1、 转基因动物转基因动物 Transgenic animal 1980年年Gordon首次获得了转基因小鼠；首次获得了转基因小鼠；1982年年Palmiter将大鼠生长将大鼠生长激素基因导入小鼠胚胎，得到生长速度快激素基因导入小鼠胚胎，得到生长速度快2至至4倍，个体比同类大一倍的倍，个体比同类大一倍的“超级小鼠超级小鼠”。这一研究结果，说明通过对性细胞的操作，可以有效地将。这一研究结果，说明通过对性细胞的操作，可以有效地将外源基因导入动物的基因组内，并能使之表达，产生相应的生理效应。外源基因导入动物的基因组内，并能使之表达，产生相应的生理效应。标志了人为地改变动物经济和遗传性状成为可能，开创了生
2、命科学中新标志了人为地改变动物经济和遗传性状成为可能，开创了生命科学中新的研究领域。的研究领域。生命科学中一个多生命科学中一个多层次、多侧面、四层次、多侧面、四维的研究体系。维的研究体系。继连锁分析、体细胞遗继连锁分析、体细胞遗传、传、DNA重组之后，遗重组之后，遗传学中的第四代技术。传学中的第四代技术。具有形成新兴产业具有形成新兴产业的开发前景和潜能。的开发前景和潜能。转基因动物转基因动物 Transgenic animal 转基因动物是指应用生物工程技术培育的、转基因动物是指应用生物工程技术培育的、含在基因组内稳定地整合、并能遗传的外源基因含在基因组内稳定地整合、并能遗传的外源基因或特定或
3、特定DNA片段的动物片段的动物。反转录病毒基因转染反转录病毒基因转染 法法 反转录病毒反转录病毒(retrovirus,RV)是是RNA病毒，含两条病毒，含两条RNA，进入细胞后，反转录，进入细胞后，反转录成双链成双链DNA，通过，通过DNA进行复制。己有几种哺乳类和禽类的反转录病毒，作为进行复制。己有几种哺乳类和禽类的反转录病毒，作为转基因载体转基因载体(复制缺陷型和复制互补型复制缺陷型和复制互补型)。将外源基因与反转录病毒的原病毒重组，与细胞或胚胎共培养，通过感染将外将外源基因与反转录病毒的原病毒重组，与细胞或胚胎共培养，通过感染将外源基因转导到载体细胞的常染色体或性染色体上。这一过程都是
4、由病毒编码的酶源基因转导到载体细胞的常染色体或性染色体上。这一过程都是由病毒编码的酶所介导的所介导的。优点优点:单拷贝基因导入且转导效率高，可达单拷贝基因导入且转导效率高，可达100%；整合常发生在病毒基因片段；整合常发生在病毒基因片段上，宿主基因不会被破坏；整合受病毒基因插入机制控制，不易发生大的突变；上，宿主基因不会被破坏；整合受病毒基因插入机制控制，不易发生大的突变；单一位点整合，易分析插入位点；单一位点整合，易分析插入位点；缺点缺点:经嵌合体途径，实验周期长；转导基因不能超过经嵌合体途径，实验周期长；转导基因不能超过10kb；不安全。在外源；不安全。在外源基因整合的同时，病毒基因也被整
5、合到宿主染色体上，造成野生型病毒污染，有基因整合的同时，病毒基因也被整合到宿主染色体上，造成野生型病毒污染，有突变成新病毒及激活致癌原基因的可能。突变成新病毒及激活致癌原基因的可能。胚胎干细胞转移基因转移胚胎干细胞转移基因转移 法法应用胚胎干细胞进行基因转导，不仅整合率较高，并能在细胞水平应用胚胎干细胞进行基因转导，不仅整合率较高，并能在细胞水平对外源基因的表达载体进研究筛选，结合相关技术手段，能实现定对外源基因的表达载体进研究筛选，结合相关技术手段，能实现定点操作，比如基因剔除点操作，比如基因剔除(gene knockout)、基因置换、基因置换(gene knockin)。胚胎干细胞胚胎干
