1、第第 五五 章章 分子生物学基本研究法分子生物学基本研究法（上）（上）DNA、RNA及蛋白质操作技术及蛋白质操作技术编辑ppt编辑ppt重组重组DNADNA操作过程示意图操作过程示意图编辑pptGregor Mendel(1822-1884).The Father of Genetics编辑ppt编辑ppt编辑ppt编辑ppt编辑ppt现代分子生物学的快速发展，得益于上个世现代分子生物学的快速发展，得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。因工程技术的进步。基因操作主要包括基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、分子的切割与连接、
2、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增扩增等，是分子生物学研究的核心技术。等，是分子生物学研究的核心技术。编辑ppt基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。该技术是核酸操作行持续稳定的繁殖和表达。该技术是核酸操作的一部分，只不过它强调了外源核酸分子在另的一部分，只不过
3、它强调了外源核酸分子在另一种寄主细胞中的繁衍与表达。一种寄主细胞中的繁衍与表达。编辑ppt事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基因置于新的生物细胞之中的能力，是物的基因置于新的生物细胞之中的能力，是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。基因工程技术区别于其它技术的根本特征。DNA操作技术操作技术基因克隆的常用载体系统基因克隆的常用载体系统基因的分离与鉴定基因的分离与鉴定编辑ppt5.1 5.1 重组重组DNADNA技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件三大成就：三大成就：一、在一、在2020世纪世纪4040年代确定了遗传信息的携年代确定了遗传信
4、息的携带者、即基因的分子载体是带者、即基因的分子载体是DNADNA而不是蛋白而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题；质，解决了遗传的物质基础问题；二、二、5050年代提出了年代提出了DNADNA分子的双螺旋结构模分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制型和半保留复制机制,解决了基因的自我复解决了基因的自我复制和世代交替问题；制和世代交替问题；编辑ppt三、三、5050年代末至年代末至6060年代，相继提出了年代，相继提出了“中心法中心法则则”和操纵子学说和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐成功地破译了遗传密码，阐明了遗传信息的流动与表达机制。明了遗传信息的流动与表达机制。编辑ppt表表5-15-
5、1重组重组DNADNA技术史上的主要事件技术史上的主要事件年年 份份事事 件件1869F Miescher首次从莱茵河鲑鱼精子中分离首次从莱茵河鲑鱼精子中分离DNA。1957A.Kornberg从大肠杆菌中发现了从大肠杆菌中发现了DNA聚合酶聚合酶I。1959-1960Ochoa发现发现RNA聚合酶和信使聚合酶和信使RNA，并证明，并证明mRNA决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。决定了蛋白质分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破译了第一个遗传密码；破译了第一个遗传密码；Jacob和和Monod提出了调节基因表达的操纵子模型。提出了调节基因表达的操纵子模型。1964Yanofsky和和B
6、renner等人证明，多肽链上的氨基酸等人证明，多肽链上的氨基酸序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。序列与该基因中的核苷酸序列存在着共线性关系。1965Holley完成了酵母丙氨酸完成了酵母丙氨酸tRNA的全序列测定；科的全序列测定；科学家证明细菌的抗药性通常由学家证明细菌的抗药性通常由“质粒质粒”DNA所决所决定。定。编辑ppt1966Nirenberg，Ochoa，Khorana，Crick等人破译了全部遗传密等人破译了全部遗传密码。码。1967第一次发现第一次发现DNA连接酶连接酶1970Smith，Wilcox和和Kelley分离了第一种限制性核酸内切酶，分离了第一种限制性核酸
7、内切酶，Temin和和Baltimore从从RNA肿瘤病毒中发现反转录酶。肿瘤病毒中发现反转录酶。1972-1973Boyer，Berg等人发展了等人发展了DNA重组技术，于重组技术，于72年获得第年获得第一个重组一个重组DNA分子，分子，73年完成第一例细菌基因克隆。年完成第一例细菌基因克隆。1975-1977Sanger与与Maxam和和Gilbert等人发明了等人发明了DNA序列测定技术，序列测定技术，1977年完成了全长年完成了全长5387bp的噬菌体的噬菌体174基因组测定。基因组测定。1978首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表达的人脑激素和人胰首次在大肠杆菌中生产由人工合成基因表
