1、流式细胞术在肿瘤学中的应用流式细胞术在肿瘤学中的应用1什么是流式细胞仪？（Flow Cytometer,FCM)在流动的状态中检测细胞各种物理及生物特征的一种仪器Injector TipSheath fluid流式细胞术在肿瘤学中的应用2流式细胞术流式细胞术在肿瘤学中的应用3流式细胞仪特点及检测标本 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析；可检测的样本种类多样(1)外周血，骨髓，细针穿刺，洗脱液，实体组织，培养细胞(2)血清、血浆、培养上清、细胞裂解液流式细胞术在肿瘤学中的应用4 细胞周期及DNA倍体分析在临床肿瘤中应用 免疫指标检测在临床肿瘤中应用 监测分析肿瘤多药耐药 细胞凋亡流式
2、细胞术在肿瘤学中的应用5流式细胞周期与流式细胞周期与DNADNA倍体分析的基本原理倍体分析的基本原理通过DNA检测进行细胞周期分析细胞周期：G0、G1、S、G2、M细胞周期中DNA含量：G0/G1-2C（二倍体）S期-2C 4C、G2/M-4C（四倍体）流式细胞术在肿瘤学中的应用6流式细胞术在肿瘤学中的应用7 DNA荧光染料特异性与细胞DNA结合 DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA所吸收荧光分子多少成正比。最常用的荧光染料：碘化丙啶（PI）FCM分析细胞周期的基本方法流式细胞术在肿瘤学中的应用8DNA含量的表示 细胞群的DNA含量在FCM中一般以DNA指数（DNA in
3、dex，DI)表示相对含量，一个正常的二倍体细胞峰，其G0/G1期细胞DNA含量为2C，DI值为1.0。DI=（样本G0/G1期细胞峰平均荧光道数）/（正常二倍体标准细胞G0/G1期细胞峰平均荧光道数）流式细胞术在肿瘤学中的应用9DNA倍体的判定标准 二倍体的DI为1.0，四倍体的DI为2.0。变异系数（CV）：标准细胞CV 3%，新鲜组织标本5%。DNA倍体判定标准，DNA非整倍体具有2个分离的G0/G1峰，并根据DI值判断DNA倍体。流式细胞术在肿瘤学中的应用10 对于一个正常人体的二倍体细胞群，G0/G1期占85-90%以上，S+G2M细胞占10-15%以下。流式细胞术在肿瘤学中的应用1
4、1流式细胞术在肿瘤学中的应用12流式细胞术在肿瘤学中的应用13流式细胞术在肿瘤学中的应用14以二倍体参考细胞G0/G1期细胞DNA含量定为2C值DI=1.0，基于标准二倍体细胞的CV在5%以下，判定标准即；DNA二倍体=2C+2CV，DNA异倍体不等于2C+2CV。1.DI=1.0 0.1(0.91.10)为二倍体。2.DI=1.0 0.15(0.851.15)为近二倍体。3.DI=2.0 0.1(1.902.10)为四倍体。4.DI 2.10为多倍体 5.其余DI均为异倍体。流式细胞术在肿瘤学中的应用15流式细胞术在肿瘤学中的应用16流式细胞术在肿瘤学中的应用17流式细胞术在肿瘤学中的应用1
5、8流式细胞术在肿瘤学中的应用19流式细胞术在肿瘤学中的应用20流式细胞周期与DNA倍体的分析方法（一）单细胞悬液制备 1、新鲜或冰冻实体组织：酶消化法、机械法、化学试剂处理法等。剪碎法：取新鲜或冰冻（浸泡于生理盐水中）实体组织0.5cm3，眼科手术剪剪碎，加入生理盐水，300目尼龙膜过滤，200g离心5min，生理盐水洗涤二次。流式细胞术在肿瘤学中的应用21 半自动机械法单细胞制备系统：是目前较为理想的方法，简便，实用，单细胞获取率较高，特别适用于临床应用。流式细胞术在肿瘤学中的应用22 由于各种实体组织成份、特性各不相同，对不同的实体组织必须采用不同的单细胞分散方法，才能使单细胞产量高，细胞
