1、18 培养基的灭菌培养基的灭菌及灭菌设备及灭菌设备 培养基灭菌及灭菌设备培养基灭菌及灭菌设备染菌染菌/噬菌体的主要危害噬菌体的主要危害:n基质及产物消耗基质及产物消耗,生产能力下降生产能力下降n产物得率降低产物得率降低,产品质量下降产品质量下降n生产失败生产失败(分解产物分解产物,分解菌体分解菌体,异常发酵异常发酵)纯种培养的具体措施纯种培养的具体措施n使用灭菌的培养基和设备使用灭菌的培养基和设备n空气除菌空气除菌n设备严密设备严密,保持正压保持正压n补料灭菌补料灭菌n种子无污染种子无污染第一节第一节 灭菌的方法灭菌的方法(261)n灭菌（灭菌（Sterilization）：）：使用物理或化学
2、使用物理或化学的方法杀灭或去除物料或设备中一切有的方法杀灭或去除物料或设备中一切有生命物质的过程。生命物质的过程。灭菌常用方法n化学药剂灭菌n射线灭菌紫外、电离射线；n干热灭菌微生物由于氧化作用、蛋白质变性、电解质浓缩作用死亡；n湿热灭菌利用饱和蒸汽进行灭菌，使蛋白质、酶、核酸分子内部化学键破坏，不可逆变性死亡；n过滤除菌利用过滤的方法阻留微生物第二节第二节 培养基的灭菌培养基的灭菌(p262)一、热灭菌的原理一、热灭菌的原理 1.微生物的热阻微生物的热阻n热灭菌原理：热灭菌原理：温度超过微生物最适生长温度的温度超过微生物最适生长温度的 上限时，细胞中的蛋白会发生不可逆的凝固变上限时，细胞中的
3、蛋白会发生不可逆的凝固变性，引起微生物死亡。性，引起微生物死亡。n致死温度：杀死微生物的极限温度。致死温度：杀死微生物的极限温度。n致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所致死时间：在致死温度下杀死全部微生物所 需要的时间需要的时间n热阻热阻：指微生物在某一特定条件下（主要指温度：指微生物在某一特定条件下（主要指温度和加热方式）的致死时间。表示微生物对热的抵和加热方式）的致死时间。表示微生物对热的抵抗能力。抗能力。n相对热阻相对热阻：指某一微生物在某一条件下的致死时：指某一微生物在某一条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。间与另一微生物在相同条件下的致死时间之比。2.对数残留定
4、律对数残留定律 n内容内容:对微生物进行湿热灭菌时对微生物进行湿热灭菌时,培养基培养基中的微生物受热死亡的速率与残存的微中的微生物受热死亡的速率与残存的微生物数量成正比生物数量成正比.-dN/d=N N培养基中活的微生物个数培养基中活的微生物个数 灭菌时间（灭菌时间（s）；）；比死亡速率（比死亡速率（s-1）；dN/d微生物的瞬时变化率，即死亡速率微生物的瞬时变化率，即死亡速率 n=2.303/log(N0/N)灭菌时间取决于灭菌时间取决于污染程度污染程度,灭菌程度灭菌程度和和.注意：注意：N不能为，常采用千分之一（不能为，常采用千分之一（0.001)关于比死亡速率关于比死亡速率 n是微生物耐
5、热性的一种特征，与微生物的是微生物耐热性的一种特征，与微生物的种种类类和和灭菌温度灭菌温度有关。有关。n相同温度，相同温度，越小，越耐热。越小，越耐热。同一种微生物在不同灭菌温度下同一种微生物在不同灭菌温度下值不同。值不同。灭菌温度越低，灭菌温度越低，越小。越小。n培养基灭菌前含微生物种类多，培养基灭菌前含微生物种类多，值不同值不同,可取可取耐热芽孢杆菌耐热芽孢杆菌的的值进行灭菌时间计值进行灭菌时间计算算n微生物的耐热性还可用微生物的数目减微生物的耐热性还可用微生物的数目减少为原来的少为原来的1/10时所需的时间时所需的时间D表示。表示。ln（1/10）=-DD=2.303/二二.培养基灭菌温
6、度的选择培养基灭菌温度的选择 n灭菌过程伴随培养基中营养成分的破坏灭菌过程伴随培养基中营养成分的破坏n培养基营养成分破坏属于分解反应培养基营养成分破坏属于分解反应,可看可看作化学动力学中一级反应作化学动力学中一级反应dC/d=-C=Aexp(-E/RT)n杀灭微生物的杀灭微生物的高于维生素分解的高于维生素分解的，因此，在任何温度下，杀灭微生物，因此，在任何温度下，杀灭微生物所需要的时间比培养基成分分解的时间所需要的时间比培养基成分分解的时间长长ln(2/1)/ln(2/1)=E/E因为因为EE,所以所以ln(2/1)ln(2/1)n即灭菌温度上升时，灭菌的速度常数即灭菌温度上升时，灭菌的速度常