6、细胞(Embryonic Stem Cell，简称，简称ES细胞细胞)是从哺乳动物早是从哺乳动物早期胚胎的内细胞团中分离的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持期胚胎的内细胞团中分离的一种二倍体细胞，可在体外培养并保持全能分化的潜能，如给予适当环境即可形成胚系集落。全能分化的潜能，如给予适当环境即可形成胚系集落。因此，胚胎干细胞经转染并鉴定后，移植到哺乳动物正常发育的囊因此，胚胎干细胞经转染并鉴定后，移植到哺乳动物正常发育的囊胚腔内，再将囊胚植入假孕动物子宫中，可产生嵌合体动物。转化胚腔内，再将囊胚植入假孕动物子宫中，可产生嵌合体动物。转化的细胞在嵌合体中能分化发育成为全能的生殖细胞，经简单的杂交
7、的细胞在嵌合体中能分化发育成为全能的生殖细胞，经简单的杂交繁育即可得到携带外源基因的纯合转基因动物。繁育即可得到携带外源基因的纯合转基因动物。但获得哺乳动物胚胎干细胞的克隆株系具有相当的难度。目前，该但获得哺乳动物胚胎干细胞的克隆株系具有相当的难度。目前，该方法仅在转基因小鼠的研究中应用较为成熟。方法仅在转基因小鼠的研究中应用较为成熟。以精子作为基因的裁体制作转基因动物以其简单、高效、以精子作为基因的裁体制作转基因动物以其简单、高效、广泛适用的特点引起众多的科学家的广泛兴趣，大量实验证实，广泛适用的特点引起众多的科学家的广泛兴趣，大量实验证实，精子能够吸附外源精子能够吸附外源DNA，而且大多数
8、被吸附的外源，而且大多数被吸附的外源DNA位于位于精子头部的赤道段和顶体后区，精子这种吸附精子头部的赤道段和顶体后区，精子这种吸附DNA的能力不是的能力不是简单的物理过程而是由精子头部蛋白所介导的。简单的物理过程而是由精子头部蛋白所介导的。极少数极少数DNA能够穿入精子核区，这部分能够穿入精子核区，这部分DNA在核区内有的在核区内有的被降解；有的以附加体形式存在于基因组之外，只有极少数能被降解；有的以附加体形式存在于基因组之外，只有极少数能够整合到基因组上，而且这种整合不是随机发生的。够整合到基因组上，而且这种整合不是随机发生的。虽然精子吸附外源基因，通过体外受精或人工授精的途径虽然精子吸附外
9、源基因，通过体外受精或人工授精的途径制作转基因动物的阳性结果和阴性结果的报道时有发表，但是制作转基因动物的阳性结果和阴性结果的报道时有发表，但是这些实验之间转基因效率差异极大，而且未能获得足够的数据这些实验之间转基因效率差异极大，而且未能获得足够的数据对这一差异提供解释，对这一差异提供解释，没有从理论上阐明精子携带外源基因入卵的机制，也没有建没有从理论上阐明精子携带外源基因入卵的机制，也没有建立一套可重复性的稳定的制作转基因动物技术路线。立一套可重复性的稳定的制作转基因动物技术路线。精子载体法转基因子子子子应用显微注射法制备转基因动物的技术路线应用显微注射法制备转基因动物的技术路线 超数排卵超
10、数排卵手术法回收受精卵手术法回收受精卵 原核期受精卵原核期受精卵 雄性原核雄性原核 胚胎移植胚胎移植 产仔产仔 外源基因外源基因 显微注射显微注射 受体母猪受体母猪 同步发情同步发情假孕母猪假孕母猪每微升约含每微升约含1000个拷贝基因个拷贝基因离心是显示离心是显示原核有效的原核有效的方法方法外径外径1-2微米玻璃微米玻璃微针，向原核注微针，向原核注入入1-2微升微升配种后配种后18-24小时，小时，输卵管回收输卵管回收移植至同步化处理移植至同步化处理的受体输卵管内的受体输卵管内人类疾病人类疾病动物模型动物模型 特有性状的特有性状的经济动物经济动物 动 物 生动 物 生物反应器物反应器异种器异
11、种器官移植官移植 转基因动物转基因动物 Transgenic animal 动物模型动物模型(转基因鼠转基因鼠)由于小鼠与人类基因具有很高的同源性，且遗传背景清由于小鼠与人类基因具有很高的同源性，且遗传背景清晰，因此含有人类致病基因的转基因小鼠所表现的症状，与晰，因此含有人类致病基因的转基因小鼠所表现的症状，与人类相应疾病具有很高程度的可比性和真实性。人类相应疾病具有很高程度的可比性和真实性。同时，转基因小鼠通过对外源基因的操作，能从分子、同时，转基因小鼠通过对外源基因的操作，能从分子、蛋白、细胞、生理、遗传等不同水平，直接研究外源基因在蛋白、细胞、生理、遗传等不同水平，直接研究外源基因在个体
