1、红细胞血型及相关检测主要内容ABO血型鉴定血型鉴定RhD血型鉴定血型鉴定交叉配血试验交叉配血试验红细胞抗体筛查及鉴定红细胞抗体筛查及鉴定血型鉴定和交叉配血自动分析血型鉴定和交叉配血自动分析吸收放散试验吸收放散试验教学目标 掌握掌握ABO和和Rh血型鉴定、交叉配血试验原理、方血型鉴定、交叉配血试验原理、方法和质量控制法和质量控制 熟悉红细胞不规则抗体筛查及鉴定方法熟悉红细胞不规则抗体筛查及鉴定方法 了解吸收放散试验了解吸收放散试验一、ABO血型鉴定（一）盐水介质试管法（一）盐水介质试管法（二）盐水介质玻片法（二）盐水介质玻片法（三）微柱凝胶血型定型检测卡法（三）微柱凝胶血型定型检测卡法（四）质量
2、保证：试管法、玻片法、卡式（四）质量保证：试管法、玻片法、卡式（五）方法学评价（五）方法学评价（六）临床应用（六）临床应用（七）不一致原因及解决方法（七）不一致原因及解决方法ABO血型鉴定原理血型鉴定原理正向定型：已知的特异性抗体（标准血清）检查红细胞的未知抗原正向定型：已知的特异性抗体（标准血清）检查红细胞的未知抗原反向定型：已知的血型的标准红细胞检查血清中的未知抗体反向定型：已知的血型的标准红细胞检查血清中的未知抗体A抗原抗原B抗原抗原A和和B抗原抗原无无A和和B抗原抗原抗抗A抗体抗体抗抗B抗体抗体抗抗A、抗、抗B抗体抗体无抗无抗A、抗、抗B抗体抗体ABO血型鉴定结果判断血型鉴定结果判断试
3、管法试管法试管法结果判定试管法结果判定红细胞凝集强度判断标准红细胞凝集强度判断标准瓷板法瓷板法结果判定结果判定 凝胶技术的原理凝胶技术的原理 反 应反 应室室外管壁外管壁反 应反 应室 底室 底孔孔内套内套管壁管壁凝胶或凝胶或玻璃珠玻璃珠亲和凝亲和凝胶胶试剂或试剂或盐水盐水特殊粘液特殊粘液凝胶技术的原理：凝胶技术的原理：A A、反应室：下端底孔很小，液体在孵育过程中、反应室：下端底孔很小，液体在孵育过程中不会流入下方微柱中。不会流入下方微柱中。B B、试剂或盐水层：红细胞在离心力作用下穿越、试剂或盐水层：红细胞在离心力作用下穿越该层，红细胞与反应室中的血清分离并与该层该层，红细胞与反应室中的血
4、清分离并与该层液体中的试剂反应。液体中的试剂反应。C C、粘液：亲和柱中有一层粘液，作用与、粘液：亲和柱中有一层粘液，作用与“试剂试剂或盐水层或盐水层”相同。相同。原理：凝胶分子筛和亲和效应微柱凝胶柱中填充凝胶（葡聚糖），及相应试微柱凝胶柱中填充凝胶（葡聚糖），及相应试剂（抗体或抗原）。凝胶分子间的间隙只允许游剂（抗体或抗原）。凝胶分子间的间隙只允许游离红细胞通过，分子排阻层析原则将发生凝集反离红细胞通过，分子排阻层析原则将发生凝集反应的红细胞阻滞于凝胶之内，而未凝集的游离红应的红细胞阻滞于凝胶之内，而未凝集的游离红细胞则穿过微孔运动到管底，从而判定有无凝集细胞则穿过微孔运动到管底，从而判定有
5、无凝集反应。反应。结果判定结果判定新乡医学院第三临床检验教研室微孔板法微孔板法（四）质量保证（四）质量保证l试管法试管法l标记标记l加样量、加样顺序加样量、加样顺序l溶血是一种阳性反应溶血是一种阳性反应l玻片法玻片法l标记标记l正定型正定型l显微镜阴性确认显微镜阴性确认l微柱凝胶血型定型检测卡微柱凝胶血型定型检测卡l血清标本应完全取出纤维蛋白，血浆标本建议血清标本应完全取出纤维蛋白，血浆标本建议EDTA-K2或枸橼酸盐康宁或枸橼酸盐康宁l先加红细胞悬液，再加血浆或抗体试剂先加红细胞悬液，再加血浆或抗体试剂l红细胞悬液和血浆各加红细胞悬液和血浆各加50ull按照说明书操作按照说明书操作（四）质量
