1、华中农业大学动物科技学院华中农业大学动物科技学院实验一实验一 哺乳动物白细胞分离哺乳动物白细胞分离 左左 波、柴波、柴 进进 了解哺乳动物白细胞分离原理了解哺乳动物白细胞分离原理 掌握兔及猪白细胞分离方法掌握兔及猪白细胞分离方法 明确畜禽血液细胞组成差异明确畜禽血液细胞组成差异一、实验目的一、实验目的二、实验原理二、实验原理真核基因组真核基因组DNA存在于细胞核的染色质中存在于细胞核的染色质中血液血液新鲜组织新鲜组织福尔马林浸泡标本福尔马林浸泡标本石蜡标本石蜡标本冰冻组织冰冻组织毛发毛发体腔液体腔液洗嗽液洗嗽液精液精液1 1 常用于常用于DNADNA提取的材料：提取的材料：血液血液 血血 浆（
2、浆（50-60%）晶体物质晶体物质 2-3%水份水份 90-92%血浆蛋白血浆蛋白 5-8%血细胞（血细胞（40-50%）红细胞红细胞 白细胞白细胞 血小板血小板 2 血液组成血液组成 红细胞红细胞 又称红血球或红血细胞，是血液中最又称红血球或红血细胞，是血液中最多的一种血细胞。红细胞中含有血红多的一种血细胞。红细胞中含有血红蛋白，因而使血液呈红色。蛋白，因而使血液呈红色。人和哺乳动物的成熟红细胞无细胞核人和哺乳动物的成熟红细胞无细胞核白细胞白细胞 白细胞无色呈球形，白细胞无色呈球形，有细胞核有细胞核，体积比红细胞大，体积比红细胞大光镜下，根据白细胞胞质有无光镜下，根据白细胞胞质有无特殊颗粒，
3、可将其分为有粒白特殊颗粒，可将其分为有粒白细胞和无粒白细胞。有粒白细细胞和无粒白细胞。有粒白细胞又根据颗粒的嗜色性，分为胞又根据颗粒的嗜色性，分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有嗜碱性粒细胞。无粒白细胞有单核细胞和淋巴细胞两种单核细胞和淋巴细胞两种白白细细胞胞有粒有粒嗜酸性粒细胞嗜酸性粒细胞中性粒细胞中性粒细胞嗜碱性粒细胞嗜碱性粒细胞无粒无粒单核细胞单核细胞淋巴细胞淋巴细胞血小板血小板 也称血栓细胞，是体内最小的血细胞，是由骨也称血栓细胞，是体内最小的血细胞，是由骨髓中成熟的巨核细胞裂解、胞质脱落而成，呈髓中成熟的巨核细胞裂解、胞质脱落而成，呈圆形
4、、椭圆或不规则的形状，圆形、椭圆或不规则的形状，无细胞核无细胞核。但它并非只是细胞碎片，它有一定的结构，能但它并非只是细胞碎片，它有一定的结构，能进行新陈代谢。进行新陈代谢。血小板的功能主要是促进止血和加速凝血血小板的功能主要是促进止血和加速凝血 血小板遇到粗糙的血小板遇到粗糙的血管壁伤口，就被血管壁伤口，就被破坏并释放出促使破坏并释放出促使血液凝固的凝血酶。血液凝固的凝血酶。这种酶的前身是凝这种酶的前身是凝血酶原，在血酶原，在Ca2+参参与下，凝血酶原激与下，凝血酶原激活物可催化凝血酶活物可催化凝血酶原转化为具有活性原转化为具有活性的凝血酶。的凝血酶。在凝血酶、在凝血酶、Ca2+和和其它一些
5、因子的作其它一些因子的作用下，经过一系列用下，经过一系列变化，变化，可溶性的纤可溶性的纤维蛋白原就变成了维蛋白原就变成了不溶性的丝状纤维不溶性的丝状纤维蛋白蛋白。这种蛋白形。这种蛋白形成后，互相交织成成后，互相交织成网，并把血细胞网网，并把血细胞网罗在内，使原来的罗在内，使原来的血液凝集成块。血液凝集成块。3 抗凝抗凝可通过以下几种途径来实现：可通过以下几种途径来实现：（1）往血液中加入适量的抗凝剂（如柠檬酸钠）往血液中加入适量的抗凝剂（如柠檬酸钠）将将Ca2+夺去，使其成为夺去，使其成为失钙血失钙血，这样可以防，这样可以防止纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而避免了血止纤维蛋白原变成纤维蛋白，从而避