6、损伤小。流式细胞术在肿瘤学中的应用23新鲜组织单细胞悬液制备注意事项：手术或活检的新鲜组织及时浸泡于生理盐水。立即送检 冷冻或冷藏。（室温过高，放置时间过长而造成组织自溶发生，影响检测结果）流式细胞术在肿瘤学中的应用24流式细胞术在肿瘤学中的应用25流式细胞术在肿瘤学中的应用26流式细胞术在肿瘤学中的应用27流式细胞术在肿瘤学中的应用28流式细胞术在肿瘤学中的应用29流式细胞术在肿瘤学中的应用30 2、石蜡包埋组织：扩大了FCM分析应用范围，并可以对大量临床随访病例资料进行重新研究与利用。标体制备：二甲苯脱蜡法组织清洁剂脱蜡法甲酸双氧水处理法。注意事项：脱蜡完全：检验方法 加入100%乙醇，如
7、果无絮状物浮起，即可视为脱净，反之则没有脱净。掌握消化时间，避免细胞核消化掉。切片薄厚适宜，过薄碎片大多，过厚不宜脱蜡。流式细胞术在肿瘤学中的应用31流式细胞术在肿瘤学中的应用32流式细胞术在肿瘤学中的应用33流式细胞术在肿瘤学中的应用34流式细胞术在肿瘤学中的应用35 3、骨髓、血液及体液：去除红细胞及浓缩有核细胞。骨髓及血液：淋巴细胞分离液体液：一般需经300g离心5min，PBS洗涤二次。如体液中红细胞太多，可用溶血素去除红细胞。注意事项：每次同时制备对照血液淋巴细胞标本，作为二倍体细胞外参标准。视标本中有核细胞浓度的高低进行调整，一般细胞浓度调至510*109/L。流式细胞术在肿瘤学中
8、的应用36（二）DNA染色及FCM分析 1、PI染色法 应用BD公司Cycle TEST IMK Kit（1）单细胞悬液制备（2）加入A液250ul，放置10分钟。（3）加入B液200ul，放置10分钟。（4）加入冷C液200ul，避光放入2-8C冰箱10分钟。置28C冰箱避光保存，4h内FCM检测流式细胞术在肿瘤学中的应用37（5）流式细胞分析：流式细胞仪校准与设置、数据获取用Cellquest软件，SSC/FSC、FL2设置为线性放大，阈值设为FL2。收集图：FSC/SSC和FL2W/FL2A散点图、FL2-H或FL2-A荧光直方图 数据分析：ModFit软件流式细胞术在肿瘤学中的应用38
9、 流式细胞周期与DNA倍体分析在临床肿瘤学中应用流式细胞术在肿瘤学中的应用39FCM分析在肿瘤早期诊断和监别诊断中的应用流式细胞术在肿瘤学中的应用40FCM分析DNA含量和DNA倍体的预后意义 通常认为DNA含量高，非整倍体的肿瘤恶性程度高，预后差，二倍体或近二倍体肿瘤预后好。除DI及倍体外，反映肿瘤细胞增殖状态的S期细胞比例也被作为判断预后的指标。流式细胞术在肿瘤学中的应用41FCM分析在肿瘤脱落细胞学检查中的应用 FCM分析诊断肿瘤细胞的标准：(1)发现DNA非整倍体细胞峰诊断为癌。(2)如无明显的非整倍体细胞峰，但有一个突出的四倍体细胞峰和15%的超二倍体细胞（S期细胞），并伴有G0/G1峰的CV 9%，诊断为癌。(3)无明显的非整倍体细胞峰，但G0/G1峰CV值增大，并伴有10%15%超二倍体细胞和一个突出的四倍体峰，诊断为可疑癌。流式细胞术在肿瘤学中的应用42
