1、第三章 微生物的生长繁殖与环境生长和繁殖的含义生长和繁殖的含义？生长生长生长是生长是细胞体积、内含物和细胞数目细胞体积、内含物和细胞数目的增加的增加繁殖繁殖产生新一代的生命个体的过程，是产生新一代的生命个体的过程，是个体数目个体数目的的 增加。增加。生长是一个逐渐发生的量变的过程，它是繁殖的基础；生长是一个逐渐发生的量变的过程，它是繁殖的基础；繁殖是一个质变的过程，是生长的结果。繁殖是一个质变的过程，是生长的结果。高等生物、丝状真菌：生长和繁殖是两个可以分开的过高等生物、丝状真菌：生长和繁殖是两个可以分开的过 程程单细胞的微生物：生长和繁殖往往是难以区分的单细胞的微生物：生长和繁殖往往是难以区
2、分的在单细胞微生物中，在单细胞微生物中，细胞内的原生质和各种细胞结构协调增加，细胞体积增大，这便是生长。当细胞增大到一定程度时，细胞开始分裂，最后形成两个基本相同的子细胞，这便是繁殖。生长的过程也生长的过程也可以说是它的繁殖过程。可以说是它的繁殖过程。在多细胞的微生物中在多细胞的微生物中（如丝状真菌），如果细胞数目增加的同时并不伴有个体数目的增加，那么此过程只能称为生长，只有形成有性和无性孢子的过程才能称为繁殖。第一节第一节 单细胞微生物的生长单细胞微生物的生长细胞周期的定义：细胞周期的定义：细胞周期通常由几个可以观察到的、能相互区分的时期组成，每一个时期的开始都依赖于前一个时期的结束。真核生
3、物的细胞周期：真核生物的细胞周期：分为四个时期四个时期，即DNADNA合成期合成期S S、细胞分裂期细胞分裂期M M、DNA合成完成到细胞分裂开始之间的间隔间隔期期G G2 2以及细胞分裂结束后到下一轮DNA合成开始之间的间隔期间隔期G G1 1。细胞周期中各个时期的长短会随环境条件改细胞周期中各个时期的长短会随环境条件改变，但主要的变化在变，但主要的变化在G G1 1期。期。间期前期中期后期M期DNA复制SG1细胞分裂末期真核细胞的生活周期 G2 CG1D 原核生物的细胞周期原核生物的细胞周期细菌细菌在低生长速率的条件下在低生长速率的条件下（即代时大于1h），细胞周期似乎和真核生物的相似。有
4、一个明确的DNA合成期C，一个细胞分裂期D（相当于G2+M），在细胞分裂结束后到下一轮DNA合成开始之间的间隔期G1。C和D不会随着细胞周期的改变而引起等比例的改变，主要的变化在G1期。大肠杆菌：DNA的复制过程所需的时间C是一个常数，C一般为40min。D也是相当固定的，D通常为1520min。在营养丰富的培养基上，生长速度快，代时短，DNA的合成是连续的，S期似乎占据了整个细胞周期，细胞周期各个时期的界限不明显，是相互重叠的。E.coli：当代时大于80100min时，细胞周期类似于真核细胞的细胞周期。G1G1=在快速生长的细胞中，在快速生长的细胞中，C、D的最小值分别为的最小值分别为40
5、min和和20min。当世代时间小于当世代时间小于C+D时，按照时，按照DNA原来的复制方式原来的复制方式就来不及在细胞分裂前完成复制，就不能保证子细就来不及在细胞分裂前完成复制，就不能保证子细胞获得一个完整的染色体。胞获得一个完整的染色体。DNA如何复制？如何复制？染色体进行提前复制，即一个细胞周期还没完成，染色体进行提前复制，即一个细胞周期还没完成，又开始又开始第二个细胞周期的第二个细胞周期的DNA合成合成。对代时小于对代时小于C+D（即小于即小于60min）的细菌而言，其的细菌而言，其细胞周期不仅是细胞周期不仅是相互重叠相互重叠的，而且是的，而且是相互交叉的相互交叉的。多叉多叉复制复制细
6、胞的体积随着生长速率的增加而增大细胞的体积随着生长速率的增加而增大在每个细胞周期，对于每个复制原点，只有当细胞的质量达到一定时，复制的起始才启动。对大多数的E.coli菌株，对Salmonella typhimurin 和Bacillus subtilis来说，不管生长速率如何，每个复制原点所对应的细每个复制原点所对应的细胞质量是一定的。胞质量是一定的。快速生长的细胞含有多个复制原点，因此生长速率的改变会导致细胞质量（大小）的改变，快速生长的细胞比慢速生长的细胞大几乎10倍。细菌个体的生长细菌个体的生长细胞生长的外观标志是细胞体积的增加，内部标志细胞生长的外观标志是细胞体积的增加，内部标志为细
