进Treg凋亡,从而起到有效控制肿瘤的作用。是否达到培养要求、调节细胞数Th1Th2细胞因子分泌细胞测定分为MDC 和PDCDC控制体内免疫和耐受的平衡骨髓DC:CD33+培养体系中的细胞因子水平T亚群、NK、CIK、细胞因子Th1Th2细胞因子分泌细胞测定许多研究表明：在实体肿瘤和血液恶性肿瘤患者中Treg数目增多。疗效评价、监测、下次治疗的时机仅在单核巨噬细胞
6、及DC细胞表达淋巴细胞免疫分型淋巴细胞免疫分型肿瘤细胞免疫特点肿瘤细胞免疫特点CD3CD4CD8CD4/CD8NKCIK正常正常正常正常正常正常正常正常正常正常 正常正常正常正常 正常正常 正常正常 正常正常 正常正常Th1Th2Th1Th2细胞因子分泌细胞测定细胞因子分泌细胞测定Th1Th1细胞：细胞：介导细胞免疫、细胞毒性介导细胞免疫、细胞毒性T T细胞的细胞的生长和活生长和活化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功化、巨噬细胞的活化、介导迟发型过敏反应。其功能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫能亢进将导致炎症慢性迁延，器官特异性自身免疫病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免
7、疫病病，急性排异反应和接触性皮炎等的发病和免疫病理损伤。理损伤。Th2Th2细胞细胞 ：介导体液免疫，促进介导体液免疫，促进B B细胞的生长、活化细胞的生长、活化和分化，是和分化，是IgG1IgG1和和IgEIgE类抗体的转换因子，其功能类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgEIgE综合症和综合症和嗜酸性粒细胞增多症。嗜酸性粒细胞增多症。Th1/Th2Th1/Th2漂移与肿瘤免疫漂移与肿瘤免疫肿瘤可使肿瘤可使Th1/Th2Th1/Th2平衡向平衡向Th2Th2偏移偏移,而而Th1/Th2Th1/Th2偏移又偏移又会促进肿瘤的发展会促进肿瘤的
8、发展,故探讨故探讨Th1/Th2Th1/Th2功能状况以判断功能状况以判断肿瘤患者的免疫状态可为肿瘤生物治疗提供有效的肿瘤患者的免疫状态可为肿瘤生物治疗提供有效的理论依据。理论依据。CD4+CD25+CD4+CD25+调节性调节性T T细胞细胞 调节性调节性T T细胞具有免疫抑制功能，在多种细胞具有免疫抑制功能，在多种免疫性疾病中起重要的调节作用，成为近年免疫性疾病中起重要的调节作用，成为近年来免疫学领域研究的重要内容。来免疫学领域研究的重要内容。许多研究表明：在实体肿瘤和血液恶性肿瘤患许多研究表明：在实体肿瘤和血液恶性肿瘤患者中者中TregTreg数目增多。数目增多。在乳腺癌、卵巢癌、肺癌以
9、及肝癌等多种实体在乳腺癌、卵巢癌、肺癌以及肝癌等多种实体肿瘤患者外周血和肿瘤局部微环境中肿瘤患者外周血和肿瘤局部微环境中,Treg,Treg比例增高比例增高,且数目与患者肿瘤进展程度和预后、生存率呈负相且数目与患者肿瘤进展程度和预后、生存率呈负相关。关。血液恶性肿瘤患者中血液恶性肿瘤患者中TregTreg数目呈肿瘤发展阶段数目呈肿瘤发展阶段相关性增长。但是相关性增长。但是,Treg,Treg增高的机制尚不清楚。增高的机制尚不清楚。去除去除TregTreg或封闭其抑制功能，可以增强抗肿瘤或封闭其抑制功能，可以增强抗肿瘤免疫反应。免疫反应。化疗作为一种重要的治疗肿瘤的方法化疗作为一种重要的治疗肿瘤