8、达的人脑激素和人胰岛素。岛素。1980美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。美国联邦最高法院裁定微生物基因工程可以被专利化。1981Palmiter和和Brinster获得转基因小鼠，获得转基因小鼠，Spradling和和Rubin得到得到转基因果蝇。转基因果蝇。1982美、英批准使用第一例基因工程药物美、英批准使用第一例基因工程药物胰岛素，胰岛素，Sanger等人等人完成了入噬菌体完成了入噬菌体48,502bp全序列测定。全序列测定。编辑ppt1983获得第一例转基因植物。获得第一例转基因植物。1984斯坦福大学获得关于重组斯坦福大学获得关于重组DNA的专利。的专利。1986GMO
9、首次在环境中释放。首次在环境中释放。1988Watson出任出任“人类基因组计划人类基因组计划”首席科学家。首席科学家。1989DuPont公司获得转肿瘤基因小鼠公司获得转肿瘤基因小鼠“Oncomouse”。1992欧共体欧共体35个实验室联合完成酵母第三染色体全序个实验室联合完成酵母第三染色体全序列测定列测定(315kb)。1994第一批基因工程西红柿在美国上市。第一批基因工程西红柿在美国上市。1996完成了酵母基因组完成了酵母基因组(1.25107bp)全序列测定。全序列测定。1997英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。英国爱丁堡罗斯林研究所获得克隆羊。2000完 成 第 一 个 高 等 植
10、 物 拟 南 芥 的 全 序 列 测 定完 成 第 一 个 高 等 植 物 拟 南 芥 的 全 序 列 测 定（(1.15108bp)。2001完成第一个人类基因组全序列测定完成第一个人类基因组全序列测定(2.7109bp)。编辑ppt限制性核酸内切酶能够识别限制性核酸内切酶能够识别DNA上的特定碱上的特定碱基序列并从这个位点切开基序列并从这个位点切开DNA分子。分子。第一个核酸内切酶第一个核酸内切酶EcoRI是是Boyer实验室在实验室在1972年发现的，它能特异性识别年发现的，它能特异性识别GAATTC序序列，将双链列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生分子在这个位点切开并产生具有粘性末
11、端的小片段。具有粘性末端的小片段。编辑ppt图图5-1 几种主要几种主要DNA内切酶所识别的序列及内切酶所识别的序列及其酶切末端其酶切末端。编辑ppt图图5-2 DNA连接酶能把不同的连接酶能把不同的DNA片段连接成一个整体片段连接成一个整体 编辑ppt体外利用限制性核酸内切酶和体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进连接酶进行行DNA的切割和重组以后，还要将它们连接的切割和重组以后，还要将它们连接到具备自主复制能力的到具备自主复制能力的DNA分子上，才能在分子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。寄主细胞中进行繁殖。具备自主复制能力的具备自主复制能力的DNA分子就是分子克隆分子就是分子克隆的载体（的
12、载体（vector）。病毒、噬菌体和质粒等）。病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都是基因导入的载体。小分子量复制子都是基因导入的载体。编辑ppt获得了用外源获得了用外源DNA片段和载体分子重组而成片段和载体分子重组而成的杂种的杂种DNA分子后，还必须通过一个被称为分子后，还必须通过一个被称为细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，细菌转化的过程将其重新导入到寄主细胞中，才能保证重组才能保证重组DNA分子的增殖（图分子的增殖（图5-3）。）。编辑ppt图图5-3 重组重组DNA操作过程示意图操作过程示意图 编辑ppt5.2 DNA操作技术操作技术5.2.1核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳自从琼脂糖（
13、自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。与核酸相互作用的重要实验手段。琼脂，琼脂糖，聚丙烯酰胺，核酸，蛋白质？琼脂，琼脂糖，聚丙烯酰胺，核酸，蛋白质？编辑ppt 基基 本本 原原 理理一种分子被放置到电场中，会以一定的速度移一种分子被放置到电场中，会以一定的速度移向向适当的电极适当的电极，把这种电泳分子在电场作用下，