6、保证（四）质量保证（五）方法学评价（五）方法学评价l试管法：常用，广泛，较玻片法灵敏，结果准确，反应时间短，试管法：常用，广泛，较玻片法灵敏，结果准确，反应时间短，结果不能保存，人为因素大结果不能保存，人为因素大l玻片法：操作简单、无需特殊仪器，适用于血型普查；灵敏度差玻片法：操作简单、无需特殊仪器，适用于血型普查；灵敏度差，反应时间长，不能用于反定型，结果不能保存，人为因素影响大，反应时间长，不能用于反定型，结果不能保存，人为因素影响大，易发生血液污染，易发生血液污染l微柱凝胶血型定型检测卡法：特异性强、灵敏度高，结果准确，微柱凝胶血型定型检测卡法：特异性强、灵敏度高，结果准确，保持时间长，
7、标本和试剂用量少，操作可以标准化、自动化，减少保持时间长，标本和试剂用量少，操作可以标准化、自动化，减少了医源性污染，但需要专门离心设备和试剂卡，成本较高了医源性污染，但需要专门离心设备和试剂卡，成本较高输血治疗的首要步骤输血治疗的首要步骤组织器官移植组织器官移植新生儿溶血病新生儿溶血病ABO正反定型的临床意义ABO正反定型不符分析基本程序首先重复试验首先重复试验重新采集献血者与受血者血液标本重新采集献血者与受血者血液标本查询受血者既往病史及输血史和用药史等查询受血者既往病史及输血史和用药史等多次洗涤标本红细胞多次洗涤标本红细胞应用抗应用抗-AB-AB、抗、抗-A-A1 1、抗、抗-H-H检测
8、红细胞检测红细胞错加试剂或标本错加试剂或标本技术和技术和操作操作受血者受血者红细胞红细胞或血清或血清ABO正反定型不一致的原因试剂失效或污染试剂失效或污染细胞与血清间细胞与血清间比例不适当比例不适当溶血现象未能识溶血现象未能识别别漏加试剂漏加试剂结果记录或判断错结果记录或判断错误误l血清异常血清异常l红细胞致敏红细胞致敏l近期输血近期输血l疾病导致抗原疾病导致抗原减弱减弱l抗体减弱抗体减弱l不规则抗体不规则抗体l年龄年龄l近期进行大量近期进行大量血浆置换治疗血浆置换治疗RhD定型及其常见问题1.Rh1.Rh定型定型RhDRhD定型，试管法最经典，多使用微柱凝胶卡定型，试管法最经典，多使用微柱凝
9、胶卡2.2.RhD阴性确认阴性确认IgM抗抗-D阴性阴性三个厂家三个厂家IgGIgG抗抗-D进行进行确认确认l抗人球蛋白法进行确认抗人球蛋白法进行确认l三种三种IgG抗抗-D试剂均为阴性，报试剂均为阴性，报RhD阴性阴性l一种或一种以上一种或一种以上IgG抗抗-D试剂为阳性，报弱试剂为阳性，报弱D概念：检测受血者和供血者血液中是否含有不相概念：检测受血者和供血者血液中是否含有不相配合的成分，是输血前确保受血者输血安全必不配合的成分，是输血前确保受血者输血安全必不可少的试验可少的试验包括：主侧配血和次侧配血包括：主侧配血和次侧配血主侧是受血者血清与供血者红细胞相配的一侧主侧是受血者血清与供血者红
10、细胞相配的一侧次侧是受血者红细胞与供血者血清相配的一侧。次侧是受血者红细胞与供血者血清相配的一侧。三、交叉配血试验交叉配血的主次侧交叉配血的主次侧（一）盐水介质交叉配血试验 本质凝集反应，直接凝集试验本质凝集反应，直接凝集试验 检测检测IgMIgM类抗体类抗体 方法：试管法方法：试管法 ABOABO同型配血，主侧和次侧均无凝集及溶血，表示同型配血，主侧和次侧均无凝集及溶血，表示无输血禁忌，可以输血无输血禁忌，可以输血盐水介质配血方法患患者者献献血血者者主主侧侧次次侧侧（二）抗球蛋白介质交叉配血试验抗人球蛋白试验：又称抗人球蛋白试验：又称CoombsCoombs试验，是一种检试验，是一种检查不完