6、免了血液凝固。液凝固。（2）用试管刷反复搅拌，取出血液中的纤维蛋白，）用试管刷反复搅拌，取出血液中的纤维蛋白，这种血叫这种血叫去纤维蛋白血去纤维蛋白血。由于缺少了凝血必需。由于缺少了凝血必需物质（纤维蛋白），所以血液不再凝固。物质（纤维蛋白），所以血液不再凝固。（3）降低血液温度，使酶的活性降低）降低血液温度，使酶的活性降低。（4）保护血小板，减少凝血酶的释放。）保护血小板，减少凝血酶的释放。抗凝剂抗凝剂（1）乙二胺四乙酸（）乙二胺四乙酸（EDTA）盐，）盐，EDTA有二钠、有二钠、二钾和三钾盐。均可与钙离子形成螯合物，从二钾和三钾盐。均可与钙离子形成螯合物，从而阻止血液凝固。而阻止血液凝固。
7、Na2C10H14O8N2+Ca2+CaC10H12O8N2+2Na+2H+适用于全血细胞分析及血细胞比容测定。适用于全血细胞分析及血细胞比容测定。（2）柠檬酸钠（）柠檬酸钠（trisodium citrate），柠檬酸盐可与血），柠檬酸盐可与血中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固中钙离子形成可溶性螯合物，从而阻止血液凝固2Na3C6H5O7+2Ca2+2CaC6H5O7+6Na+适用于红细胞沉降率和凝血功能测定。适用于红细胞沉降率和凝血功能测定。（3）草酸钠（）草酸钠（sodium oxalate），草酸盐可与血中），草酸盐可与血中钙离子生成草酸钙沉淀，从而阻止血液凝固。钙离子生成草酸
8、钙沉淀，从而阻止血液凝固。适用于一般普通生化检查适用于一般普通生化检查（4）肝素（）肝素（heparin），肝素的阴离子活性基团与抗），肝素的阴离子活性基团与抗凝血酶凝血酶III（AT-III）的阳离子基团结合，）的阳离子基团结合，加速加速抗凝血酶抗凝血酶-凝血酶复合体形成凝血酶复合体形成，灭活丝氨酸蛋白，灭活丝氨酸蛋白酶，从而阻止凝血酶形成，拮抗凝血酶和阻止酶，从而阻止凝血酶形成，拮抗凝血酶和阻止血小板聚集。此外肝素还有血小板聚集。此外肝素还有催化抑制凝血因子催化抑制凝血因子的作用。适用于血流变检查的作用。适用于血流变检查从血管取少量血液加从血管取少量血液加入适量抗凝剂入适量抗凝剂,有形成有
9、形成分经自然沉降或离心分经自然沉降或离心沉淀后，血液可分出沉淀后，血液可分出三层：上层为淡黄色三层：上层为淡黄色的血浆，下层为红细的血浆，下层为红细胞，中间的薄层为白胞，中间的薄层为白细胞和血小板细胞和血小板 4 白细胞分离白细胞分离5 5 细胞破碎细胞破碎方法方法技术技术原理原理效果效果成本成本举例举例化化学学法法渗透冲击渗透冲击渗透压破坏细胞渗透压破坏细胞温和温和便宜便宜溶血溶血酶消化法酶消化法细胞壁被消化，细胞壁被消化，使细胞破碎使细胞破碎温和温和昂贵昂贵增溶法增溶法表面活性剂溶解表面活性剂溶解细胞壁细胞壁温和温和适中适中胆盐作用于胆盐作用于大肠杆菌大肠杆菌脂溶法脂溶法有机溶剂溶解细有机
10、溶剂溶解细胞壁并使之失稳胞壁并使之失稳适中适中便宜便宜甲苯破碎酵甲苯破碎酵母细胞母细胞碱处理法碱处理法碱的皂化作用使碱的皂化作用使细胞壁融解细胞壁融解剧烈剧烈便宜便宜方法方法技术技术原理原理效果效果成本成本举例举例机机械械法法匀浆法匀浆法（片型）（片型）细胞被搅拌器劈碎细胞被搅拌器劈碎 适中适中适中适中动物组织及动动物组织及动物细胞物细胞研磨法研磨法细胞被研磨物磨碎细胞被研磨物磨碎 适中适中便宜便宜超声波法超声波法用超声波的空穴作用超声波的空穴作用使细胞破碎用使细胞破碎适中适中昂贵昂贵细胞悬浮液小细胞悬浮液小规模处理规模处理匀浆法匀浆法（孔型）（孔型）须使细胞通过的小须使细胞通过的小孔，使细胞
11、受到剪孔，使细胞受到剪切力而破碎切力而破碎剧烈剧烈适中适中细胞悬浮液大细胞悬浮液大规模处理规模处理珠磨破碎珠磨破碎法法细胞被玻璃珠或铁细胞被玻璃珠或铁珠捣碎珠捣碎剧烈剧烈便宜便宜细胞悬浮液和细胞悬浮液和植物细胞的大植物细胞的大规模处理规模处理渗透冲击法（渗透冲击法（Osmotic Shock）此法将一定体积的细胞液加到此法将一定体积的细胞液加到2倍体积倍体积的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进的水中，细胞中溶质浓度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。在血浆中无机盐形成的渗透压称为晶体渗透压在血浆中无机盐形成的渗透压称为晶体渗透压由血浆蛋白形成的渗透压称