10、的方法,对肿瘤患对肿瘤患者外周血中的者外周血中的TregTreg数目可产生一定影响。数目可产生一定影响。化疗药物可能通过抑制肿瘤微环境中血管生成化疗药物可能通过抑制肿瘤微环境中血管生成,促进促进TregTreg凋亡凋亡,从而起到有效控制肿瘤的作用。从而起到有效控制肿瘤的作用。但也有报道证明肿瘤患者接受化疗后但也有报道证明肿瘤患者接受化疗后,外周血中外周血中TregTreg数目增多。数目增多。化疗究竟对化疗究竟对TregTreg会产生怎样的影响会产生怎样的影响,目前目前尚无定论尚无定论,有待于进一步研究。有待于进一步研究。因此因此,Treg,Treg在肿瘤治疗方面的应用成为研在肿瘤治疗方面的应用
11、成为研究的热点。如何清除或逆转究的热点。如何清除或逆转TregTreg的抑制作用的抑制作用是肿瘤免疫治疗的一个关键问题。是肿瘤免疫治疗的一个关键问题。树突状细胞树突状细胞 (DC)(DC)DCDC控制体内免疫和耐受的平衡控制体内免疫和耐受的平衡 控制控制T,B T,B 细胞对可溶性抗原的反应细胞对可溶性抗原的反应 影响产生免疫球蛋白的分类影响产生免疫球蛋白的分类 DC DC 亚群亚群 分为分为MDC MDC 和和PDC PDC MDCMDC诱导免疫应答诱导免疫应答 PDCPDC诱导免疫耐受诱导免疫耐受树突状细胞流式分析树突状细胞流式分析阴性表达抗原设门阴性表达抗原设门Lin(CD3,14,19
12、,20,56)/HLADRLin(CD3,14,19,20,56)/HLADR组合组合 DC:Lin-/HLADR+DC:Lin-/HLADR+DCDC亚群分析亚群分析 骨髓骨髓DC:CD11c+DC:CD11c+外周血外周血DC:CD123+(IL3Ra)DC:CD123+(IL3Ra)阳性表达抗原设门阳性表达抗原设门CD85k(ILT3)CD85k(ILT3)阳性设门阳性设门 仅在单核巨噬细胞及仅在单核巨噬细胞及DCDC细胞表达细胞表达 比比HLADRHLADR表达更具特异性表达更具特异性 避免阴性设门避免阴性设门Differentiation of DC subsets:Differen
13、tiation of DC subsets:外周血外周血DC:CD123+(IL3Ra)DC:CD123+(IL3Ra)骨髓骨髓DC:CD33+DC:CD33+ILT3-PEILT3-PECD14+CD16-FITCCD33-PC5CD33-PC51234骨髓骨髓DC:CD14 CD16/CD85K（ILT3）/CD33ILT3-PEILT3-PECD14+CD16-FITCCD123-PC5CD123-PC5外周外周血血DC:CD14 CD16/CD85K（ILT3）/CD123生物免疫治疗生物免疫治疗 CIKCIK细胞细胞(cytokine-induced killer)cytokine-
14、induced killer)是一群以是一群以CDCD3 3+T T细胞为细胞为主的异质性细胞群体，包括主的异质性细胞群体，包括CDCD3 3+CDCD5656-、CDCD3 3-CDCD5656+及及CDCD3 3+CDCD5656+三种亚群三种亚群,主要效应细胞为主要效应细胞为CDCD3 3+CDCD5656+细胞。细胞。CIK CIK细胞来源于外周血中的细胞来源于外周血中的CDCD4 4-CDCD8 8+及及CDCD4 4-CDCD8 8-T T细细胞。因其同时表达胞。因其同时表达CDCD3 3和和CDCD5656两种膜蛋白分子，故兼有两种膜蛋白分子，故兼有T T淋巴细胞强大的抗瘤活性和
15、淋巴细胞强大的抗瘤活性和NKNK细胞非细胞非MHCMHC限制性杀瘤特限制性杀瘤特点，是目前所知杀伤活性最强的一种免疫效应细胞。点，是目前所知杀伤活性最强的一种免疫效应细胞。CIKCIK细胞治疗过程的评价细胞治疗过程的评价治疗前病人免治疗前病人免疫状况评价疫状况评价T亚群、亚群、NK、CIK、细胞、细胞因子因子是否适合做、能否能是否适合做、能否能培养、值得做培养、值得做CIK采集MNCMNC数目、纯度、数目、纯度、T亚群、亚群、NK、CIK数目及比例数目及比例是否达到培养要求、是否达到培养要求、调节细胞数调节细胞数MNC数目、数目、T亚群、亚群、NK、CIK数目及比例、数目及比例、CD3、CD8