12、内的动态表现，能精确地检测到一个遗传改变所发生的个体内的动态表现，能精确地检测到一个遗传改变所发生的效应效应,四维的研究体系四维的研究体系。转基因经济动物转基因经济动物 受受“超级小鼠超级小鼠”的启发，人们希望通过转移和表达适当的基因，的启发，人们希望通过转移和表达适当的基因，进行转基因育种，就可以培育出生长快、节省饲料和抗病的经济动进行转基因育种，就可以培育出生长快、节省饲料和抗病的经济动物，使畜牧业和水产养殖业的效益成倍提高。物，使畜牧业和水产养殖业的效益成倍提高。已获得整合有生长激素（已获得整合有生长激素（GH）、生长激素释放因子（）、生长激素释放因子（GRF）、）、肌肉生长刺激因子（肌
13、肉生长刺激因子（cSK1）及能提高羊毛质量、牛奶产量等外源）及能提高羊毛质量、牛奶产量等外源基因的转基因家畜。其中含有基因的转基因家畜。其中含有GH的转基因猪己稳定地的遗传了五的转基因猪己稳定地的遗传了五个世代，其血液中个世代，其血液中GH均保持较高浓度，虽个体不比同胞更大，但均保持较高浓度，虽个体不比同胞更大，但体重增长较快，料肉转化率提高体重增长较快，料肉转化率提高17%，背膘厚度从，背膘厚度从18.51.8毫米毫米下降到下降到7.01.8毫米；毫米；因此，在转基因育种方面尚有待新技术、新理论的突破。因此，在转基因育种方面尚有待新技术、新理论的突破。但由于动物的经济性状但由于动物的经济性状
14、(如生长速度、瘦肉率、产蛋量等如生长速度、瘦肉率、产蛋量等)一般是由一般是由多个基因协调控制的，仅转移单个基因较难达到理想的效果。如整多个基因协调控制的，仅转移单个基因较难达到理想的效果。如整合有生长激素基因的猪和羊，其血液中的生长激素水平显著提高，合有生长激素基因的猪和羊，其血液中的生长激素水平显著提高，在表现出生长快、饲料省、瘦肉率高的同时，也存在体质普遍下降在表现出生长快、饲料省、瘦肉率高的同时，也存在体质普遍下降及有繁殖障碍等不良性状，难以推广应用。转基因鱼是个例外。及有繁殖障碍等不良性状，难以推广应用。转基因鱼是个例外。转入人医用蛋白基因转入人医用蛋白基因产出含医用蛋白的牛奶产出含医
15、用蛋白的牛奶 生物反应器 通过生物个体代替部份通过生物个体代替部份物理装置，以生物反应代物理装置，以生物反应代替部份化学反应，来生产替部份化学反应，来生产价值极高的蛋白质和多肽价值极高的蛋白质和多肽物质己为可能。人们将外物质己为可能。人们将外源基因的信息转变成蛋白源基因的信息转变成蛋白质的生物体质的生物体(通常分为植物、通常分为植物、动物两大类动物两大类)称为生物反应称为生物反应器器。Target protein expression vectorGoat beta casein DNATarget proteinDNAMeasuretarget proteinexpressionTransf
16、er into recipient femaleInducelactationTransgenic milk production herdTransgenic milkTest offspringfor transgeneMicroinjecttarget proteinvectorinto embryoIsolate fertilizedembryos乳腺生物乳腺生物反应器成功的反应器成功的基础和关键基础和关键异种外源基因整合的假说：外源基因整合的假说：注入的线性注入的线性DNA分子游离未端所诱导的修复酶分子游离未端所诱导的修复酶 可能引起染色体的随机断可能引起染色体的随机断裂，裂，DNA