14、把这种电泳分子在电场作用下的迁移的迁移速度速度，叫做电泳的，叫做电泳的迁移率迁移率。它与电场强。它与电场强度和电泳分子本身所携带的度和电泳分子本身所携带的净电荷净电荷数成正比，数成正比，与片段大小成反比。与片段大小成反比。编辑ppt生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子生理条件下，核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态，所以，化状态，所以，DNA和和RNA又被称为多聚阴又被称为多聚阴离子（离子（polyanions），在电场中向正电极的），在电场中向正电极的方向迁移。方向迁移。由于糖由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷
15、（几乎具有等量的净电荷（电电荷密度荷密度），因此它们能以同样的速度向正电），因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。极方向迁移。编辑ppt琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为片段的范围为0.250kb之间。之间。聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到到1000个碱基个碱基对之间。对之间。凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强，度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强，越适越适合分离小分子量的分子。合分离小分子量的分子。编辑ppt表表5-3 琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA
16、片片段的能力段的能力 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度 分离分离DNA的大小范围（的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 501编辑ppt图图5-4 5-4 溴化乙锭溴化乙锭染料的化学结构染料的化学结构及其对及其对DNADNA分子的分子的插入作用。由于插入作用。由于插入了溴化乙锭插入了溴化乙锭分子，在紫外光分子，在紫外光照射下，琼脂糖照射下，琼脂糖凝胶电泳中凝胶电泳中
17、DNADNA的的条带便呈现出橘条带便呈现出橘黄色荧光，易于黄色荧光，易于鉴定。鉴定。编辑ppt图图5-4 DNA脉冲电场凝胶电泳示意图脉冲电场凝胶电泳示意图 编辑ppt5.2.2 细菌转化与目标细菌转化与目标DNA分子的增殖分子的增殖通过细菌转化方法将体外构建好的杂种通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分分子导入宿主细胞中。外源子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中的复制起始点进行复制增殖，能在宿主细胞中长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被长期保存下来，并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。分离纯化出来。编辑ppt细菌转化（细
18、菌转化（transformation），是指一种细菌菌），是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状而导致性状特征发生遗传改变的过程。特征发生遗传改变的过程。为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，为提高效率，可对受体菌进行物理或化学处理，增加其获取增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞（被称作感受态细胞（competent cells）。）。编辑ppt图图5-5 细菌转化及蓝白斑筛选细菌转化及蓝白斑筛选 编辑pptCaCl2法法将快速生长期大肠杆菌置于经将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低预处理的低渗渗
19、CaCl2溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，溶液中，细胞膨胀，膜通透性改变，易与外源易与外源DNA相粘附。相粘附。将该体系转移到将该体系转移到42下做短暂的热刺激，外下做短暂的热刺激，外源源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。细胞置于选择性培养基上，筛选阳性克隆。转化效率可达到转化效率可达到51062107个转化子个转化子/g超螺旋质粒超螺旋质粒DNA。编辑ppt电击法电击法电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏电脉冲可以在细胞膜上造成小凹陷，形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞水孔洞。随着跨膜电压增加，大疏水性孔洞