11、全抗体的敏感方法查不完全抗体的敏感方法分类：直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验分类：直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验抗球蛋白试验原理抗球蛋白试验原理 CoombsCoombs利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体，使红细胞与红细胞表面抗原结合的特异抗体，使红细胞凝集。凝集。直接试验：是检查被检红细胞上有无不完全抗直接试验：是检查被检红细胞上有无不完全抗体体 间接试验：是检查血清中游离的不完全抗体间接试验：是检查血清中游离的不完全抗体 直接直接Coombs试验试验抗人免疫球蛋白自身抗体间接间接Coombs试验试验抗人免疫球蛋白同种异型
12、抗体2不完全抗体可以结合在红细胞表面,但是不能和两个红细胞同时结合（致敏）。3加入抗人球蛋白1红细胞彼此之间有一定的间距4抗人球蛋白可以同时和两个不完全抗体的FC段结合，从而把红细胞连接在一起抗人球蛋白交叉配血法示意图抗人球蛋白交叉配血法示意图抗球蛋白配血方法抗球蛋白方法配血方法结果判读结果判读 直接抗球蛋白试验直接抗球蛋白试验 阳性对照管阳性对照管凝集凝集，阴性阴性对照管对照管不凝集不凝集，被检管被检管凝集，判定为阳性凝集，判定为阳性 阳性对照阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，管凝集，阴性对照管不凝集，被检管被检管不凝集，需要做阴性确认后判定结果不凝集，需要做阴性确认后判定结果（无凝集（无凝
13、集的被检管中加入的被检管中加入IgG抗抗-D致敏红细胞后离心，致敏红细胞后离心，出现凝集判阴性，否则重新试验出现凝集判阴性，否则重新试验 阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管凝集，阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管凝集，结果不可信不发报告，分析原因重做结果不可信不发报告，分析原因重做 间接抗球蛋白试验间接抗球蛋白试验 阳性对照管呈现阳性对照管呈现凝集凝集反应，反应，阴性阴性对照管对照管未呈现凝集未呈现凝集反反应，应，被检管呈现凝集反应被检管呈现凝集反应为阳性结果，被检者血清内为阳性结果，被检者血清内含有抗体，如果自身对照无凝集，同种抗体；如果含有抗体，如果自身对照无凝集，同种抗体；如果被被检者结
14、果阴性检者结果阴性，被检者血清中未被查出意外抗体。，被检者血清中未被查出意外抗体。阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管出现凝集，实阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管出现凝集，实验失败。验失败。结果判读结果判读抗球蛋白试剂不纯抗球蛋白试剂不纯假阳性假阳性假阴性假阴性红细胞洗涤已凝集红细胞洗涤已凝集红细胞质量红细胞质量不抗凝标本不抗凝标本漏加试剂漏加试剂l红细胞、血清红细胞、血清及试剂质量及试剂质量l洗涤不充分洗涤不充分l操作过程不连操作过程不连续续l离心过度离心过度l红细胞过多或红细胞过多或过少过少l血清浓度过大血清浓度过大l孵育时间和温孵育时间和温度不当度不当l前带现象前带现象间接抗球蛋白试验间