17、未端与染色体断裂处之间相互作用使外源基因整合进基因组。未端与染色体断裂处之间相互作用使外源基因整合进基因组。整合特征：整合特征：非定点的随机整合非定点的随机整合 (DNA浓度、基因构型浓度、基因构型)染色体断裂的染色体断裂的概率决定了外源概率决定了外源基因的整合率。基因的整合率。染色体的断裂染色体的断裂处就是外源的整处就是外源的整合位点。合位点。特点：首尾串联、单一位点的多拷贝整合。特点：首尾串联、单一位点的多拷贝整合。引起插入、缺失、重复、易位等引起插入、缺失、重复、易位等 突变突变插入突变插入突变:a.致死致死 显性显性.隐性隐性;b.非致死非致死 表型畸变或不育表型畸变或不育 提高整合率
18、、实现定点整合就成为转基因动物研提高整合率、实现定点整合就成为转基因动物研究的关键环节。究的关键环节。外源基因构建及转导的研究动向外源基因构建及转导的研究动向1.导入较完整的基因而不是导入较完整的基因而不是cDNA，是获得高效表达的有效途径，是获得高效表达的有效途径2.考虑与表达相关的调控元件考虑与表达相关的调控元件启动子启动子(Promotor)启动子是一启动子是一DNA段，其典型结构应包括段，其典型结构应包括mRNA帽子位点，该位点是帽子位点，该位点是mRNA转录体实际开始的地方。指导目的基因进行转录的启动子类型是决定转录体实际开始的地方。指导目的基因进行转录的启动子类型是决定外源基因在体
19、内能否稳定表达及表达率高低的关键因素。外源基因在体内能否稳定表达及表达率高低的关键因素。在转基因动物研究中一般采用二类启动子。在转基因动物研究中一般采用二类启动子。多种组织细胞中表达：如多种组织细胞中表达：如MT(金属硫蛋白金属硫蛋白)启动子启动子 专一组织细胞中表达：如专一组织细胞中表达：如BLG(羊羊-乳球蛋白乳球蛋白)启动子启动子内含子内含子(Intron)在原核生物中表达，内含子的存在似乎并无意义，这是因为原核生物缺乏在原核生物中表达，内含子的存在似乎并无意义，这是因为原核生物缺乏基因拼接等功能。但在转基因动物中，内含子的存在却可以增加基因的表达。基因拼接等功能。但在转基因动物中，内含
20、子的存在却可以增加基因的表达。如大鼠生长激素基因的第一内含子对其表达是必需的。如大鼠生长激素基因的第一内含子对其表达是必需的。目前在许多内含子中均发现了基因表达的增强元件。并已证实内含子能通目前在许多内含子中均发现了基因表达的增强元件。并已证实内含子能通过对转录、剪切的调控，及与增强子的协同作用影响基因的表达。过对转录、剪切的调控，及与增强子的协同作用影响基因的表达。增强子增强子(Enhaner)宿主细胞中的调节信号并非只是位于外源基因端的启动子。位于较远宿主细胞中的调节信号并非只是位于外源基因端的启动子。位于较远距离的增强子也能对基因表达起增强作用。许多研究己表明，在任何一个距离的增强子也能
21、对基因表达起增强作用。许多研究己表明，在任何一个分化类型的细胞中，表达的基因都可能有许多增强子参予；而基因在多个分化类型的细胞中，表达的基因都可能有许多增强子参予；而基因在多个部位部位表达时，每个表达部位都有自己的增强子。表达时，每个表达部位都有自己的增强子。转基因的转基因的“援救援救”将不同基因或不同构建同时注射到同一受精卵中而建立的转基因动物。不将不同基因或不同构建同时注射到同一受精卵中而建立的转基因动物。不同的基因构建以首尾相连的形式整合，在某种程度上形成一个相对独立的区同的基因构建以首尾相连的形式整合，在某种程度上形成一个相对独立的区域，或形成一个开放的染色体活性区域。如以生长激素基因