20、会转变为亲水性孔洞，介质中的会转变为亲水性孔洞，介质中的DNA进入细进入细胞质。胞质。将生长至对数中期的将生长至对数中期的E.coli菌液冷却至菌液冷却至4后后离心，洗菌后用离心，洗菌后用10%的甘油悬浮，将高密度的甘油悬浮，将高密度菌液（菌液（21010/ml）置于特制的电极杯中进）置于特制的电极杯中进行电击。行电击。编辑ppt获 得 最 大 转 化 效 率 时 场 强 一 般 为获 得 最 大 转 化 效 率 时 场 强 一 般 为12.515kV/cm，时间跨度一般为，时间跨度一般为4.55.5毫毫秒。秒。电击转化与温度有关，一般在电击转化与温度有关，一般在04进行。进行。由于转化载体上
21、常带有由于转化载体上常带有LacZ基因，多用带有基因，多用带有不同抗生素（常用的抗生素包括氨苄青霉素、不同抗生素（常用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素等）的选择性培养基结合卡那霉素和四环素等）的选择性培养基结合-互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。互补蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。编辑ppt利用噬菌体颗粒能够有效地将利用噬菌体颗粒能够有效地将DNA注入到寄注入到寄主细胞中这一特点，科学家又发明了重组体主细胞中这一特点，科学家又发明了重组体DNA分子的体外包装法。分子的体外包装法。经包装的基因工程噬菌体颗粒能够借助细菌经包装的基因工程噬菌体颗粒能够借助细菌表面的噬菌体接受器位点将表面的噬菌体接受器
22、位点将DNA注入受体细注入受体细菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。菌，并在这些细胞中得到繁殖和表达。编辑ppt图图5-6 噬菌体作为克隆载体构建基因文库的噬菌体作为克隆载体构建基因文库的流程图流程图 编辑ppt5.2.3聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术聚合酶链式反应是快速扩增聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用序列最常用的方法。的方法。PCR反应的模板反应的模板DNA若若是基因组上的某个片是基因组上的某个片段，就称为段，就称为genomic PCR，若若是是mRNA，反，反转录产生的转录产生的cDNA，就称为，就称为RT-PCR。编辑pptPCR技术的原理技术的原理首先将
23、双链首先将双链DNA分子在临近沸点的温度下加热分子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链分离成两条单链DNA分子，分子，DNA聚合酶以单聚合酶以单链链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。互补链。编辑ppt DNA解链（变性）解链（变性）引物与模板引物与模板DNA相结合（退火）相结合（退火）DNA合成（链的延伸）三步。合成（链的延伸）三步。经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的经不断重复循环之后，反应混合物中所含有的双链双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间的分子数，即两条引物结合位点之间的DNA区段的
24、拷贝数，理论上的最高值应是区段的拷贝数，理论上的最高值应是2n。编辑ppt将含有待扩增将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高样品的反应混合物放置在高温（温（94）环境下加热）环境下加热1分钟，使双链分钟，使双链DNA变变性，形成单链模板性，形成单链模板DNA。降低反应温度（退火，约降低反应温度（退火，约50），约），约1分钟，分钟，使寡核苷酸引物与两条单链模板使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。区段两端的互补序列位置上。将反应混合物的温度上升到将反应混合物的温度上升到72左右保温左右保温1-数分数分钟，在钟，在DNA聚合酶的作用下，从引物的聚合
25、酶的作用下，从引物的3-端加端加入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按入脱氧核苷三磷酸，并沿着模板分子按53方向延伸，合成新生方向延伸，合成新生DNA互补链。互补链。编辑ppt图图5-16 聚合酶链式反应示意聚合酶链式反应示意图。（图。（a）起始材料，双链）起始材料，双链DNA；（；（b）反应混合物加）反应混合物加热后发生链分离，降温使引热后发生链分离，降温使引物结合到待扩增靶物结合到待扩增靶DNA区段区段两端的退火位点上；（两端的退火位点上；（c）Taq聚合酶以单链聚合酶以单链DNA为模为模板在引物的引导下利用反应板在引物的引导下利用反应混合物中的混合物中的dNTPs合成互补合成互补的新链的新链