15、接抗球蛋白试验盐水保存不当盐水保存不当红细胞直抗阳性红细胞直抗阳性（三）（三）低离子聚凝胺介质交叉配血试验低离子聚凝胺介质交叉配血试验 是一种快速、简便、红细胞不完全抗体的方法是一种快速、简便、红细胞不完全抗体的方法多数多数IgGIgG抗体能够被检出，但抗体能够被检出，但IgGIgG抗抗-K-K抗体除外抗体除外汉族至今未发现汉族至今未发现K K抗原阳性，也未检出抗抗原阳性，也未检出抗-K-K抗体抗体聚凝胺介质试验技术聚凝胺介质试验技术 红细胞表面带有大量的负电荷，悬浮在电红细胞表面带有大量的负电荷，悬浮在电解质溶液中，会吸引大量阳离子，红细胞解质溶液中，会吸引大量阳离子，红细胞则被扩散的双层离
16、子云所围绕，形成则被扩散的双层离子云所围绕，形成zeta电电位。位。红细胞表面电荷及其相互之间的距离红细胞表面电荷及其相互之间的距离红细胞 表面负电荷 内层正电荷 随红细胞移动 自由移动的 正电荷 红细胞间由静电维 持最小距离约24nm 原理 聚凝胺技术首先利用低离子溶液（聚凝胺技术首先利用低离子溶液（LIM）降）降低介质的离子强度，减少红细胞周围的电低介质的离子强度，减少红细胞周围的电子云子云 再加入聚凝胺溶液，溶解后产生很多正电再加入聚凝胺溶液，溶解后产生很多正电荷，中和红细胞表面带有的负电荷，红细荷，中和红细胞表面带有的负电荷，红细胞胞zeta电位降低，缩短红细胞距离，产生非电位降低，缩
17、短红细胞距离，产生非特异性聚集特异性聚集 最后加入悬浮液，具有中和聚凝胺阳离子最后加入悬浮液，具有中和聚凝胺阳离子的作用，使正常红细胞的非特异性凝集散的作用，使正常红细胞的非特异性凝集散开，特异性凝集仍然存在开，特异性凝集仍然存在1红细胞间有一定间距2 2 加入聚凝胺后，可以加入聚凝胺后，可以缩短红细胞之间的距离，缩短红细胞之间的距离，使其非特异性凝集使其非特异性凝集3 3 加入枸橼酸钠，可加入枸橼酸钠，可以中和聚凝胺以中和聚凝胺4 4 红细胞的非特异性红细胞的非特异性凝集消失凝集消失聚凝胺聚凝胺枸橼酸钠枸橼酸钠1红细胞上已有不完全抗体致敏2 2 加入聚凝胺后，缩短红加入聚凝胺后，缩短红细胞之
18、间的距离，让不完细胞之间的距离，让不完全抗体可以同时与两个红全抗体可以同时与两个红细胞结合使其特异性凝集细胞结合使其特异性凝集3 3 加入枸橼酸钠中和聚凝胺加入枸橼酸钠中和聚凝胺4由于不完全抗体的由于不完全抗体的结合，红细胞的特异结合，红细胞的特异性凝集不消失性凝集不消失聚凝胺聚凝胺枸橼酸钠枸橼酸钠不完全抗体不完全抗体聚凝胺(Polybrene)配血方法聚凝胺(Polybrene)配血方法注意事项注意事项 不能使用含枸橼酸钠和肝素抗凝标本不能使用含枸橼酸钠和肝素抗凝标本 按比例加样，非特异凝集按比例加样，非特异凝集6060秒内观察结果秒内观察结果 出现不配合试验时，抗球蛋白重复，结果不一致出现
19、不配合试验时，抗球蛋白重复，结果不一致时以抗球蛋白试验结果为准时以抗球蛋白试验结果为准 一般使用血清一般使用血清 对对KellKell系统检测不理想系统检测不理想 按照说明书按照说明书方法学评价u盐水介质法：适用于盐水介质法：适用于ABOABO血型交叉配血，操作简单、血型交叉配血，操作简单、快速，不能检出不相配合的快速，不能检出不相配合的IgGIgG类抗体类抗体u抗球蛋白试验：结果准确，检测不完全抗体最可靠抗球蛋白试验：结果准确，检测不完全抗体最可靠的方法，操作繁琐费事，试剂较贵的方法，操作繁琐费事，试剂较贵u低离子聚凝胺介质法：应用广泛、快速、准确，可低离子聚凝胺介质法：应用广泛、快速、准确
