1、细菌性食物中毒的快速检验10/28/20221定义n食源性疾病 世界卫生组织将食源性疾病定世界卫生组织将食源性疾病定义为义为“凡是通过摄食而进入人体的病凡是通过摄食而进入人体的病原体，使人体患感染性或中毒性疾原体，使人体患感染性或中毒性疾病，统称为食源性疾病病，统称为食源性疾病”10/28/20222定义n食物中毒 食物中毒是指人摄人了含有生物性、食物中毒是指人摄人了含有生物性、化学性有毒有害物质后或把有毒有害物质化学性有毒有害物质后或把有毒有害物质当作食物摄入后所出现的而非传染性的急当作食物摄入后所出现的而非传染性的急性或亚急性疾病，属于食源性疾病的范畴。性或亚急性疾病，属于食源性疾病的范畴
2、。食物中毒既不包括因暴饮暴食而引起的急食物中毒既不包括因暴饮暴食而引起的急性胃肠炎、食源性肠道传染病性胃肠炎、食源性肠道传染病(如伤寒如伤寒)和和寄生虫病寄生虫病(如囊虫病如囊虫病)，也不包括因一次大，也不包括因一次大量或者长期少量摄入某些有毒有害物质而量或者长期少量摄入某些有毒有害物质而引起的以慢性毒性为主要特征引起的以慢性毒性为主要特征(如致畸、如致畸、致癌、致突变致癌、致突变)的疾病。的疾病。10/28/20223 食物中毒诊断标准主要以流行食物中毒诊断标准主要以流行病学调查资料及病人的潜伏期和中病学调查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现为依据，实验室诊断毒的特有表现为依据，实验室诊断是
3、为了确定中毒的病因而进行的。是为了确定中毒的病因而进行的。食物中毒诊断标准及技术处理总则食物中毒诊断标准及技术处理总则 GB14938-1994 10/28/20224中毒特征名称常见食物潜伏期病程主要症状重点采集标本沙门氏菌肉蛋类4-48h3-7d恶心 呕吐 腹痛 腹泻发热38-40便 食品 血副溶血弧菌水产品3-24h1-3d呕吐 发热 腹痛以上腹部为主 水样便腹泻便 食品变形杆菌肉蛋及水产品5-18h1-3d恶心 呕吐 腹痛 腹泻发热38左右食品 便致泻性大肠凉拌菜4-44h1-3d呕吐腹痛 腹泻水样便或粘液便 发热5ng，当溴化乙，当溴化乙锭太多，凝胶本底会染色过深，不易看清弱显色带时
4、，锭太多，凝胶本底会染色过深，不易看清弱显色带时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。后再观察。由于溴化乙由于溴化乙锭是一种诱变剂，使用时应戴手套，并避免环境污染。锭是一种诱变剂，使用时应戴手套，并避免环境污染。10/28/202227n银染色银染色：银染色液中的银离子：银染色液中的银离子(Ag+)可与可与核酸形成稳定的复合物，然后用甲醛等还核酸形成稳定的复合物，然后用甲醛等还原剂使原剂使Ag+还原成银颗粒，使还原成银颗粒，使核酸带呈黑核酸带呈黑褐色，主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色褐色，主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色，也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比也用于琼脂糖凝胶
5、染色，其灵敏度比EB高，高，但缺点是银染色后，但缺点是银染色后，DNA不宜回收再使用。不宜回收再使用。10/28/202228PCR污染与对策污染原因污染原因n（1）PCR扩增产物污染扩增产物污染 最主要最常见最主要最常见的污染问题的污染问题 n（2）标本间交叉污染）标本间交叉污染主要由于盛装标本主要由于盛装标本的容器被污染的容器被污染、加样枪污染导致标本间污染、加样枪污染导致标本间污染、有些微生物标本有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶扩散，尤其是病毒可随气溶胶扩散，导致彼此间的污染导致彼此间的污染10/28/202229防止污染的方法防止污染的方法（1）合理分隔实验室）合理分隔实验室（2）分