7、数的增加倍数的增加倍数培养基成分破坏的速度常数培养基成分破坏的速度常数的增加倍数。微生物杀灭速度大于培养的增加倍数。微生物杀灭速度大于培养基成分破坏的速度。基成分破坏的速度。n所以，培养基灭菌采用所以，培养基灭菌采用高温短时高温短时的方的方法。法。三三.影响培养基灭菌的因素影响培养基灭菌的因素 1.培养基成分的影响培养基成分的影响油脂油脂糖类糖类蛋白蛋白:增加微生物耐热性增加微生物耐热性高浓度盐类高浓度盐类色素色素:削弱微生物耐热性削弱微生物耐热性 2.pH的影响的影响 pH68时，微生物最不易死亡时，微生物最不易死亡 pH1mm，需过滤除去，需过滤除去 第三节第三节 培养基的分批灭菌培养基的
8、分批灭菌(p267)n分批灭菌（实罐灭菌，实消）分批灭菌（实罐灭菌，实消）：将配制好的培养：将配制好的培养基放在发酵罐中基放在发酵罐中,通入蒸气将培养基和设备一起进通入蒸气将培养基和设备一起进行灭菌的过程。行灭菌的过程。n优点：不需要专门的灭菌设备、投资少优点：不需要专门的灭菌设备、投资少 对蒸汽压力要求低（对蒸汽压力要求低（11054 105）灭菌效果可靠灭菌效果可靠 可用于极易起泡或黏度很大的培养基可用于极易起泡或黏度很大的培养基 缺点：锅炉负荷波动大缺点：锅炉负荷波动大 设备利用率低设备利用率低 无法采用高温短时灭菌无法采用高温短时灭菌过程：升温、保温和冷却过程：升温、保温和冷却一一.升
9、温阶段升温阶段 升温方式：升温方式：1.间接加热间接加热不稳定传热过程不稳定传热过程2.加热蒸汽温度不随时间改变，培养基温度加热蒸汽温度不随时间改变，培养基温度不断上升不断上升 GCdt=hF(tst)dn h不变：不变：=GC/hF ln(tsti)/(tstf)n h：230350J/（m2.s.）（夹套）夹套）350520J/（m2.s.）（蛇管）蛇管）2.直接蒸气加热直接蒸气加热 =GC(tfti)+Q)/(CWtf)Sn散失热量可取加热培养基所需热量的散失热量可取加热培养基所需热量的10%20%n升温阶段结束后残留的活菌数升温阶段结束后残留的活菌数N1n可认为温度高于可认为温度高于1
10、00时才有灭菌效果。时才有灭菌效果。二二.冷却阶段冷却阶段 nGCdt/d=WCW(twotwi)=KFtmn=GC/WCW(B/B-1)ln(ti-twi)/(tf-twi)nT=TWi1+exp()=WCW/GC1-exp(-KF/WCW)=(Ti-Twi)/Twi三三.保温阶段保温阶段 n温度恒定，比死亡速率不变温度恒定，比死亡速率不变n 1/ln(N1/N2)N1：升温结束时的活菌数；升温结束时的活菌数；N2：开始降温时的活菌数开始降温时的活菌数 第四节第四节 培养基的连续灭菌培养基的连续灭菌 n连续灭菌连续灭菌(连消）连消）：将配制好的培养基在向发酵罐将配制好的培养基在向发酵罐输送的
11、同时进行加温、保温、冷却处理而进行灭输送的同时进行加温、保温、冷却处理而进行灭菌的过程。菌的过程。n优点：可采用高温短时杀菌，营养物质破坏小优点：可采用高温短时杀菌，营养物质破坏小 设备利用率高设备利用率高 蒸汽负荷平衡，锅炉利用率高蒸汽负荷平衡，锅炉利用率高 适宜采用自动控制适宜采用自动控制 一一.连续灭菌的流程连续灭菌的流程 n 配料罐配料罐连消泵连消泵加热器（连消塔）加热器（连消塔）维持罐维持罐冷冷却器却器 n喷射加热连续灭菌流程：喷射加热连续灭菌流程：喷射加热喷射加热管道维持管道维持真空冷却真空冷却喷射加热连续灭菌优点喷射加热连续灭菌优点n受热时间短受热时间短n保证培养基先进先出，避免
12、过保证培养基先进先出，避免过热或灭菌不彻底热或灭菌不彻底注意：真空系统要严格密封，注意：真空系统要严格密封，避免二次污染避免二次污染n薄板换热器连续灭菌流程：薄板换热器连续灭菌流程：培养基在设备中同时完成预热、灭菌和冷却培养基在设备中同时完成预热、灭菌和冷却过程。过程。优点：节约蒸汽和冷却水用量优点：节约蒸汽和冷却水用量周期较短周期较短二二.连续灭菌的设备和计算连续灭菌的设备和计算n1、预热：、预热：70（不溶性物料发生糊化）（不溶性物料发生糊化）2.加热加热连消塔式连续灭菌设备：连消塔式连续灭菌设备：套管式套管式气液混合式气液混合式n喷射加热器喷射加热器n加热蒸汽用量（273）3.保温保温n
13、罐式保温设备罐式保温设备n管式保温设备管式保温设备4.冷却冷却n喷淋冷却设备n真空冷却设备n板式冷却设备n螺旋板冷却设备n真空闪冷设备总总 结结n染菌/噬菌体的主要危害n纯种培养的具体措施n影响培养基灭菌的因素n喷射加热连续灭菌流程作作 业业1.致死温度 致死时间 连续灭菌(连消）2.生产发酵过程中常用的灭菌方法有哪些？3.一发酵罐内装40m3培养基，在121实罐灭菌。原污染程度为每毫升培养基中含耐热菌芽孢2107个，比死亡速率为0.0287s-1。求灭菌失败几率为0.001,0.0001所需要的时间。4.一发酵罐容积为50m3，进行氨基酸发酵时的装料系数为0.6。每毫升培养基中含产气梭状芽孢杆菌芽孢1105个，比死亡速率为1.8min-1，如果在121进行实罐灭菌，求灭菌失败几率为千分之一所需要的时间。
