1、一、基础知识一、基础知识基本单位：基本单位：葡萄糖葡萄糖分布：分布：例例1 1：下列生物能分解纤维素的是（：下列生物能分解纤维素的是（）人人 兔兔 牛牛 蘑菇蘑菇 纤维杆菌纤维杆菌A.B.C.D.C分解分解纤维素纤维素的生物：的生物：草食性动物草食性动物微生物：各种细菌、真菌和少数放线菌微生物：各种细菌、真菌和少数放线菌 在草食性动物等的消化道内，也在草食性动物等的消化道内，也共生有共生有分解纤维素的微生物分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的人没有分解纤维素的能力能力。纤维素纤维素C C1 1酶酶CxCx酶酶葡萄糖
2、苷酶葡萄糖苷酶葡萄糖葡萄糖纤维二糖纤维二糖3 3、纤维素酶活性的测定实验：、纤维素酶活性的测定实验：方法：滤纸方法：滤纸崩溃法崩溃法取二支取二支20mL20mL的试管的试管实验：实验：纤维素酶分解纤维素的实验纤维素酶分解纤维素的实验各加入一张滤纸条各加入一张滤纸条各加入各加入PH4.8PH4.8，物质量为，物质量为0.1mol/L0.1mol/L的醋酸醋酸钠缓冲液的醋酸醋酸钠缓冲液11ml11ml和和10ml10ml甲甲 乙乙在在乙乙试管中加入试管中加入1mL1mL纤维素酶纤维素酶两支试管固定在锥形瓶中，放在两支试管固定在锥形瓶中，放在140r/min140r/min的摇床上振荡的摇床上振荡1
3、h1h结果：乙试管的滤纸条消失结果：乙试管的滤纸条消失 讨论讨论：乙试管的滤纸条为什么会消失？甲乙试管的滤纸条为什么会消失？甲试管的作用是什么？试管的作用是什么？实验分析：实验分析：P P2727的小实验的小实验本实验的本实验的自变量自变量是纤是纤维素酶的有无维素酶的有无自变量的操纵方法是：自变量的操纵方法是：在在一支试管中添加适一支试管中添加适量（量（1mL1mL）的纤维素）的纤维素酶溶液酶溶液，在，在另一支试另一支试管不添加纤维素酶管不添加纤维素酶，但，但需加入等量的缓冲液，需加入等量的缓冲液，不能加入蒸馏水，否则不能加入蒸馏水，否则会影响溶液的会影响溶液的pHpH。乙试管滤纸消失乙试管滤
4、纸消失原因：原因：纤维素酶把纤维纤维素酶把纤维素分解素分解甲试管的作用：甲试管的作用：对照对照 即：可根据是否产生透明圈即：可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。来筛选纤维素分解菌。纤维素纤维素产生产生分解分解思考：本实验的流程与课题思考：本实验的流程与课题2 2中的实验中的实验流程有哪些异同？流程有哪些异同？课题课题2 2：将土样制成的菌悬液直接涂将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上布在选择培养基上 本课题：通过选择培养，使纤维本课题：通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，素分解菌得到增殖后，再涂布在鉴别再涂布在鉴别培养基上培养基上。土壤取样土壤取样取样环境：取样环境：富含纤维素的环
5、境中富含纤维素的环境中 由于由于生物与环境的相互依存关系生物与环境的相互依存关系，在在富含纤维素的环境富含纤维素的环境中，中，纤维素分解菌纤维素分解菌的含量相对提高的含量相对提高，因此从这种土样中获，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。得目的微生物的几率要高于普通环境。原因原因 实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。多年积累的枯枝败叶等。如果找不到合适的环境，还可以将如果找不到合适的环境，还可以将富含富含纤维素的物质如滤纸纤维素的物质如滤纸等，埋在土壤中，经等，埋在土壤中，经过过30d30d左右，再从左右，再从已腐烂的滤纸上已