26、DNA；（；（d）将反应）将反应混合物再次加热，使旧链和混合物再次加热，使旧链和新链分开；（新链分开；（e）合成新的互）合成新的互补链补链DNA；（；（f）重复）重复b；（g）重复）重复c、编辑ppt图图5-7 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）技术）技术 编辑ppt图图5-8 PCR指数扩增时指数扩增时循环次数与循环次数与DNA产物数产物数量的比较量的比较编辑ppt5.2.4 实时定量实时定量PCR（real time quantitative PCR，Q-PCR）由于由于PCR敏感性高，扩增产物总量变异系数敏感性高，扩增产物总量变异系数大，定量不准确。大，定量不准确。90年代末期出现
27、了年代末期出现了Q-PCR，利用荧光检测利用荧光检测PCR仪绘制仪绘制DNA扩增过程中的扩增过程中的累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产累积速率动态变化图，基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。物丰度时变异系数较大的问题。编辑ppt混合在混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片反应液中的荧光探针只有与大片段段DNA结合后，才能够被激发出荧光。结合后，才能够被激发出荧光。随着新合成随着新合成DNA片段的增加，由于结合到片段的增加，由于结合到DNA上的荧光探针增加，被激发产生的荧光上的荧光探针增加，被激发产生的荧光相应增加。相应增加。非序列特异性荧光染料非序列特异性荧光染料SYBR
28、Green I,激发激发光波长光波长520nm。编辑pptSYBR Green I作探针的实时作探针的实时定量定量PCR实验实验过程图示过程图示 编辑ppt为确保荧光检测的确实是靶为确保荧光检测的确实是靶DNA，又设计了，又设计了仅能与目的仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。特异结合的荧光探针。TaqMan探针是一段与靶探针是一段与靶DNA序列中间部位序列中间部位结合的单链结合的单链DNA，长，长50bp-150bp，该，该DNA的的5和和3端带有短波长和长波长两个不同荧端带有短波长和长波长两个不同荧光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能光基团，由于彼此距离靠近，在荧光共振能量转移（量转移（F
29、RET）作用下发生荧光淬灭，因）作用下发生荧光淬灭，因而检测不到荧光。而检测不到荧光。编辑ppt随着随着PCR反应的进行，反应的进行，TaqMan 探针结合到探针结合到目的目的DNA序列上，并且会被具有外切酶活性序列上，并且会被具有外切酶活性的的Taq DNA聚合酶逐个切除而降解。切下来聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚，会在激发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直发光下发出荧光，因此，产生的荧光强度直接反映了所扩增靶接反映了所扩增靶DNA的总量。的总量。编辑pptTaqMan探探针 实 时 定针 实 时 定量量 P C R 技技术
30、术 编辑ppt图图5-11用实时定量用实时定量PCR法分析未知样品靶基因法分析未知样品靶基因的绝对表达量。的绝对表达量。编辑pptCt值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，值是产物荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。利用标准曲线，可以反应所需的循环数。利用标准曲线，可以确定样品中待检测靶确定样品中待检测靶DNA的绝对含量。的绝对含量。编辑ppt5.2.5 基因组基因组DNA文库构建文库构建把某种生物的基因组把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆。汇集包含基因组中所有汇集包含基因组中所有
31、DNA序列的克隆（理序列的克隆（理论上每个序列至少有一个代表），这样的克论上每个序列至少有一个代表），这样的克隆片段的总汇，称为基因组隆片段的总汇，称为基因组DNA文库。文库。编辑pptClark和和Carbon于于1975年提出公式：年提出公式：N=ln(1-p)/ln(1-f)式中：式中：N表示一个基因组文库所应该包含的表示一个基因组文库所应该包含的重组克隆数目；重组克隆数目；p表示所期望的靶基因在文表示所期望的靶基因在文库中出现的概率；库中出现的概率；f表示重组克隆平均插入片表示重组克隆平均插入片段的长度与基因组段的长度与基因组DNA总长的比值。总长的比值。为获得整个基因簇或一个基因及其