6、装）分装PCR试剂试剂（3）防加样枪引起污染）防加样枪引起污染（4）选择质量好的）选择质量好的Eppendorf管，以避免样管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管时动本外溢及外来核酸的进入，打开离心管时动作要轻，以防管内液体溅出。作要轻，以防管内液体溅出。10/28/202230coli O157:H7抗原结合，最后的冲洗步骤将没有结合的接合剂冲洗掉。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；呕吐腹痛 腹泻水样便或粘液便 发热5ng，当溴化乙锭太多，凝胶本底会染色过深，不易看清弱显色带时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察。由变性Template denaturation
7、食物中毒诊断标准主要以流行病学调查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现为依据，实验室诊断是为了确定中毒的病因而进行的。实时荧光PCR检测技术荧光强度由光学扫描器测定。API细菌鉴定系统-数值鉴定法食物中毒诊断标准及技术处理总则 GB14938-1994PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号TaqMan荧光探针：1%Tween-20及5mmol/L 二巯基苏糖醇（DTT），但应注意使用浓度不应过高，只有牛血清白蛋白的浓度可高达800g/ml，而对酶活性仍无抑制。减少非特异性扩增及交叉污染有四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）作为合成DNA的原料高灵敏度：PCR产物量是以指数方式增加的，能将
8、皮克(pg=10-12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=10-6)水平。原则上分为四个分隔开的工作区域：原则上分为四个分隔开的工作区域：试剂贮存和准备区；试剂贮存和准备区；标本制备区；标本制备区；扩增反应混合物配制和扩增区；扩增反应混合物配制和扩增区；扩增产物分析区。扩增产物分析区。10/28/202231PCR分类分类n对称引物系统对称引物系统PCR 1、经典PCR 2、巢式PCR 3、多重PCR 4、膜结合PCR 5、原位PCR10/28/202232不对称不对称PCRn将反应系统中由于引物浓度的巨大差别，将反应系统中由于引物浓度的巨大差别，导致扩增的产物以某条单链导致扩增的产物以某条
9、单链DNA为主的为主的PCR称为不对称称为不对称PCR。两条引物的浓度相。两条引物的浓度相差很大（差很大（50100：1），浓度低的称为限），浓度低的称为限制性引物，浓度高的称为非限制性引物，制性引物，浓度高的称为非限制性引物，在最初的十几个循环中，两条在最初的十几个循环中，两条DNA的目的的目的片段得到等量扩增，但后来限制性引物被片段得到等量扩增，但后来限制性引物被消耗殆尽，只有非限制性引物尚存，扩增消耗殆尽，只有非限制性引物尚存，扩增的产物主要为该引物引导的单链的产物主要为该引物引导的单链DNA。不。不对称对称PCR主要为序列测定制备单链主要为序列测定制备单链DNA 10/28/20223
10、3逆转录逆转录PCRn以以RNA为模板的为模板的PCR称为逆转录称为逆转录PCR（Reverse Transcriptase PCR,RT-PCR），），与前述与前述PCR的不同之处在于首先需在一单引物的的不同之处在于首先需在一单引物的介导和逆转录酶的催化下，合成介导和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补链，的互补链，该互补链称为该互补链称为cDNA，通过加热使逆转录酶失活，通过加热使逆转录酶失活后，加入另一引物，再以该后，加入另一引物，再以该cDNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶催化下合成目的双链聚合酶催化下合成目的双链DNA片段。逆片段。逆转录转录PCR的模板可为细胞、病毒的总的模板可为细
11、胞、病毒的总RNA或细或细胞胞mRNA，该方法常用于检测，该方法常用于检测RNA病毒或研究病毒或研究真核细胞的基因表达真核细胞的基因表达10/28/202234标记引物标记引物PCRn是利用荧光素、同位素或生物素等对是利用荧光素、同位素或生物素等对PCR引物的引物的5端进行标记，通过检测荧光素或者端进行标记，通过检测荧光素或者同位素，直接显示产物的存在；或者利用同位素，直接显示产物的存在；或者利用生物素生物素亲合素系统与酶促反应结合，借亲合素系统与酶促反应结合，借助酶促反应的放大效应，显示目的片段的助酶促反应的放大效应，显示目的片段的存在，更加提高存在，更加提高PCR的灵敏度。的灵敏度。10/
