1、 疫苗基本知识1 在发展中国家，死亡总人数的在发展中国家，死亡总人数的30%50%死于传染病。死于传染病。在发达国家，传染病死亡人数仅占在发达国家，传染病死亡人数仅占死亡总人数的死亡总人数的4%8%，主要得益于，主要得益于疫疫苗苗的广泛应用。的广泛应用。二、灭活疫苗二、灭活疫苗三、减毒活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗六、核酸疫苗七、植物疫苗七、植物疫苗八、治疗性疫苗八、治疗性疫苗 人工免疫：人工免疫：有计划、有目的地给人有计划、有目的地给人体接种抗原，或输入抗体或免疫细胞，体接种抗原，或输入抗体或免疫细胞，使机体获得某种特异性抵抗力，从而
2、达使机体获得某种特异性抵抗力，从而达到预防或治疗某种疾病的目的。到预防或治疗某种疾病的目的。输入物质输入物质 抗原（疫苗）抗原（疫苗）抗体或致敏淋巴细胞抗体或致敏淋巴细胞诱导时间诱导时间 慢（慢（14周）周）快（立刻发挥作用）快（立刻发挥作用）维持时间维持时间 长（数月长（数月数年）数年）短（短（23周）周）用用 途途 主要用于预防主要用于预防 治疗或应急预防治疗或应急预防用于人工主动免疫的生物制品。用于人工主动免疫的生物制品。疫苗：疫苗：刺激机体免疫系统对某种病刺激机体免疫系统对某种病原微生物处于高度戒备状态原微生物处于高度戒备状态-“时刻准备时刻准备着！着！”人类急需的疫苗：人类急需的疫苗
3、：HIV、HCV 生物武器和生物恐怖：生物武器和生物恐怖：炭疽杆菌、鼠炭疽杆菌、鼠疫杆菌、天花病毒疫杆菌、天花病毒安全：安全：无致病性和接种后异常反应无致病性和接种后异常反应有效：有效：可诱导产生可靠的保护性免疫可诱导产生可靠的保护性免疫实用：实用：易于接种、保存和运输，价廉易于接种、保存和运输，价廉 古典疫苗时期：古典疫苗时期：牛痘苗、狂犬病牛痘苗、狂犬病疫苗疫苗 培养疫苗时期：培养疫苗时期：脊髓灰质炎疫苗、脊髓灰质炎疫苗、卡介苗卡介苗 基因工程疫苗时期：基因工程疫苗时期：乙型肝炎基乙型肝炎基因工程疫苗因工程疫苗 一、概述一、概述三、减毒活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗四、亚单位疫苗五、活
4、载体疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗六、核酸疫苗七、植物疫苗七、植物疫苗八、治疗性疫苗八、治疗性疫苗 灭活疫苗灭活疫苗（inactivated vaccine）：又又称死疫苗，是用化学或物理的方法，将称死疫苗，是用化学或物理的方法，将具有感染性的完整的病原微生物杀死，具有感染性的完整的病原微生物杀死，使其失去传染性而保留抗原性而成。使其失去传染性而保留抗原性而成。百日咳、乙型脑炎、流行性脑脊髓百日咳、乙型脑炎、流行性脑脊髓膜炎、狂犬病、伤寒、钩体病、甲型肝膜炎、狂犬病、伤寒、钩体病、甲型肝炎、鼠疫、流感、脊髓灰质炎（炎、鼠疫、流感、脊髓灰质炎（salk）等疫苗。等疫苗。免疫力维持时间短，需要多次
5、重复接种；主要诱发体液免疫，不能产生细胞免疫或黏膜免疫应答；接种剂量较大，不良反应；需要严格灭活。易于制备；免疫原性稳定易于制备；免疫原性稳定性高；储存及运输方便；易于制备多价性高；储存及运输方便；易于制备多价疫苗；疫苗安全性高。疫苗；疫苗安全性高。1、国内全病毒灭活疫苗所用的、国内全病毒灭活疫苗所用的SARS毒株均为原始毒力很强的毒株，其研发、毒株均为原始毒力很强的毒株，其研发、检定和将来的生产都必须需在检定和将来的生产都必须需在P3级条件下级条件下进行，不能适应规模化生产。进行，不能适应规模化生产。2、尚无有效的动物模型，、尚无有效的动物模型，SARS流行流行爆发具有不确定性，各种疫苗的安