7、胞物质的增加和细胞结构的组建。细胞体积的为细胞物质的增加和细胞结构的组建。细胞体积的增大是细胞物质增加的必然结果。增大是细胞物质增加的必然结果。细胞生长的细胞生长的中心问题是：组成细胞的各种大分子是中心问题是：组成细胞的各种大分子是如何合成和组装的？如何合成和组装的？荧光抗体标记实验荧光抗体标记实验细胞壁和横隔的形成细胞壁和横隔的形成 壁的生长与壁的生长与原细胞壁上肽聚糖的限制性原细胞壁上肽聚糖的限制性降解有关降解有关，不能自溶的粪链球菌、大肠杆菌，不能自溶的粪链球菌、大肠杆菌等菌株的突变体，如果不加入溶菌酶就不能等菌株的突变体，如果不加入溶菌酶就不能生长和分裂。生长和分裂。但是细菌也能够避免
8、因扩增而破坏细胞但是细菌也能够避免因扩增而破坏细胞壁的完整性和稳定性，有人认为这是因为细壁的完整性和稳定性，有人认为这是因为细胞壁在扩增过程中，肽聚糖层中双糖链是逐胞壁在扩增过程中，肽聚糖层中双糖链是逐步打开又逐步闭合的，因而在打开一层后，步打开又逐步闭合的，因而在打开一层后，其它几层仍保持其结构和功能的完整性。其它几层仍保持其结构和功能的完整性。细菌群体的生长细菌群体的生长由于细菌个体微小，难于测定其生长；个体生长时间很短，很快就进入繁殖期，生长和繁殖难于分开因此通常是以群体数量的增加作为细菌生长的指标。细菌群体的生长的测定方法细菌群体的生长的测定方法：群体生长表现为菌体数目的增多或细胞物质
9、的增加，所以群体生长的测定都是围绕这两方面进行的。测量菌体数目的方法有：（1）显微镜直接计数法。（2）稀释培养法。（3）比浊法。测量菌体细胞物质的方法测量菌体细胞物质的方法：（1）测定细胞的干物质。）测定细胞的干物质。（2）测定细胞的某种成分如氮的含量，）测定细胞的某种成分如氮的含量，DNA或或 RNA的含量等。的含量等。（3）测代谢产物。以代谢产物作为生长量的指标，）测代谢产物。以代谢产物作为生长量的指标，只限于那些与只限于那些与生长有密切相关性生长有密切相关性的代谢产物才比较的代谢产物才比较正确（如测定乳酸菌的产酸量），因为并不是所有正确（如测定乳酸菌的产酸量），因为并不是所有的代谢产物都
10、和生长有着准量的关系。的代谢产物都和生长有着准量的关系。方法方法应用应用注解注解直接显微镜计数直接显微镜计数牛奶中细菌或细胞疫苗牛奶中细菌或细胞疫苗的计数的计数不能区分死的、活的细胞不能区分死的、活的细胞活细胞计数（菌落计数）活细胞计数（菌落计数）牛奶、土壤、食品、水牛奶、土壤、食品、水体、实验室培养物中细体、实验室培养物中细菌的计数菌的计数如果培养基和培养条件合如果培养基和培养条件合适的话将是非常灵敏的适的话将是非常灵敏的浊度测定浊度测定清澈的液体培养基中细清澈的液体培养基中细菌数的估侧菌数的估侧快速而且不损伤细胞，但快速而且不损伤细胞，但细胞密度不能少于细胞密度不能少于107/毫升毫升总氮
11、或总蛋白的测定总氮或总蛋白的测定测定高密度培养物中的测定高密度培养物中的总细胞产量总细胞产量只在研究实验室中应用只在研究实验室中应用离心后测定细胞的干重离心后测定细胞的干重或湿重或湿重培养物中总细胞产量的培养物中总细胞产量的测定测定 可能比测定总氮或总蛋白可能比测定总氮或总蛋白更准确更准确生化活性指标如生化活性指标如O2的吸的吸收，收，CO2、ATP的产生的产生等的测定等的测定微生物学上的测定微生物学上的测定只适用于和细胞质量或数只适用于和细胞质量或数量有着准量的关系的生化量有着准量的关系的生化指标指标细菌的群体生长曲线细菌的群体生长曲线 采用分批培养法采用分批培养法（Batch cultur