32、两翼延伸为获得整个基因簇或一个基因及其两翼延伸序列，基因组文库中的序列，基因组文库中的DNA片段常大于片段常大于20kb。以人为例，其基因组大小为以人为例，其基因组大小为3109bp若若p=99%，平均插入片段大小为，平均插入片段大小为20kb，则，则N=6.7105。编辑ppt构建基因组文库最常用的是构建基因组文库最常用的是噬菌体载体（克噬菌体载体（克隆能力约隆能力约1520kb）和限制性内切酶部分消化）和限制性内切酶部分消化法。例如用法。例如用识别识别4个核苷酸个核苷酸的核酸限制性内切的核酸限制性内切酶酶Sau3A，与，与BamHI是一对是一对同尾酶同尾酶消化消化DNA，由由Sau3A酶切
33、产生的酶切产生的DNA片段可插入到经片段可插入到经BamHI消化的消化的噬菌体载体上。噬菌体载体上。编辑ppt图图5-13 用用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核限制性核酸内切酶消化真核生物基因组生物基因组DNA并利用并利用 噬菌体载体构建基因噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。组文库的过程图示。编辑ppt此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、此外，还有很多大容量克隆载体，如柯斯质粒、细菌人工染色体（细菌人工染色体（BAC）、）、P1源人工染色体源人工染色体（PAC）、酵母人工染色体（）、酵母人工染色体（YAC）等都可用）等都可用于基因组文库的构建。于基因组文库的构建。它们的优点是可以插入
34、更大片段它们的优点是可以插入更大片段DNA，但是稳，但是稳定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现定性一般较差，在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。缺失现象。操作也相对较困难。编辑ppt5.3 RNA基本操作技术基本操作技术真核生物基因组真核生物基因组DNA庞大，有大量重复序列，庞大，有大量重复序列，很难直接分离得到靶基因片段。而很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自来自反转录的反转录的mRNA，无冗余序列，通过筛选，无冗余序列，通过筛选cDNA文库，可较快地分离到相关基因。文库，可较快地分离到相关基因。编辑ppt细胞中的总细胞中的总RNA包括包括mRNA，rRNA，tR
35、NA以及一些小以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物）。一个典型的动物细胞约含细胞约含10-5g RNA,其中其中80%-85%为为rRNA、15%-20%为为tRNA及及sRNA，这些，这些RNA分子具分子具有确定的大小和核苷酸序列，特别是有确定的大小和核苷酸序列，特别是rRNA电电泳后泳后28S和和18S特征性条带是鉴定总特征性条带是鉴定总RNA纯度纯度和完整性的重要参数。和完整性的重要参数。mRNA约占总约占总RNA 的的1%-5%。编辑ppt编辑ppt图图5-14 PolyATtract mRNA的分离纯的分离纯化过程简图。化过程简图。编辑pptRNA的浓度和纯度可以通过测定其的
36、浓度和纯度可以通过测定其OD260和和OD2 8 0 来判断。来判断。OD2 6 0为为1时相当于浓度为时相当于浓度为40g/ml，而，而OD260/OD280的比值如果在的比值如果在1.8-2.0之间，表示所提取的之间，表示所提取的RNA纯度较好，如果样品纯度较好，如果样品中有蛋白质或酚污染，则中有蛋白质或酚污染，则OD260/OD280的比值将的比值将明显低于明显低于1.8。编辑ppt由于由于RNA分子敏感脆弱，在自然状态下难以被分子敏感脆弱，在自然状态下难以被扩增，为了研究扩增，为了研究mRNA所包含的功能基因信息，所包含的功能基因信息，一般将其反转录成稳定的一般将其反转录成稳定的DNA
37、双螺旋（双螺旋（cDNA，complementary DNA），再插入到可以自我），再插入到可以自我复制的载体中。复制的载体中。编辑ppt图图5-15 cDNA合合成过程示意图。成过程示意图。编辑ppt图图5-16 定向定向cDNA 合成及分子修饰合成及分子修饰编辑ppt因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有因为绝大多数大肠杆菌细胞都会切除带有5-甲基胞嘧啶的外源甲基胞嘧啶的外源DNA，所以实验中常选用，所以实验中常选用mcrA-mcrB-菌株以防止菌株以防止cDNA被降解。被降解。编辑pptcDNA文库的构建文库的构建cDNA的长度一般在的长度一般在0.5-8 kb之间，质粒载之间，质粒载体和
38、噬菌体类载体都能满足要求。体和噬菌体类载体都能满足要求。cDNA文库常用文库常用Uni-zap XR（一种（一种噬菌粒噬菌粒载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质载体）做载体，它具备噬菌体的高效性和质粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳粒载体系统利用蓝白斑筛选的便利，可容纳0-10 kb DNA插入片段，含有插入片段，含有pBluescript载载体的全部序列。体的全部序列。重组后可通过体内剪切反应（重组后可通过体内剪切反应（In Vivo Excision）将）将cDNA插入片段转移到质粒系插入片段转移到质粒系统中进行筛选、克隆和序列分析。统中进行筛选、克隆和序列分析。编辑ppt基因文库的