12、28/202235n不同荧光素标记不同引物不同荧光素标记不同引物-彩色彩色PCR nPCR-ELISA法法-个引物的个引物的5端，使其携带便于端，使其携带便于PCR产物固定于微孔板的的功能基团，如生物素；产物固定于微孔板的的功能基团，如生物素；而另一引物或者探针的而另一引物或者探针的5端修饰便于用酶连免疫端修饰便于用酶连免疫吸附试验检测的基团如吸附试验检测的基团如FITC，经此修饰后的引物，经此修饰后的引物仍能引导仍能引导PCR的特异扩增反应，扩增后的产物不的特异扩增反应，扩增后的产物不需电泳，直接加入链霉亲合素包被的聚丙乙烯微需电泳，直接加入链霉亲合素包被的聚丙乙烯微孔板，通过生物素与链霉亲
13、合素反应，使产物以孔板，通过生物素与链霉亲合素反应，使产物以及生物素修饰的游离引物固定于微孔板，但只有及生物素修饰的游离引物固定于微孔板，但只有产物可与随后加入的产物可与随后加入的HRP-抗抗FITC抗体结合，借抗体结合，借助检测酶活性反映助检测酶活性反映PCR产物的多少产物的多少10/28/202236免疫免疫PCRn是将抗原抗体的特异性反应与是将抗原抗体的特异性反应与PCR技术结合技术结合起来，以检测微量蛋白质的方法。起来，以检测微量蛋白质的方法。如：将与被检物对应的单克隆抗体先吸附在如：将与被检物对应的单克隆抗体先吸附在固相载体上，然后使被检抗原与之反应，再固相载体上，然后使被检抗原与之
14、反应，再用生物素化的特异性多抗结合此抗原，通过用生物素化的特异性多抗结合此抗原，通过亲合素再与生物素化亲合素再与生物素化DNA相连结，再以适当相连结，再以适当的引物对的引物对DNA指示分子进行扩增，以扩增产指示分子进行扩增，以扩增产物的有无与多少，反应待测抗原的存在与数物的有无与多少，反应待测抗原的存在与数量量10/28/202237定量PCR10/28/202238n实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。10/28/202239n1.Ct 值的定义n在荧光定量PCR技术中，有一个很重要
15、的概念 Ct值。其含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。10/28/202240n2.荧光域值（threshold）的设定nPCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 10/28/202241n3.Ct值与起始模板的关系n每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。10/28/202242nTaqMan荧光探针：nPCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的
16、荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。10/28/202243n在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。10/28/20224410/
17、28/20224510/28/202246荧光定量标准曲线 10/28/202247总结n细菌性食物中毒的判断很重要细菌性食物中毒的判断很重要 诊断标准主要以流行病学调查资料及病人的潜伏期和中毒的特有表现为依据，实验室诊断是为了确定中毒的病因而进行的 10/28/202248总结n样品采集是关键样品采集是关键 采集最可疑剩余食物，炊事用具、患者的呕吐物、病人便、患者血液和尸体标本，有时还需采集与食物中毒有关的人、动物及外环境样品。例如厨师便、手涂抹物等。10/28/202249总结n检验程序不能省略检验程序不能省略 直接涂片、染色、镜检活菌数测定选择适当的增菌和鉴别培养基进行分离培养生化鉴定血清学鉴定毒素测定。10/28/202250总结n采用多种快速检验方法采用多种快速检验方法n筛选采用筛选采用 酶联荧光免疫分析法 实时荧光PCR检测技术 鉴定采用鉴定采用 API细菌鉴定系统-数值鉴定法 基因指纹鉴定系统10/28/202251