6、全性和爆发具有不确定性，各种疫苗的安全性和有效性的临床前验证较困难。有效性的临床前验证较困难。一、概述一、概述二、灭活疫苗二、灭活疫苗四、亚单位疫苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗六、核酸疫苗七、植物疫苗七、植物疫苗八、治疗性疫苗八、治疗性疫苗 减毒活疫苗减毒活疫苗（live-attenuated vaccine）：用人工诱变或从自然界筛选出的毒力高用人工诱变或从自然界筛选出的毒力高度降低或无毒的活的病原微生物制成的度降低或无毒的活的病原微生物制成的疫苗。可模拟自然发生隐性感染，诱发疫苗。可模拟自然发生隐性感染，诱发理想的免疫应答而又不产生临床症状。理想的免疫应答而又不产
7、生临床症状。结核病、脊髓灰质炎（结核病、脊髓灰质炎（Sabin）、麻）、麻疹、乙型脑炎、甲型肝炎、风疹疫苗、疹、乙型脑炎、甲型肝炎、风疹疫苗、腮腺炎等疫苗。腮腺炎等疫苗。能诱发全面、稳定、持久能诱发全面、稳定、持久的体液、细胞和粘膜免疫应答；一般只的体液、细胞和粘膜免疫应答；一般只须接种一次；可采用口服、喷鼻或气雾须接种一次；可采用口服、喷鼻或气雾途径免疫。途径免疫。有效期短和热稳定性差，有效期短和热稳定性差，运输、保存条件要求较高；回复突变危运输、保存条件要求较高；回复突变危险；使用范围相对窄。险；使用范围相对窄。基因缺失活疫苗基因缺失活疫苗（gene deleted live vaccin
8、e）：）：采用分子生物学技术，去除采用分子生物学技术，去除与毒力或毒力相关基因片段，使病原微与毒力或毒力相关基因片段，使病原微生物毒力减低或丧失。用缺失突变毒株生物毒力减低或丧失。用缺失突变毒株制成的疫苗。制成的疫苗。与自然突变株（多为点突变毒株）与自然突变株（多为点突变毒株）相比，基因缺失活疫苗具有突变性状明相比，基因缺失活疫苗具有突变性状明确、稳定、不易发生毒力返祖的优点。确、稳定、不易发生毒力返祖的优点。一、概述一、概述二、灭活疫苗二、灭活疫苗三、减毒活疫苗三、减毒活疫苗五、活载体疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗六、核酸疫苗七、植物疫苗七、植物疫苗八、治疗性疫苗八、治疗性疫苗 对于某些抗原
9、性弱、易发生免疫逃对于某些抗原性弱、易发生免疫逃避的病原体，常规疫苗往往难以获得有避的病原体，常规疫苗往往难以获得有效的免疫应答及保护性。效的免疫应答及保护性。一些免疫保护机制不清，可能诱导一些免疫保护机制不清，可能诱导免疫病理反应，有潜在致肿瘤作用的病免疫病理反应，有潜在致肿瘤作用的病毒，以及不易培养的病原体，则难以用毒，以及不易培养的病原体，则难以用传统方法生产疫苗。传统方法生产疫苗。亚单位疫苗亚单位疫苗（subunit vaccine）：）：不含病不含病原体核酸，选用能诱发宿主产生中和抗原体核酸，选用能诱发宿主产生中和抗体的微生物蛋白或表面抗原而制成的疫体的微生物蛋白或表面抗原而制成的疫
10、苗。苗。白喉类毒素、破伤风类毒素白喉类毒素、破伤风类毒素 流感嗜血杆菌荚膜多糖、脑膜炎球流感嗜血杆菌荚膜多糖、脑膜炎球菌荚膜多糖菌荚膜多糖 流感病毒血凝素和神经氨酸酶流感病毒血凝素和神经氨酸酶 乙型肝炎乙型肝炎HBsAg（基因工程疫苗）（基因工程疫苗）人乳头瘤病毒人乳头瘤病毒除去了病原体中与诱发保护除去了病原体中与诱发保护性免疫无关或有害成分，只保留有效的性免疫无关或有害成分，只保留有效的免疫原成分，因而免疫作用明显增强而免疫原成分，因而免疫作用明显增强而稳定，可靠性提高，对机体引起的不良稳定，可靠性提高，对机体引起的不良反应小。反应小。需要选用佐剂；不能诱发细需要选用佐剂；不能诱发细胞免疫和