12、e）这种培养方法是将少量微生物接种到一定体积的液体培养这种培养方法是将少量微生物接种到一定体积的液体培养基中，让其自然生长直到养分耗尽。由细菌的数量和时间作图基中，让其自然生长直到养分耗尽。由细菌的数量和时间作图得到群体生长曲线。得到群体生长曲线。生长曲线可分为以下几个时期：生长曲线可分为以下几个时期：1.延迟期：细菌数目保持不变或略有下降，倍增速率为延迟期：细菌数目保持不变或略有下降，倍增速率为0 0；2.2.加速生长期：细菌开始增殖，倍增速率随时间不断增大；加速生长期：细菌开始增殖，倍增速率随时间不断增大；3.3.对数生长期：对数生长期：倍增速率达到最大值倍增速率达到最大值，细菌数目以几何
13、级数增长；，细菌数目以几何级数增长；4.4.减速生长期：倍增速率随时间而减少，平均世代时间延长；减速生长期：倍增速率随时间而减少，平均世代时间延长；5.5.稳定期：生长速率与死亡速率相等，倍增速率为稳定期：生长速率与死亡速率相等，倍增速率为0 0，活菌数目保，活菌数目保 持恒定；持恒定；6.6.加速死亡期：死亡速率超过生长速率，并越来越大，活菌数目迅加速死亡期：死亡速率超过生长速率，并越来越大，活菌数目迅 速减少；速减少；7.7.对数死亡期：死亡速率达到最大值并保持恒定对数死亡期：死亡速率达到最大值并保持恒定8.8.残留期：死亡速率降低，从理论上讲，只要培养基不干枯，少数残留期：死亡速率降低，
14、从理论上讲，只要培养基不干枯，少数 细菌仍能存活很长时间。细菌仍能存活很长时间。加速和减速过程一般表现得不明显加速和减速过程一般表现得不明显。因此，通常将细菌的生长过程简化。因此，通常将细菌的生长过程简化为为延迟期、对数生长期、稳定期和死亡期。延迟期、对数生长期、稳定期和死亡期。延迟期延迟期 菌种接种于新鲜培养基后，微生物往往不立即进行菌种接种于新鲜培养基后，微生物往往不立即进行分裂，因此细胞数目不增加或增加很少，这一段时分裂，因此细胞数目不增加或增加很少，这一段时间称为延迟期。延迟期的细胞具有特殊的生理特性。间称为延迟期。延迟期的细胞具有特殊的生理特性。延迟期的长短和营养条件、菌种特性、菌龄
15、以及接延迟期的长短和营养条件、菌种特性、菌龄以及接种量密切相关。种量密切相关。延迟期出现的原因延迟期出现的原因是细胞为了调整代谢以适应新环境。是细胞为了调整代谢以适应新环境。如接种前后细菌所处的营养条件不同，如接种前后细菌所处的营养条件不同，需要重新合成必需的酶类、辅酶或某些中间代谢产物，以适应新的环境而出现生长的延滞。延迟期细胞的特性：延迟期细胞的特性：微生物在延迟期内虽微生物在延迟期内虽不分裂不分裂，但，但代谢机能非常活代谢机能非常活跃跃，诱导酶的产生最快，为细胞分裂进行着极为，诱导酶的产生最快，为细胞分裂进行着极为复杂的代谢上和生理上的准备，单个菌体的体积复杂的代谢上和生理上的准备，单个
16、菌体的体积和质量显著增加，其中尤以杆菌的长轴增加最为和质量显著增加，其中尤以杆菌的长轴增加最为明显。明显。延迟期的细菌对延迟期的细菌对物理和化学因子极为敏感物理和化学因子极为敏感，抵抗抵抗力很低。力很低。例如：大肠杆菌细胞在例如：大肠杆菌细胞在5353处理处理2525minmin，发现延迟发现延迟期末的细胞存活率仅为期末的细胞存活率仅为1%1%，而对数期末的细胞却，而对数期末的细胞却几乎没有死亡。几乎没有死亡。因此在测定物理化学因子对微生物的影响时，应因此在测定物理化学因子对微生物的影响时，应考虑微生物的生理状态。考虑微生物的生理状态。决定延迟期长短的因子：决定延迟期长短的因子：1.1.微生物
17、的特性微生物的特性a.a.遗传特性遗传特性。各种微生物的延迟期长短不一，例如。各种微生物的延迟期长短不一，例如大肠杆菌的延迟期比结核分枝杆菌的延迟期短大肠杆菌的延迟期比结核分枝杆菌的延迟期短b.b.接种的微生物的生理状态如菌龄的影响接种的微生物的生理状态如菌龄的影响 C.C.接种量，接种量，一般情况下，接种量越大，延迟期越短一般情况下，接种量越大，延迟期越短2.2.环境因素的影响环境因素的影响a.a.培养基的营养成分培养基的营养成分 碳源、氮源、维生素、辅酶或金属离子等碳源、氮源、维生素、辅酶或金属离子等 b.温度、温度、pHpH对数生长期对数生长期 对数生长期最显著的特点是细胞数目以指数形式