6、腐烂的滤纸上筛选纤维筛选纤维素分解菌。素分解菌。将滤纸埋在土壤中：将滤纸埋在土壤中：人工设置纤维素人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境，使纤维素分解菌分解菌生存的适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。相对聚集。将滤纸将滤纸埋在土壤中埋在土壤中有什么作用？你认有什么作用？你认为滤纸应埋进土壤中为滤纸应埋进土壤中多深多深？一般应将滤纸埋于一般应将滤纸埋于深约深约10cm10cm左右的土壤中左右的土壤中。阅读资料二阅读资料二“选择培养基选择培养基”，回，回答以下几问题：答以下几问题：(富集培养，浓缩）富集培养，浓缩）可用可用牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏蛋白胨培养基与之对照，与之对照，或者将或者将纤维素粉纤维素
7、粉改为改为葡萄糖葡萄糖。选择培养的操作方法：选择培养的操作方法：将土样加入装有将土样加入装有30ml选择培养基选择培养基的锥形瓶中，的锥形瓶中，将锥形瓶固定在将锥形瓶固定在摇床摇床上上，在一定温度下，在一定温度下震荡震荡培培养养12天，直至培养液天，直至培养液变浑浊变浑浊。吸取一定的培。吸取一定的培养液（如养液（如5ml），转移到另一瓶新鲜的选择培），转移到另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。为什么选择培养能够为什么选择培养能够“浓缩浓缩”所需的微生物？所需的微生物？指微生物的种类少了，而指微生物的种类少了，而某些微生物的数量多了某
8、些微生物的数量多了在选择培养的条件下，可以使那些能够在选择培养的条件下，可以使那些能够适适应该条件应该条件的的微生物得到迅速繁殖微生物得到迅速繁殖，而那些，而那些不适应该条件的微生物不适应该条件的微生物的繁殖的繁殖被抑制被抑制，因，因此可以起到此可以起到“浓缩浓缩”的作用。的作用。101102103104105106将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上（2 2）涂布平板：将稀）涂布平板：将稀释度为释度为10104 410106 6的菌悬的菌悬液各取液各取0.1ml0.1ml涂布在培涂布在培养基上，养基上，3030倒置培养倒置培养鉴别鉴别纤维素分解菌的纤维
9、素分解菌的培培养基养基CMC-Na CMC-Na 5-10g 5-10g酵母膏酵母膏 1g1gKH2PO4 0.25gKH2PO4 0.25g琼脂琼脂 15g15g土豆汁土豆汁 100ml100ml将上述物质溶解后将上述物质溶解后,用蒸用蒸馏水定容到馏水定容到1000ml1000ml（1)1)制备培养基制备培养基:固体培养基固体培养基实验组：实验组：对照组：对照组：出现明显出现明显的透明圈的透明圈不会出现明不会出现明显的透明圈显的透明圈实实验验组组对对照照组组挑选产生挑选产生透明圈透明圈的菌落的菌落 挑取产生挑取产生明显的透明圈的菌落，明显的透明圈的菌落，一般即一般即为分解纤维素的菌落。为分解
10、纤维素的菌落。接种到接种到纤维素分解菌的纤维素分解菌的选择选择培养培养基上，在基上，在30300 0C C37370 0C C培养，可获得纯培养，可获得纯培养。培养。刚果红染色法：刚果红染色法：在在长出菌落长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度的培养基上，覆盖质量浓度为的为的1mg/mlCR溶液，溶液，10-15min后，后，倒倒去去CR溶液，溶液，加入加入物质的量浓度为物质的量浓度为1mol/lNaCl的溶液，的溶液，15min后倒掉溶液，后倒掉溶液，此时此时产生纤维素酶的菌落产生纤维素酶的菌落周围出现周围出现透明透明圈圈。方法一：方法一：先培养先培养微生物，微生物，再加入再加入刚果红进刚果红进行
11、颜色反应行颜色反应配置质量浓度为配置质量浓度为10mg/ml的的CR溶液，灭溶液，灭菌后，按照每菌后，按照每200ml培养基加入培养基加入1ml比比例例加入加入CR溶液，混匀后溶液，混匀后倒平板倒平板。等培。等培养基上出菌落后，产生纤维素酶的菌落养基上出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈。周围将会出现明显的透明圈。方法二：在方法二：在倒平板倒平板时就加入刚果红时就加入刚果红NaCl溶液的作用：溶液的作用：漂洗作用漂洗作用，洗去与纤维素结合不牢，洗去与纤维素结合不牢的刚果红，以免出现的透明圈不够的刚果红，以免出现的透明圈不够清晰。清晰。方法一（后加刚果红）：方法一（后加刚果红）：