20、，可检测检测IgMIgM、IgGIgG类抗体，需特殊试剂，操作复杂。类抗体，需特殊试剂，操作复杂。临床应用u可以发现ABO血型鉴定的错误，如A亚型u发现亚型配血不合的情况u发现其他血型抗体或不规则抗体四、红细胞抗体筛查与鉴定临床输血技术规范临床输血技术规范 第四章第第四章第1717条：条：“凡遇以下情况必须按凡遇以下情况必须按全国临床全国临床检验操作规程检验操作规程有关规定做抗体筛选试验：有关规定做抗体筛选试验：1.1.交交叉配血不合的；叉配血不合的；2.2.对有输血史、妊娠史或短期内对有输血史、妊娠史或短期内需接受多次输血者需接受多次输血者为什么要开展输血前的为什么要开展输血前的“抗体筛选抗
21、体筛选”检检查查 1.目前已知红细胞有目前已知红细胞有3030个血型系统个血型系统（近300个抗原）。红细胞抗原的多样性决定了抗体的多样性，检测抗A、抗B、抗D（ABO血型、Rh血型）可确保绝大多数病人的输血安全，但仍不能避免因血型不合（ABO、Rh血型以外）而引发的溶血。2.2.临床有的病人出现慢性（迟缓性）溶血反应，易忽视或引不起临床有的病人出现慢性（迟缓性）溶血反应，易忽视或引不起临床医师视。临床医师视。（理论上讲，成年人每输（理论上讲，成年人每输1U1U的浓缩红细胞，在不丢失、不被破的浓缩红细胞，在不丢失、不被破坏（溶血）的前提下，应能提升坏（溶血）的前提下，应能提升Hb5-10g/L
22、(0.5-1g/dl),Hb5-10g/L(0.5-1g/dl),保持保持15-3015-30天。如果输天。如果输3-4U RBC3-4U RBC，病人，病人HbHb上升不到上升不到10g/L10g/L，或几天后，或几天后（1 1周内）周内）HbHb仍旧下降到原来水平，甚至更低。这种情况，就要仍旧下降到原来水平，甚至更低。这种情况，就要考虑是否有慢性溶血反应存在。）考虑是否有慢性溶血反应存在。）3.3.利于早期发现和确认具有临床意义的抗体，充足的时间来选择利于早期发现和确认具有临床意义的抗体，充足的时间来选择相配合的血，避免患者病情的延误。相配合的血，避免患者病情的延误。什么叫什么叫“不规则抗
23、体筛查不规则抗体筛查”检查？检查？1.1.不规则抗体的含义：除不规则抗体的含义：除ABOABO系统外，其它系统产生的系统外，其它系统产生的抗不符合抗不符合LandsteinerLandsteiner规则规则，称为不规则抗体或意外抗体，称为不规则抗体或意外抗体称为不规则抗体。如抗称为不规则抗体。如抗D D、抗、抗N N、抗、抗M M、jk-jk-抗体。抗体。2.“2.“不规则抗体筛查不规则抗体筛查”的含义：用具备有临床意义的的含义：用具备有临床意义的血型抗原的血型抗原的O O型红细胞，检测病人血清（含多种抗体）；型红细胞，检测病人血清（含多种抗体）；如果出现聚集现象，则提示病人有不规则抗体存在，
24、如果出现聚集现象，则提示病人有不规则抗体存在，可判为可判为“抗体筛选抗体筛选”阳性。阳性。患者血清患者血清+试剂筛选红细胞试剂筛选红细胞 盐水介质盐水介质 聚凝胺介质聚凝胺介质 抗人球蛋白介质抗人球蛋白介质 酶介质法酶介质法筛选细胞要求筛选细胞要求 抗体筛选用红细胞悬液（抗体筛选用红细胞悬液（1#1#、2#2#、3#3#）试剂红细胞必须含有下列抗原：试剂红细胞必须含有下列抗原：D,C,E,c,e,M,N,S,s,P1,Lea,Leb,K,k,Fya,Fyb,D,C,E,c,e,M,N,S,s,P1,Lea,Leb,K,k,Fya,Fyb,Jka,Jka,和和JkbJkb，所选用的，所选用的2-