18、生长。对数生长期最显著的特点是细胞数目以指数形式生长。平均世代时间最短平均世代时间最短 Nt=N02n lgNt=lgN0+nlg2=nlgNtlgN0lg2=gtntlg2lgNt lgN0Example:What is the generation time of a bacterial population that increases from 10,000 cells to 10,000,000 cells in four hours of growth?G=24 minutes 240 minutes 3.3 x 3 G=240 minutes 3.3 log 107/104G=t
19、 3.3 log b/BG=影响细菌生长速率的因素影响细菌生长速率的因素I.I.遗传因素遗传因素II.II.营养条件营养条件 III.III.物理生长条件物理生长条件 菌株名称菌株名称培养基培养基代时代时(分钟分钟)Escherichia coliGlucose-salts17Bacillus megateriumSucrose-salts25Streptococcus lactisMilk26Streptococcus lactisLactose broth48Staphylococcus aureusHeart infusion broth27-30Lactobacillus acidop
20、hilusMilk66-87Rhizobium japonicumMannitol-salts-yeast extract344-461Mycobacterium tuberculosisSynthetic792-932Treponema pallidumRabbit testes1980在在对数生长条件对数生长条件下，微生物的群体生长类似下，微生物的群体生长类似于化学反应的一级自身催化反应，即某一时于化学反应的一级自身催化反应，即某一时刻的细胞数量（或菌体质量）的增加速率和刻的细胞数量（或菌体质量）的增加速率和该时刻的细胞数量（或质量）成正比。设单该时刻的细胞数量（或质量）成正比。设单位体积
21、的位体积的细胞数量为细胞数量为N，单位体积的单位体积的菌体质菌体质量为量为M，则可列出下述一阶微分方程：则可列出下述一阶微分方程：uNdtdNuMdtdMttNNudtNdNt00lnNt lnN0=u(t-t0)Nt=N0eu(t-t0)(303.2lglg00ttuNNt根据世代时间世代时间(代时）代时）g g的定义，当N Nt t=2=2N N0 0时，g=g=t tt t0 0，ggu693.02ln微生物的生长是一个及其复杂的生命过程，为什么微生物的生长是一个及其复杂的生命过程，为什么近似地遵循普通的一级化学反应呢？近似地遵循普通的一级化学反应呢？微生物体内进行着各种各样的分解和合成
22、反应，微生物体内进行着各种各样的分解和合成反应，但但总反应速度取决于最慢的一步反应，这个步骤称总反应速度取决于最慢的一步反应，这个步骤称为生长限制反应或控制步骤为生长限制反应或控制步骤，由于该生长限制反应，由于该生长限制反应遵循一级反应规律，所以微生物的生长速率也遵循遵循一级反应规律，所以微生物的生长速率也遵循一级反应规律。一级反应规律。上述指数形式的生长动力学公式主要适用于细菌、上述指数形式的生长动力学公式主要适用于细菌、酵母菌等单细胞且以二分裂方式繁殖的微生物群体酵母菌等单细胞且以二分裂方式繁殖的微生物群体的生长。的生长。比生长速率与限制性营养物的关系比生长速率与限制性营养物的关系 Mon