11、黏膜免疫。胞免疫和黏膜免疫。将病原体中能诱导保护性免疫应答将病原体中能诱导保护性免疫应答的目的抗原编码基因克隆后，插入适当的目的抗原编码基因克隆后，插入适当的原核或真核表达载体质粒；的原核或真核表达载体质粒；再将重组质粒导入细菌、酵母菌或再将重组质粒导入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中高效表达目的基因；哺乳动物细胞中高效表达目的基因；分离、提取、纯化分离、提取、纯化而制成而制成。基因重组亚单位疫苗基因重组亚单位疫苗 (genetic engineering subunit vaccine)下一步工作计划下一步工作计划基因工程疫苗发展的重点基因工程疫苗发展的重点 不能或难以培养的病原体；不能或难以培
12、养的病原体；有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体；有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体；传统疫苗效果差或不良反应大的病原体；传统疫苗效果差或不良反应大的病原体；能简化免疫程序、降低成本的多价疫苗。能简化免疫程序、降低成本的多价疫苗。一、概述一、概述二、灭活疫苗二、灭活疫苗三、减毒活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗四、亚单位疫苗六、核酸疫苗六、核酸疫苗七、植物疫苗七、植物疫苗八、治疗性疫苗八、治疗性疫苗 活载体疫苗活载体疫苗（live vector vaccine）：）：又称重组载体疫苗又称重组载体疫苗（recombinant vector vaccine），），是将有效的目的抗原的编码是将有效的目
13、的抗原的编码基因导入活载体（无或弱毒的细菌或病基因导入活载体（无或弱毒的细菌或病毒株）中，构建重组菌株；目的基因可毒株）中，构建重组菌株；目的基因可随重组菌株在宿主体内的增殖而大量表随重组菌株在宿主体内的增殖而大量表达，从而诱发相应的免疫保护作用。达，从而诱发相应的免疫保护作用。载体：载体：腺病毒、牛痘病毒、金丝雀腺病毒、牛痘病毒、金丝雀痘病毒、伤寒沙门菌减毒株、卡介苗、痘病毒、伤寒沙门菌减毒株、卡介苗、乳杆菌等。乳杆菌等。病原体：病原体：乙型肝炎病毒、狂犬病病乙型肝炎病毒、狂犬病病毒、痢疾杆菌等。毒、痢疾杆菌等。一、概述一、概述二、灭活疫苗二、灭活疫苗三、减毒活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫
14、苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗五、活载体疫苗六、六、核酸疫苗核酸疫苗七、植物疫苗七、植物疫苗八、治疗性疫苗八、治疗性疫苗 1990年，年，Wolff等首次发现，给小鼠等首次发现，给小鼠肌肉注射裸露质粒肌肉注射裸露质粒DNA后，质粒携带的后，质粒携带的基因可被肌细胞摄取并在其中表达，还基因可被肌细胞摄取并在其中表达，还可诱生特异性免疫应答。可诱生特异性免疫应答。核酸疫苗核酸疫苗（nucleotide vaccine）：）：又又称称DNA疫苗疫苗（DNA vaccine），是将一种，是将一种或多种目的抗原的编码基因克隆到真核或多种目的抗原的编码基因克隆到真核质粒表达载体上；再将重组质粒直接注质粒表