25、32-3个个O O型红细胞的抗原型红细胞的抗原还应是互补的，纯合子基因所表达的抗原更有还应是互补的，纯合子基因所表达的抗原更有利于相应抗体的检出利于相应抗体的检出不规则抗体鉴定 不规则抗体筛查阳性后，进行抗体鉴定，明确抗体的类别 谱细胞与待检者血清反应，反应格局，抗体的特异性 谱细胞由广泛挑选并已详细检测血型抗原的8-16人份O型红细胞组成 一套谱细胞不可能对所有不规则抗体都进行鉴定的，鉴定困难时，更换厂商提供的谱细胞六、吸收放散试验 乙醚放散法乙醚放散法试试 验验 原原 理理操操 作作 步步 骤骤注注 意意 事事 项项临临 床床 应应 用用吸收试验吸收试验放散试验放散试验试试 验验 原原 理
26、理试试 剂剂操操 作作 步步 骤骤注注 意意 事事 项项临临 床床 应应 用用 加热放散法加热放散法试试 验验 原原 理理操操 作作 步步 骤骤注注 意意 事事 项项临临 床床 应应 用用吸收试验原理待待检检红红细细胞胞已知已知效价效价的抗的抗A或或抗抗B血清血清吸收液吸收液已知抗原已知抗原的红细胞的红细胞滴定滴定比较吸收比较吸收前后血清中前后血清中抗体效价抗体效价红细胞上红细胞上有无相应有无相应抗原及其抗原及其强度强度间接判定待检间接判定待检红细胞血型红细胞血型及其亚型种类及其亚型种类热放散试验原理 待检待检红细胞红细胞分分型血型血清清物理条件物理条件的改变的改变（加热）（加热）抗体抗体待检
27、待检红细胞红细胞试试 剂剂红细胞红细胞确定抗体的确定抗体的种类和强度种类和强度判定待检判定待检红细胞上抗红细胞上抗原的型别原的型别放散放散凝集或凝集或致敏致敏乙醚放散试验实验原理受检者受检者血血 清清已知已知抗原抗原的红的红细胞细胞致敏致敏已致敏已致敏红细胞红细胞乙醚乙醚放散液放散液除去乙醚除去乙醚后鉴定后鉴定抗体抗体小结u 输血前免疫血液学检查输血前免疫血液学检查ABO、Rh血型定型、抗体筛查与鉴定、交叉配血血型定型、抗体筛查与鉴定、交叉配血u 输血前免疫血液学检查检测技术输血前免疫血液学检查检测技术盐水法、抗球蛋白法、聚凝胺介质法、微柱凝胶介质盐水法、抗球蛋白法、聚凝胺介质法、微柱凝胶介质
28、u 吸收放散吸收放散小测试1.1.检测不完全抗体的最好方法：检测不完全抗体的最好方法：A.A.酶介质法酶介质法 B.B.低离子强度溶液试验低离子强度溶液试验 C.C.凝聚胺试验凝聚胺试验 D.D.人源盐水介质试验人源盐水介质试验 E.E.抗人球蛋白试验抗人球蛋白试验2.2.聚凝胺法对大多数血型系统敏感度高且操作简便快速，聚凝胺法对大多数血型系统敏感度高且操作简便快速，但应除外但应除外:A.KellA.Kell系统系统 B.RhB.Rh系统系统 C.KiddC.Kidd系统系统 D.ABOD.ABO系统系统 E.LewisE.Lewis系统系统3.3.直抗试验中使用的阳性对照细胞可以是：直抗试验
29、中使用的阳性对照细胞可以是：A.A.IgGIgG抗体致敏红细胞抗体致敏红细胞 B.RhB.Rh阳性红细胞阳性红细胞 C.C.酶处理红细胞酶处理红细胞 D.IgMD.IgM抗体致敏红细胞抗体致敏红细胞 E.RhE.Rh阴性红细胞阴性红细胞 4.交叉配血的主要目的是交叉配血的主要目的是:A.A.验证血型鉴定是否正确验证血型鉴定是否正确 B.B.可防止张冠李戴可防止张冠李戴 C.C.验证标准血清是否有误验证标准血清是否有误 D.D.防止输血后产生溶血反防止输血后产生溶血反E.E.发现其他血型抗体发现其他血型抗体思考题uABO血型鉴定的方法有哪些？正反定型结果不一致的原因有哪些？如何解决？u交叉配血试验的方法有哪些，各方法的原理是什么？如何选择和评价？下次课内容u第三节白细胞抗原系统u第四节血小板血型系统u第五节采供血机构及成分血制备