23、od公式 SKSuusmK Ks s ：当当u=1/2Umu=1/2Um时的底物浓度，表示微生物对某时的底物浓度，表示微生物对某种限制性营养物的亲和力大小；种限制性营养物的亲和力大小；S S：底物浓度；底物浓度；U U：比生长速率比生长速率底物浓度反应速度 比生长速率和限制性营养物浓度之间的关系莫氏公式和米氏公式形式上相同莫氏公式和米氏公式形式上相同莫氏公式：莫氏公式：表示的是细胞生长的速率和限制性底物浓表示的是细胞生长的速率和限制性底物浓度之间的关系。通过实验得出的经验公式。度之间的关系。通过实验得出的经验公式。米氏公式：米氏公式：表示的是酶反应速率和底物浓度之间的关表示的是酶反应速率和底物
24、浓度之间的关系。是应用酶反应理论推导得到的。系。是应用酶反应理论推导得到的。（1 1）当生长限制性营养物浓度很大时）当生长限制性营养物浓度很大时(S S Ks),KsKs),Ks往往往可以忽略不计。则往可以忽略不计。则K Ks s+S=S+S=S，这时这时u=uu=um m，说明这时说明这时细菌以最大生长速度生长，营养物浓度不限制生长。细菌以最大生长速度生长，营养物浓度不限制生长。（2 2）当生长限制性营养物浓度很低时（）当生长限制性营养物浓度很低时（S S KsKs），），则则K Ks s+S=K+S=Ks s，这时这时u=uu=um m/K/Ks sSS，它表明这时细菌的比它表明这时细菌的
25、比生长速率与限制性营养物的浓度成正比，营养物浓生长速率与限制性营养物的浓度成正比，营养物浓度限制菌体的生长。度限制菌体的生长。SKSuusm对同一种限制性营养物，不同的微生物对同一种限制性营养物，不同的微生物有不同的有不同的um和和ks值值而同一种微生物在不同的限制性营养物而同一种微生物在不同的限制性营养物条件下，也有不同的条件下，也有不同的um和和ks值。值。ks:表示微生物对某种限制性营养物的亲和力表示微生物对某种限制性营养物的亲和力大小。大小。ks值越小，表明它对底物的亲和力越大。一般说，微生物对可被利用的底物的ks值是很低的。例如大肠杆菌利用葡萄糖和色氨酸的ks值分别为110-6和21
26、0-7mol/L。因此，在正常的分批培养中，从开始到对数期末，各种底物的浓度S远远大于Ks，所以，这段时间很少会出现生长限制的情况，而一直保持其最高生长速率。只有当某些营养物耗尽并成为限制性底物时，底物浓度S才对生长速率产生影响。比生长速率与温度的关系比生长速率与温度的关系 大多数化学反应随温度的升高而加速。大多数化学反应随温度的升高而加速。微生物虽然是一个极为复杂的生命体系，但是实验发现，它微生物虽然是一个极为复杂的生命体系，但是实验发现，它的生长速率与温度之间的关系在一定范围内也符合的生长速率与温度之间的关系在一定范围内也符合Arrhenius公式：公式：lnK=-E/RT+B 或或K=A
27、e-E/RTK:反应速率常数（比生长速率常数）反应速率常数（比生长速率常数）T：反应的绝对温度；反应的绝对温度；R：气体常数；气体常数；E：反应活化能；反应活化能；A:通常称为频率因子。通常称为频率因子。中温性微生物的生长速率与温度的关系中温性微生物的生长速率与温度的关系高温高温低温低温适温适温稳定期稳定期 细胞活力逐渐降低，生长速度显著下降。细胞内开始累积贮存物质，如糖原、异染颗粒、脂肪球等。产芽孢的细菌在稳定期产生芽孢合成次生代谢产物合成次生代谢产物由于细胞进行不平衡生长，细胞的各组分以不同的速率合成。因此稳定期的细胞与对数期的细胞在细胞组分上一般是不同的。稳定期出现的原因稳定期出现的原因
28、 营养：营养：稳定期的出现常常是比较突然的，因为在对数期，原生质的增加是按对数增加的。对数生长阶段中，细胞最后一次分裂将消耗占总量二分之一的营养物质，这种爆发性的消耗意味着培养基突然变得不能再支持微生物群体的下一次分裂。于是营养物（通常是碳源）成为生长的限制因子。6.0mg/ml4.02.01.00.50.2时间细胞产量营养物浓度、生长速率和细胞产量之间的关系影响生长影响生长速度和最速度和最大收获量大收获量只影响最只影响最大收获量大收获量营养物浓度超过一定后，对生长速率和生长量都没有影响，营养物浓度超过一定后，对生长速率和生长量都没有影响，表明稳定期的出现还有其他原因。表明稳定期的出现还有其他