22、与肠道脂肪酸结域，或形成一个开放的染色体活性区域。如以生长激素基因与肠道脂肪酸结合蛋白基因共注射，转基因表达提高合蛋白基因共注射，转基因表达提高60%。转基因的体内重组：转基因的体内重组：将大片段将大片段DNA克隆成具有部分重复序列的较小的克隆成具有部分重复序列的较小的DNA片段，而后共注射，通片段，而后共注射，通过染色体外同源重组，得到大基因组过染色体外同源重组，得到大基因组DNA。如将人血清白蛋白克隆成三个片。如将人血清白蛋白克隆成三个片段，进行共注射，段，进行共注射，74%的小鼠整合有完整的转基因，并表达。的小鼠整合有完整的转基因，并表达。酵母人工染色体酵母人工染色体(yeast art
23、ificial chromosome YAC)是近年新发展的新型载体。能克隆大片段的外源基因。在转基因过程中能保是近年新发展的新型载体。能克隆大片段的外源基因。在转基因过程中能保证基因完整性，保证所有顺式因子的完整与结构基因的位置关系不变。因基证基因完整性，保证所有顺式因子的完整与结构基因的位置关系不变。因基因的完整性，其上下游的侧翼序列可以消除或减弱因的完整性，其上下游的侧翼序列可以消除或减弱“位置效应位置效应”，提高表达。，提高表达。核基质附着区核基质附着区(nuclear matrix attachment region,MAR)MAR是具有一定的结构和功能的基因元件是具有一定的结构和功
24、能的基因元件(鸡溶菌酶鸡溶菌酶“A”元件元件)。MAR能能激活转录并与核基质分子有较高的亲和力，它以一个特定的模式将外源基因激活转录并与核基质分子有较高的亲和力，它以一个特定的模式将外源基因以颈环的方式与周围结构区隔绝开，形成独特的位置，独立的表达方式。现以颈环的方式与周围结构区隔绝开，形成独特的位置，独立的表达方式。现认为认为MAR的进一步研究，将为外源基因的应位整合和表达带来突破性进展。的进一步研究，将为外源基因的应位整合和表达带来突破性进展。克隆动物概述克隆动物概述在实践上证明了利用体细胞进行动物在实践上证明了利用体细胞进行动物克隆的技术的可行性。为大规模复制克隆的技术的可行性。为大规模
25、复制动物优良品种和生产转基因动物提供动物优良品种和生产转基因动物提供了有效方法。了有效方法。1997 年年2 月月,英国罗斯林研究所宣布英国罗斯林研究所宣布,用用6岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行岁成年羊的高度分化的乳腺细胞进行了核移植了核移植,成功地获得了克隆羊成功地获得了克隆羊“多莉多莉”。这是生物技术史上具有划时代意义的重这是生物技术史上具有划时代意义的重大突破大突破,是克隆技术的一个里程碑。是克隆技术的一个里程碑。在理论上证明了，同植物细胞一样，在理论上证明了，同植物细胞一样，高度分化的成年动物的体细胞可在适高度分化的成年动物的体细胞可在适当条件下恢复发育成个体的全能性；当条件下恢复发
26、育成个体的全能性；主主要要内内容容F 一一 克隆动物的生理基础克隆动物的生理基础F 二二 体细胞克隆的方法体细胞克隆的方法F 三三 体细胞克隆的历史与现状体细胞克隆的历史与现状 F 四四 克隆技术的应用克隆技术的应用F 五五 克隆技术存在的问题克隆技术存在的问题 目前，生产哺乳动物克隆的方法主要目前，生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种。有胚胎分割和细胞核移植两种。所谓细胞核移植，是指将不同发育时期所谓细胞核移植，是指将不同发育时期的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术的胚胎或成体动物的细胞核，经显微手术或细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，或细胞融合方法移植到去核卵母细胞中，重新