39、筛选基因文库的筛选基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基基因文库的筛选是指通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特分子的特定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核定克隆的过程。筛选的方法有很多种，如核酸杂交法，酸杂交法，PCR筛选法和免疫筛选法等。筛选法和免疫筛选法等。编辑ppt1、核酸杂交法：、核酸杂交法：核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为核酸杂交法以其广泛的适用性和快速性成为基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射基因文库筛选中最常用的一种方法，用放射性标记的特异性标记的特异DNA探针适用于高密度的菌落探针适用于高密度的菌落杂交筛选。杂交筛选。
40、将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当将待筛选菌落转移到硝酸纤维素膜上，适当温育。同时保留原来的菌落平板作对照。温育。同时保留原来的菌落平板作对照。编辑ppt取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌取出已经长有菌落的膜，用碱液处理，使菌落发生裂解，落发生裂解，DNA随之变性。用蛋白酶随之变性。用蛋白酶K处处理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落理硝酸纤维素膜去除蛋白质，形成菌落DNA的印迹。的印迹。80烘烤滤膜，将烘烤滤膜，将DNA固定在膜上。将滤膜固定在膜上。将滤膜与放射性标记的与放射性标记的DNA或或RNA探针杂交，通过探针杂交，通过放射性自显影显示杂交结果。通过对应于平放射性自显影显示杂交结果
41、。通过对应于平板上的位置找到相应克隆。板上的位置找到相应克隆。编辑ppt图图 5-17 5-17 通过核酸杂交筛选目的克隆流程图通过核酸杂交筛选目的克隆流程图编辑ppt2、PCR筛选法筛选法将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均将整个文库（以质粒的形式或者细菌的形式均可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基可）保存在多孔培养板上，用设计好的目的基因探针对每个孔进行因探针对每个孔进行PCR筛选，鉴定出阳性的筛选，鉴定出阳性的孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔孔，把每个阳性孔中的克隆再稀释到次级多孔板中进行板中进行PCR筛选。重复以上程序，直到鉴定筛选。重复以上程序，直到鉴定出与目的基因对
42、应的单个克隆为止。出与目的基因对应的单个克隆为止。编辑ppt3、免疫筛选法、免疫筛选法该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶该法仅适用于对表达文库的筛选。若实验中靶基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的基因的序列完全未知但是有针对该基因产物的特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。特异性抗体，就可以采用免疫筛选法。编辑ppt图图5-18 噬菌体噬菌体表达文库的免表达文库的免疫化学筛选法疫化学筛选法示意图示意图 编辑ppt5.4 SNP的理论与应用的理论与应用SNP是是Single Nucleotide Polymorphism的的缩写，即单核苷酸多态性，指基因组缩写，即单核苷酸多态性，指基因组D
43、NA序序列中由于单个核苷酸（列中由于单个核苷酸（A，T，C和和G）的突变）的突变而引起的多态性。而引起的多态性。编辑ppt5.4.1 SNP概述概述科学上把染色体科学上把染色体DNA同一位置上的每个碱基类同一位置上的每个碱基类型叫做一个等位位点。型叫做一个等位位点。SNP是基因组中最简单是基因组中最简单最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。最常见的多态性形式，具有很高的遗传稳定性。SNP检测和分析技术已经成为继限制性片段长检测和分析技术已经成为继限制性片段长度多态性（度多态性（RFLP）和微卫星标记（）和微卫星标记（SSR）之）之后的第三代遗传标记。后的第三代遗传标记。编辑ppt图图5-1