12、为胶体渗透压由血浆蛋白形成的渗透压称为胶体渗透压血浆渗透压的总值为两者之和。血浆渗透压的总值为两者之和。红细胞在此溶液中大小、形状不变，故称为红细胞在此溶液中大小、形状不变，故称为生理盐水生理盐水原理原理0.9%氯化钠溶液的渗透压与血浆渗透压相等氯化钠溶液的渗透压与血浆渗透压相等血液中去除血细胞后余下部分就是血浆。血液中去除血细胞后余下部分就是血浆。将正常红细胞悬浮于不同浓度的将正常红细胞悬浮于不同浓度的NaCl溶液中即可溶液中即可看到：在等渗溶液中的红细胞保持正常大小和双凹看到：在等渗溶液中的红细胞保持正常大小和双凹圆碟形；在渗透压递减的一系列溶液中，红细胞逐圆碟形；在渗透压递减的一系列溶液
13、中，红细胞逐步胀大并双侧凸起，当体积增加步胀大并双侧凸起，当体积增加30%时成为球形；时成为球形；体积增加体积增加45%60%则细胞膜损伤而发生溶血。则细胞膜损伤而发生溶血。红细胞在低渗溶液中会胀大，破裂，发生溶血，红细胞在低渗溶液中会胀大，破裂，发生溶血，故低渗溶液不能用作静脉输液。故低渗溶液不能用作静脉输液。高于或低于血浆渗透压的则相应地称为高渗或低高于或低于血浆渗透压的则相应地称为高渗或低渗溶液。渗溶液。细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容细胞破碎的难易决定于其类型，红血球细胞容易溶破，动物组织细胞只有当其组织被机械切易溶破，动物组织细胞只有当其组织被机械切碎或匀浆后才易溶破。植物细
14、胞很难溶破，因碎或匀浆后才易溶破。植物细胞很难溶破，因为植物细胞中含有大量的木质成分。为植物细胞中含有大量的木质成分。三、主要仪器及试材三、主要仪器及试材实验器材：实验器材：一次性注射器，长针头，一次性注射器，长针头，10ml离心离心管，记号笔，酒精棉球，离心机，管，记号笔，酒精棉球，离心机，一次性手套等一次性手套等试试 剂剂：蒸馏水，抗凝剂（蒸馏水，抗凝剂（0.5M EDTA溶溶液、或肝素）等。液、或肝素）等。四、实验方法与步骤四、实验方法与步骤采血采血5ml左右，左右，EDTA抗凝抗凝 3000rpm离心离心15min，弃上层血浆，弃上层血浆 加入加入2倍体积双蒸水，摇匀沉淀，静置倍体积双
15、蒸水，摇匀沉淀，静置10-15min，破碎红细胞，破碎红细胞 3000rpm离心离心15min，轻轻弃去上层，留白细胞沉淀，轻轻弃去上层，留白细胞沉淀（视红细胞破碎程度，决定是否重复此步骤（视红细胞破碎程度，决定是否重复此步骤1次）次）五、实验注意事项五、实验注意事项（2）采血后，应立即（或提前）加入）采血后，应立即（或提前）加入1/10血样体血样体积的积的0.5M EDTA抗凝剂，充分混匀，低温抗凝剂，充分混匀，低温保存或立即送实验室分离白细胞；保存或立即送实验室分离白细胞；（1）防止污染血液及被血液所带的病菌等感染）防止污染血液及被血液所带的病菌等感染（3）分离白细胞时，离心速度不宜过大。）分离白细胞时，离心速度不宜过大。六、实验结果处理六、实验结果处理提交提交“哺乳动物白细胞分离哺乳动物白细胞分离”实验报实验报告（统一格式纸张）告（统一格式纸张）实验目的实验目的 实验原理实验原理 实验器材实验器材 实验方法与步骤实验方法与步骤 实验结果与分析实验结果与分析 思考题思考题七、思考题七、思考题（1）畜禽血液有核细胞构成的差别；）畜禽血液有核细胞构成的差别；（2）EDTA抗凝机制；抗凝机制；（3）渗透冲击法破碎细胞原理。）渗透冲击法破碎细胞原理。