15、达载体上；再将重组质粒直接注入到体内，在宿主细胞内表达目的蛋白，入到体内，在宿主细胞内表达目的蛋白，诱发特异性免疫应答。诱发特异性免疫应答。目前进入临床试验的核酸疫苗有目前进入临床试验的核酸疫苗有HIV DNA疫苗和疟疾疫苗和疟疾 DNA疫苗。疫苗。由于核酸疫苗具有构建容易、生产由于核酸疫苗具有构建容易、生产方便、表达稳定及可诱发全面的免疫应方便、表达稳定及可诱发全面的免疫应答等特点，在抗感染、抗肿瘤免疫及疾答等特点，在抗感染、抗肿瘤免疫及疾病的预防等方面具有广阔的应用前景，病的预防等方面具有广阔的应用前景，被誉为疫苗的被誉为疫苗的“”。局部注射的核酸（重组质粒局部注射的核酸（重组质粒DNA）
16、被周围的细胞（如黏膜上皮细胞、抗原被周围的细胞（如黏膜上皮细胞、抗原提呈细胞）摄取后，进入核内进行转录，提呈细胞）摄取后，进入核内进行转录，并在胞质中翻译成目的蛋白并在胞质中翻译成目的蛋白。目的目的蛋白被蛋白酶复合体降解成含蛋白被蛋白酶复合体降解成含有表位的抗原肽，可作为：有表位的抗原肽，可作为：与与MHC类类分子结合，诱发分子结合，诱发CTL介导的细胞免疫应介导的细胞免疫应答。答。与与MHC类类分子结合，诱发偏向分子结合，诱发偏向Th1型免疫应答。型免疫应答。目的蛋白亦可通过细胞分泌或细胞目的蛋白亦可通过细胞分泌或细胞破裂的方式进入组织间，以天然折叠形破裂的方式进入组织间，以天然折叠形式激活
17、式激活B淋巴细胞而产生抗体。淋巴细胞而产生抗体。DNA疫苗接种后，体内仅表达疫苗接种后，体内仅表达pgng水平的外源蛋白，但能诱发强而持久水平的外源蛋白，但能诱发强而持久的细胞免疫和体液免疫应答。的细胞免疫和体液免疫应答。如何解释这一现象呢？如何解释这一现象呢？目的基因（含载体质粒）含有目的基因（含载体质粒）含有CpG基基序的回文序列，能激活较强的序的回文序列，能激活较强的CTL效应，效应，并能激活巨噬细胞与并能激活巨噬细胞与NK细胞，因此，细胞，因此，CpG回文序列被称为免疫刺激回文序列被称为免疫刺激DNA序列。序列。CpG基序与基序与IL-2、TNF-、IFN-的的基因结构相似而产生协同作
18、用。基因结构相似而产生协同作用。目的基因的选择：目的基因的选择：侧重于免疫原侧重于免疫原性，即所表达的目的蛋白刺激机体免疫性，即所表达的目的蛋白刺激机体免疫应答的能力。目的蛋白中是否具有受应答的能力。目的蛋白中是否具有受MHC分子限制的分子限制的T细胞抗原表位，是保细胞抗原表位，是保证核酸免疫有效的先决条件。证核酸免疫有效的先决条件。核酸疫苗所选择的目的基因应尽量核酸疫苗所选择的目的基因应尽量避免有害基因成分，特别是病毒或肿瘤避免有害基因成分，特别是病毒或肿瘤的核酸免疫。的核酸免疫。载体的选择：载体的选择：构建构建DNA疫苗的质疫苗的质粒通常是非复制型的真核表达质粒，能粒通常是非复制型的真核表
19、达质粒，能高水平地表达目的基因。高水平地表达目的基因。重组质粒可分为两个部分：重组质粒可分为两个部分：转录部分：转录部分：由启动子、插入的目由启动子、插入的目的抗原的抗原cDNA和和poly A终止子组成，指导终止子组成，指导目的蛋白在体内表达，诱发特异性免疫目的蛋白在体内表达，诱发特异性免疫应答。应答。佐剂部分：佐剂部分：CpG基序。基序。启动子的选择：启动子的选择：质粒在宿主细胞质粒在宿主细胞内表达外源性蛋白的水平与调控内表达外源性蛋白的水平与调控DNA表表达的启动子关系密切。表达水平的不同达的启动子关系密切。表达水平的不同又直接影响免疫应答的强度和持续性。又直接影响免疫应答的强度和持续性