12、优点：优点：方法二（前加前刚果红）：方法二（前加前刚果红）：显示出颜色反应基本上是纤维素分显示出颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用解菌的作用缺点：缺点：操作繁琐，加入刚果红会使菌落操作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂之间发生混杂操作简便，不存在菌落混杂问题操作简便，不存在菌落混杂问题缺点：缺点：优点：优点：四、操作提示四、操作提示1、本课题中涉及的生物技术主要有：、本课题中涉及的生物技术主要有：培养基的配置、无菌操作技术、培养基的配置、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基稀释涂布平板法、选择培养基的作用，土壤取样的作用，土壤取样2、选择培养的操作方法、选择培养的操作方法五、结果分析与评
13、价五、结果分析与评价2、培养基制作合格：、培养基制作合格：未接种的培养基在培养过程中没有未接种的培养基在培养过程中没有菌落生长，则说明培养基制作合格。菌落生长，则说明培养基制作合格。选择培养基筛选出菌落：选择培养基筛选出菌落：实验组培养基上，若观察到产生透明圈的实验组培养基上，若观察到产生透明圈的菌落，则说明可能是纤维素分解菌。菌落，则说明可能是纤维素分解菌。3 3、分离的结果是否一致、分离的结果是否一致由于在土壤中细菌的数量远由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。因此最容易分离得到的是细菌。但但由于所取土样的环境不同由于所取土
14、样的环境不同，不同同学也可能得到真菌和放不同同学也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。线菌等不同的分离结果。原因：形成的菌落若跟其他菌落混杂，原因：形成的菌落若跟其他菌落混杂，产生透明圈的菌落产生透明圈的菌落也可能是也可能是产生淀粉酶产生淀粉酶的微生物的微生物，还可能是，还可能是降解刚果红的菌种降解刚果红的菌种形成的形成的，本课题对分解纤维素的微生物本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选，但是这只是分离纯进行了初步的筛选，但是这只是分离纯化的第一步。为确定得到的是纤维素分化的第一步。为确定得到的是纤维素分解菌，解菌，因此需进一步鉴定。因此需进一步鉴定。在刚果红培养基上在刚果红培养基上出现
15、透明圈出现透明圈，该透，该透明圈明圈一定一定是由是由纤维素分解菌纤维素分解菌形成吗？形成吗？不一定。不一定。六、六、鉴定鉴定纤维素分解菌纤维素分解菌 需要进行需要进行发酵产纤维素酶发酵产纤维素酶的实验（的实验（通过通过微生物微生物发酵发酵，看能否，看能否产生纤维素酶。产生纤维素酶。若发若发酵物中有纤维素酶，则菌种是纤维素分解酵物中有纤维素酶，则菌种是纤维素分解菌菌）发酵的方法分为发酵的方法分为固体发酵固体发酵和和液体发酵液体发酵。1、鉴定原理、鉴定原理：2、鉴定方法：、鉴定方法：采用对采用对纤维素酶纤维素酶分解滤纸等分解滤纸等纤维素纤维素后所产后所产生的生的葡萄糖葡萄糖进行定量的测定，来鉴定纤
16、维进行定量的测定，来鉴定纤维素酶的产生。素酶的产生。因为因为葡萄糖葡萄糖在在50600 0C C的的Cu(OH)2溶液溶液中加热中加热1-2 min，可形成，可形成砖红色沉淀砖红色沉淀，以此，以此判断微生物是否产生纤维素酶将纤维素分判断微生物是否产生纤维素酶将纤维素分解成葡萄糖。解成葡萄糖。分解分解纤维纤维素的素的微生微生物的物的分离分离纤维素酶纤维素酶种类、作用、催化活力种类、作用、催化活力刚果红染色刚果红染色筛选原理筛选原理实实验验设设计计土壤取样土壤取样选择培养选择培养涂布培养涂布培养纯化培养纯化培养前置染色法前置染色法后置染色法后置染色法富含纤维素土壤富含纤维素土壤增大分解菌含量增大分解菌含量染色鉴别染色鉴别分离出分解菌分离出分解菌课堂总结课堂总结