27、组成胚胎并使之发育成熟的过程。重新组成胚胎并使之发育成熟的过程。直接切割直接切割分离分离卵裂球卵裂球体外培养体外培养移植移植一卵多生一卵多生供体细胞供体细胞 卵母细胞培养卵母细胞培养 重构胚胎重构胚胎 细胞培养细胞培养 成熟卵母细胞成熟卵母细胞 电融合电融合 化学激活化学激活 胚胎体外培养胚胎体外培养 胚胎移植胚胎移植 核移植核移植 去去 核核 去核去核MM期卵母细胞期卵母细胞 用甘露醇融合液电融合用甘露醇融合液电融合 用山梨醇用山梨醇融合液融合液电融合电融合 离子霉素放线菌离子霉素放线菌 酮激活处理酮激活处理钙离子载体钙离子载体放线放线 菌酮菌酮激活处理激活处理 一胞期重构胚胎一胞期重构胚胎
28、 成纤维细胞成纤维细胞 卵丘细胞、卵丘细胞、乳腺细胞乳腺细胞 屠宰场获屠宰场获 取卵巢取卵巢调整细胞调整细胞 周期周期克隆后代克隆后代 1998 年年5 月月,美国科学家的研究组利用牛美国科学家的研究组利用牛胎儿成纤胎儿成纤维细胞维细胞克隆出了克隆出了3 头牛头牛,而且携带了转移的基因。而且携带了转移的基因。1998 年年7 月月,日本科学家用牛的日本科学家用牛的输卵管细胞输卵管细胞克隆出了克隆出了8 头小牛。头小牛。1998年年7月，美国夏威夷大学由小鼠月，美国夏威夷大学由小鼠卵丘细胞克隆卵丘细胞克隆了了27只成活小鼠。只成活小鼠。此后此后,同种体细胞克隆出的山羊、猪、马、猴、猫、同种体细胞
29、克隆出的山羊、猪、马、猴、猫、兔和犬也都相继诞生。兔和犬也都相继诞生。1999 年和年和2002年年,我国体细胞克隆山羊和克隆牛也我国体细胞克隆山羊和克隆牛也都获得成功。都获得成功。已有下列类型的供体细胞用于牛核移植已有下列类型的供体细胞用于牛核移植 这些现象发生可能的原因涉及到核的再程序化的错误、移这些现象发生可能的原因涉及到核的再程序化的错误、移植前胚胎培养的损伤及一些核移植过程中本身还不确定的因素。植前胚胎培养的损伤及一些核移植过程中本身还不确定的因素。在核的再程序化中发生的很重要的分子事件即是一些印记及在核的再程序化中发生的很重要的分子事件即是一些印记及非印记基因再程序化，这些再程序化
30、能否正常进行关系到胚胎发非印记基因再程序化，这些再程序化能否正常进行关系到胚胎发育过程中这些基因能否正常及时序性表达。育过程中这些基因能否正常及时序性表达。细胞周期与核的再程序化的关系。核质的互作与协调是所细胞周期与核的再程序化的关系。核质的互作与协调是所有细胞正常活动的基础有细胞正常活动的基础,核移植克隆胚二倍体核型的维持及基因核移植克隆胚二倍体核型的维持及基因组再程序化的正常完成，也取决于供体核与受体卵母细胞质之组再程序化的正常完成，也取决于供体核与受体卵母细胞质之间的同步协调和相互作用。间的同步协调和相互作用。技术技术伦理伦理与与几个热点高产奶牛卵母细胞活体采集体外授精技术高产奶牛卵母细
31、胞活体采集体外授精技术超声波卵超声波卵巢定位巢定位直肠把握卵巢穿直肠把握卵巢穿刺吸取卵母细胞刺吸取卵母细胞体外成熟、体体外成熟、体外授精、培养外授精、培养间隔间隔10-15天采集一次天采集一次(可用可用4-7枚枚);除产前二个月外其除产前二个月外其余均可采集余均可采集;操作者因素、需一定仪器设备操作者因素、需一定仪器设备;性别胚胎体外工厂化生产性别胚胎体外工厂化生产X、Y分离精子分离精子 体外成熟卵母细胞体外成熟卵母细胞 体外授精体外授精 特定性别胚胎特定性别胚胎 可冷冻保存可冷冻保存;准确率准确率95%进口性别冻胚产犊率进口性别冻胚产犊率20-35%可以显微辅助授精可以显微辅助授精所需剂量少所需剂量少 动物体细胞培养动物体细胞培养 动物卵母细胞动物卵母细胞 外源基因的转导外源基因的转导 体外成熟培养体外成熟培养 筛筛 选选 取取 核核 去去 核核 整合外源基因的细胞核整合外源基因的细胞核 装配装配 无核卵母细胞无核卵母细胞移植产仔移植产仔 转基因体细胞克隆动物转基因体细胞克隆动物节约成本节约成本提高阳性提高阳性率率