44、9 5-19 染色体上共同遗传的染色体上共同遗传的SNPSNP组合。组合。图中图中SNP1和和SNP2在同一条染色体上而且距离很近，在同一条染色体上而且距离很近，SNP1有等位位点有等位位点A和和G，SNP2有等位位点有等位位点G和和T。因。因此，染色体对有两种可能的此，染色体对有两种可能的SNP组合。组合。编辑ppt单倍单倍型型基因基因型型外显子外显子IV内含子内含子IV57130165232236H1H-4TTATTH-3TTATTH-1TTATTE-2TTATTB-73TTATTH2MO17CTACCB-1CTACCH3H60CCTTT玉米玉米globulin1不同单倍型和基因型之间的多
45、态性比较不同单倍型和基因型之间的多态性比较 编辑ppt据估计，人类据估计，人类DNA中每中每300-1000个碱基对就个碱基对就有一个有一个SNP，因此，一个人类个体大约携带，因此，一个人类个体大约携带300万万-1000万个万个SNPs。位于染色体上某一区。位于染色体上某一区域的一组相关联的域的一组相关联的SNP等位位点被称作单倍等位位点被称作单倍型（型（haplotype），相邻），相邻SNPs的等位位点倾的等位位点倾向于以一个整体遗传给后代。向于以一个整体遗传给后代。编辑ppt根据根据SNP在基因组中的分布位置分为编码区在基因组中的分布位置分为编码区SNP（cSNP），调控区），调控区S
46、NP（pSNP）和非）和非编码区编码区SNP（rSNP）三类。）三类。编码区内的变异率仅占周围序列的编码区内的变异率仅占周围序列的1/5，cSNP的总量显著少于其它两类的总量显著少于其它两类SNPs。cSNP分为同义分为同义cSNP（synonymous cSNP），编码序列的改变不影响所翻译的氨），编码序列的改变不影响所翻译的氨基酸序列）和非同义基酸序列）和非同义cSNP（non-synonymous cSNP），碱基序列的改变使氨），碱基序列的改变使氨基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。基酸序列发生改变，可能影响蛋白质的功能。编辑ppt5.4.2 SNP的检测技术的检测技术通过通过DN
47、A测序法获得新的测序法获得新的SNP。基因分型（基因分型（genotyping）是指利用数据库中）是指利用数据库中已有的已有的SNP进行特定人群的序列和发生频率进行特定人群的序列和发生频率的研究，主要包括基因芯片技术、的研究，主要包括基因芯片技术、Taqman技技术、分子信标（术、分子信标（molecular beacons）技术）技术和焦磷酸测序法（和焦磷酸测序法（pyrosequencing）等。）等。编辑ppt1基因芯片技术基因芯片技术通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互通过优化芯片杂交程序，使探针只与完全互补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序补的序列杂交而不与含有单个错配碱基的序列
48、杂交。列杂交。优点是高通量，一次可对多个优点是高通量，一次可对多个SNP进行规模进行规模性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简性筛选，被检起始材料也很少，操作步骤简单。单。缺点是芯片设计成本高。而且，由于缺点是芯片设计成本高。而且，由于DNA样样品的复杂性，有些品的复杂性，有些SNP不能被检测。不能被检测。编辑ppt2Taqman技术技术PCR反应系统中加入反应系统中加入2种不同荧光标记的分别种不同荧光标记的分别与两个等位基因配对的探针。随着与两个等位基因配对的探针。随着PCR的进行，的进行，与模板完全配对的探针逐步被与模板完全配对的探针逐步被Taq DNA聚合酶聚合酶的的53外切活性所切割，
49、荧光基团与外切活性所切割，荧光基团与3端的端的淬灭基团分离，荧光基团被激活。不完全配对淬灭基团分离，荧光基团被激活。不完全配对的探针（代表另一种等位基因）不能被有效切的探针（代表另一种等位基因）不能被有效切割，供体荧光基团依然被淬灭。割，供体荧光基团依然被淬灭。编辑ppt3分子信标（分子信标（molecular beacon）技术）技术是一种呈茎环结构的荧光标记的寡核苷酸，是一种呈茎环结构的荧光标记的寡核苷酸，环状区与靶序列特异性结合，茎干区由环状区与靶序列特异性结合，茎干区由5-8个个碱基对组成，碱基对组成，5端带有荧光发生基团，端带有荧光发生基团，3端带端带有荧光淬灭基团。自由状态时，分子
50、信标呈有荧光淬灭基团。自由状态时，分子信标呈发卡式结构，荧光几乎完全淬灭。与靶分子发卡式结构，荧光几乎完全淬灭。与靶分子相结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离相结合时，荧光基团和淬灭基团之间的距离增大，分子信标的荧光恢复。增大，分子信标的荧光恢复。编辑pptTaqman技技术（上）及术（上）及分子信标技分子信标技术（下）原术（下）原理示意图。理示意图。编辑ppt5.5 基因克隆（基因克隆（clone）技术）技术在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由在多细胞的高等生物个体水平上，克隆表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分