16、活化状况活化状况培养培养是否达标、回输培养是否达标、回输时机时机回输后T亚群、亚群、NK、CIK、细胞、细胞因子因子疗效评价、监测、下疗效评价、监测、下次治疗的时机次治疗的时机CIKCIK治疗程序治疗程序FCMFCM检测项目检测项目意义意义MNC数目、T亚群、NK、CIK数目及比例、CD3、CD8活化状况MNC数目、纯度、T亚群、NK、CIK数目及比例MNC数目、纯度、T亚群、NK、CIK数目及比例流式细胞仪概念、原理及应用Th2细胞：介导体液免疫，促进B细胞的生长、活化和分化，是IgG1和IgE类抗体的转换因子，其功能亢进将导致特异性过敏反应，参与高IgE综合症和嗜酸性粒细胞增多症。采集物评
17、价（培养体系）MNC数目、T亚群、NK、CIK数目及比例、CD3、CD8活化状况B细胞：CD19+FC500 流式细胞仪单核细胞/巨噬细胞CIK细胞来源于外周血中的CD4-CD8+及CD4-CD8-T细胞。Th1/Th2漂移与肿瘤免疫CIKCIK治疗前患者的免疫功能评价治疗前患者的免疫功能评价评价的项目评价的项目免疫功能六项：免疫功能六项：CD3CD3、CD4CD4、CD8CD8、CD4/CD8CD4/CD8、NKNK、CIK CIKTh1/Th2Th1/Th2细胞因子细胞因子 FCMFCM检测的方法检测的方法 免疫功能六项免疫功能六项 试剂：试剂：CD45/CD4/CD8/CD3CD45/C
18、D4/CD8/CD3、CD3/CD56/CD45CD3/CD56/CD45 标本类型：外周抗凝血标本类型：外周抗凝血 评价的指标：评价的指标：CD3%CD3%、CD4%CD4%、CD8%CD8%、NK%NK%、CIK%CIK%（也可以做绝对计数）（也可以做绝对计数）评价的意义评价的意义1 1、CIKCIK治疗的适应症：治疗的适应症：除外除外T T细胞相关肿瘤、有可见包块细胞相关肿瘤、有可见包块2 2、是否适合做、是否适合做3 3、能否培养、能否培养4 4、值不值得做、值不值得做肿瘤细胞免疫特点肿瘤细胞免疫特点CD3CD4CD8CD4/CD8NKCIK正常正常正常正常正常正常正常正常正常正常 正
19、常正常正常正常 正常正常 正常正常 正常正常 正常正常采集物评价（培养体系）采集物评价（培养体系）评价的项目评价的项目 MNCMNC数目、纯度、数目、纯度、T T亚群、亚群、NKNK、CIKCIK数目及比例数目及比例FCMFCM方法评价方法评价评价的意义评价的意义 是否达到培养要求、调节细胞数是否达到培养要求、调节细胞数培养中的监测培养中的监测评价的项目评价的项目1.MNC1.MNC数目、数目、T T亚群、亚群、NKNK、CIKCIK数目及比例、数目及比例、CD3CD3、CD8CD8活化状况活化状况2.2.培养体系中的细胞因子水平培养体系中的细胞因子水平3.3.CIKCIK细胞质量：坏死、凋亡状况细胞质量：坏死、凋亡状况评价方法：评价方法：FCMFCM评价的意义：评价的意义：培养是否达标、回输时机培养是否达标、回输时机确定回输时间及培养物是否达到要求确定回输时间及培养物是否达到要求:CIKCIK细胞一般在细胞一般在7-97-9天天要求要求:CD3细胞大于90%CD8细胞大于60%CIK细胞 0.51 X 109个时机选择时机选择:基本达标，CD3+HLA-DR+细胞占CD3的50%左右，CD8+HLA-DR+细胞占CD8的50%左右。回输后的监测回输后的监测谢谢观看谢谢观看谢谢观看谢谢观看