20、。DNA疫苗的优化疫苗的优化 联合构建：联合构建：在载体质粒中插入在载体质粒中插入2个或个或2个以上目的抗原基因，既能激活个以上目的抗原基因，既能激活CD8T细胞产生特异性细胞产生特异性CTL，又能激活，又能激活CD4Th2细胞产生体液免疫。细胞产生体液免疫。协同构建：协同构建：将目的基因与某种细将目的基因与某种细胞因子的基因构建成嵌合基因，以促进胞因子的基因构建成嵌合基因，以促进目的基因的免疫效果。目的基因的免疫效果。免疫途径、剂量、时间：免疫途径、剂量、时间：常见免常见免疫途径有肌肉注射、皮内或皮下免疫、疫途径有肌肉注射、皮内或皮下免疫、粘膜免疫等。粘膜免疫等。传统免疫所使用的抗原一般是灭
21、活传统免疫所使用的抗原一般是灭活病原体、减毒的活病原体或病原体的亚病原体、减毒的活病原体或病原体的亚单位蛋白。单位蛋白。核酸疫苗仅仅是病原体某种抗原的核酸疫苗仅仅是病原体某种抗原的基因片段，可提供与天然构象极为接近基因片段，可提供与天然构象极为接近的目的蛋白，提呈给宿主免疫系统，与的目的蛋白，提呈给宿主免疫系统，与自然感染过程相似。自然感染过程相似。核酸疫苗兼有重组亚单位疫苗的安核酸疫苗兼有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全方位免疫应答全性和减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的高效力。的高效力。灭活疫苗和亚单位疫苗在体内代谢灭活疫苗和亚单位疫苗在体内代谢较快，难以长时间维持较稳定的含量，较快，
22、难以长时间维持较稳定的含量，需多次接种免疫原，加强免疫。需多次接种免疫原，加强免疫。核酸疫苗可在体内不断翻译表达，核酸疫苗可在体内不断翻译表达，较长时间维持较高的蛋白水平，免疫具较长时间维持较高的蛋白水平，免疫具有连续性，一次接种可获得长期或终身有连续性，一次接种可获得长期或终身免疫力。免疫力。采用不同毒株之间的保守采用不同毒株之间的保守DNA序列序列作核酸疫苗，可使其免疫作用突破地理作核酸疫苗，可使其免疫作用突破地理株的限制，从而有效地预防病原体极易株的限制，从而有效地预防病原体极易发生变异的某些疾病（如丙型肝炎、甲发生变异的某些疾病（如丙型肝炎、甲型流感、艾滋病等）。型流感、艾滋病等）。核
23、酸疫苗与世界卫生组织儿童计划核酸疫苗与世界卫生组织儿童计划免疫长远目标（用一种疫苗预防多种疾免疫长远目标（用一种疫苗预防多种疾病）相吻合，不仅能预防疾病，还可作病）相吻合，不仅能预防疾病，还可作为治疗性疫苗，治疗一些复杂难治的疾为治疗性疫苗，治疗一些复杂难治的疾病，如病毒性肝炎、癌症等。病，如病毒性肝炎、癌症等。一、概述一、概述二、灭活疫苗二、灭活疫苗三、减毒活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗六、核酸疫苗八、治疗性疫苗八、治疗性疫苗 植物疫苗植物疫苗（plant-based vaccine）：）：亦亦称转基因植物疫苗称转基因植物疫苗（tra
24、nsgenic plant vaccine），是指将抗原基因导入植物细，是指将抗原基因导入植物细胞并在其中表达，人食用已表达目的抗胞并在其中表达，人食用已表达目的抗原的转基因植物后，可诱发特异性免疫原的转基因植物后，可诱发特异性免疫应答的新型疫苗。应答的新型疫苗。（1）建立整合抗原基因的稳定表达）建立整合抗原基因的稳定表达植株，并可通过无性或有性繁殖生产大植株，并可通过无性或有性繁殖生产大量的转基因植物。量的转基因植物。（2）建立瞬时表达植株，即利用基）建立瞬时表达植株，即利用基因工程植物病毒为载体，将抗原编码基因工程植物病毒为载体，将抗原编码基因插入到植物病毒基因中，再将重组病因插入到植物病
25、毒基因中，再将重组病毒株感染植物，抗原基因随病毒在植物毒株感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制而得以高效表达，获得高产量体内复制而得以高效表达，获得高产量的目的蛋白。的目的蛋白。（1）植物种子、块茎、果实等是蛋）植物种子、块茎、果实等是蛋白质很好的聚积和保存场所，使植物疫白质很好的聚积和保存场所，使植物疫苗苗的生产、运输和储存更的生产、运输和储存更为容易，免疫途径更简便、安全。为容易，免疫途径更简便、安全。（2）植物疫苗（抗原）通过胃内）植物疫苗（抗原）通过胃内酸性环境时，可受到细胞壁的保护，直酸性环境时，可受到细胞壁的保护，直接到达肠粘膜部位，诱发粘膜和全身免接到达肠粘膜部位，诱发粘膜和全
26、身免疫应答，比传统的免疫途径更有效。疫应答，比传统的免疫途径更有效。（3）植物疫苗不需严格的分离纯化）植物疫苗不需严格的分离纯化程序，经济价廉，可望替代传统的发酵程序，经济价廉，可望替代传统的发酵生产，有利于在发展中国家推广。生产，有利于在发展中国家推广。一、概述一、概述二、灭活疫苗二、灭活疫苗三、减毒活疫苗三、减毒活疫苗四、亚单位疫苗四、亚单位疫苗五、活载体疫苗五、活载体疫苗六、核酸疫苗六、核酸疫苗七、植物疫苗七、植物疫苗 的接种对象是健康人群，的接种对象是健康人群，多采用模拟自然感染过程的策略，一般多采用模拟自然感染过程的策略，一般为微生物的保护性抗原，成分较单纯，为微生物的保护性抗原，成
27、分较单纯，主要用于免疫预防作用，对机体无明显主要用于免疫预防作用，对机体无明显的病理损伤，使用安全可靠。的病理损伤，使用安全可靠。已广泛用于预防病原体已广泛用于预防病原体进化相对保守、自然感染可获得牢固免进化相对保守、自然感染可获得牢固免疫力、保护性免疫主要依赖于中和抗体疫力、保护性免疫主要依赖于中和抗体的传染病，如天花、脊髓灰质炎、麻疹的传染病，如天花、脊髓灰质炎、麻疹乙型肝炎、白喉、破伤风等。乙型肝炎、白喉、破伤风等。（therapeutic vaccine）的的接种对象是持续性感染患者，其抗原成接种对象是持续性感染患者，其抗原成分不像预防性疫苗那样单纯，可根据需分不像预防性疫苗那样单纯，
28、可根据需要进行组合和调整，例如，将微生物抗要进行组合和调整，例如，将微生物抗原（基因）与不同细胞因子（基因）构原（基因）与不同细胞因子（基因）构建成嵌合性疫苗建成嵌合性疫苗。治疗性疫苗旨在启动治疗性疫苗旨在启动Th1极化和有极化和有效的细胞免疫，打破机体的免疫耐受状效的细胞免疫，打破机体的免疫耐受状态，部分纠正机体的免疫缺陷，提高对态，部分纠正机体的免疫缺陷，提高对病原体特异性免疫应答水平，故特别强病原体特异性免疫应答水平，故特别强调佐剂的选用。调佐剂的选用。由于目前很多传染病、肿瘤等尚无由于目前很多传染病、肿瘤等尚无有效的治疗药物，而治疗性疫苗的不良有效的治疗药物，而治疗性疫苗的不良反应比化疗药物少，故治疗性疫苗与药反应比化疗药物少，故治疗性疫苗与药物治疗可协同作用，提高机体的特异性物治疗可协同作用，提高机体的特异性免疫应答水平，加速康复，减少复发。免疫应答水平，加速康复，减少复发。目前，疫苗研制的主要问题是改进目前，疫苗研制的主要问题是改进免疫方法，简化免疫程序，提高疫苗的免疫方法，简化免疫程序，提高疫苗的稳定性及安全性，以及降低疫苗的生产稳定性及安全性，以及降低疫苗的生产成本。成本。67