29、原因。环境因素：环境因素：pH改变，Eh、有毒物质积累生长得率生长得率 dtdSYdtdNSSNNdtdSYdtdN00)(00SSYNNSSNNY00Y3=7.6Y2=20Y1=37.5底物消耗速率底物消耗速率mmol/L菌体增加量菌体增加量mg细胞细胞/L戊糖丙酸杆菌在不同培养基上的生长得率戊糖丙酸杆菌在不同培养基上的生长得率葡萄糖葡萄糖甘油甘油乳酸乳酸生长得率与培养基成分密切相关生长得率与培养基成分密切相关如果培养微生物的目的在于获得某种产物，那么可以相应地定义产物得率常数或底物对产物的转化率，它等于某种产物的净增量与某种底物的消耗量之比，表示单位重量的底物可以获得的产物量，以Yp表示。
30、SSPPYp00微生物的死亡和残留微生物的死亡和残留 微生物经过稳定期生长后即进入死亡期。营养物质的消耗，有害代谢产物的积累、不适合生长的理化因子都会导致微生物的死亡。如果细胞在不良条件下暂时不表现出活性而并未死亡，这种情况称为残留残留。残留的细胞在适宜的条件下恢复活性，称为复活复活。如何准确测定残留的细胞？如何准确测定残留的细胞？微生物的死亡动力学微生物的死亡动力学对数残留定律对数残留定律微生物的群体死亡通常也类似于一级化学反应，即微生物的群体死亡通常也类似于一级化学反应，即在微生物死亡过程中的任一时刻，活菌数的减少速在微生物死亡过程中的任一时刻，活菌数的减少速率与该时刻残留的活菌数成正比，
31、可用下列公式表率与该时刻残留的活菌数成正比，可用下列公式表示：示：N:活菌数，活菌数，t:致致死因子的作用时间，死因子的作用时间，k：微生物的死微生物的死亡速率常数。亡速率常数。kNdtdNtNNkdtdtdN00kteNN0NNkt0ln1从对数残留定律可以看出：从对数残留定律可以看出：1.k值越小，说明微生物对致死因子的抗性越大；k值越大，表示对致死因子越敏感。死亡速率常数死亡速率常数k可可以衡量微生物对某一致死因子的抗性强弱，即可以以衡量微生物对某一致死因子的抗性强弱，即可以作为微生物在某一致死条件下死亡的快慢、难易程作为微生物在某一致死条件下死亡的快慢、难易程度的指标。度的指标。2.当
32、N0时，t，就是说在理论上要使一个微生物群体整体死亡，需要的时间为无穷大。这在实验过程中实际上是达不到的，也是不必要的。残留菌数只要达到某一特定值，如N=10-2，N=10-3等即可满足灭菌的要求。1/101/10衰减时间（衰减时间（D D）D D定义为微生物活细胞数减少到原来数目的十分之定义为微生物活细胞数减少到原来数目的十分之一所需的时间。一所需的时间。将将N=NN=N0 0/10/10代入代入 式，可得到式，可得到 D=1/kD=1/kln10=2.303/kln10=2.303/k尽管微生物群体中各个细胞的残留时间有长有短，然而就整尽管微生物群体中各个细胞的残留时间有长有短，然而就整体
33、而言，体而言，不管开始时细胞数目多少，杀死不管开始时细胞数目多少，杀死90%细胞所需要的细胞所需要的时间是一个常数。时间是一个常数。这一定律只适用于单细胞的微生物。这一定律只适用于单细胞的微生物。NNkt0ln1应用对数残留定律计算灭菌温度应用对数残留定律计算灭菌温度 微生物的热致死效应同样遵守“对数残留定律”，由于微生物种类以及生理状态不同，死亡速率常数k值也不相同，例如121时大多数的营养细胞的k值从每分钟10到1010不等，而芽孢的k值大约为每分钟1左右，足见芽孢较营养细胞耐热。因此芽孢较营养细胞耐热。因此灭菌的温度应以杀死芽孢的温度为准。灭菌的温度应以杀死芽孢的温度为准。第二节第二节
34、丝状真菌与放线菌的生长丝状真菌与放线菌的生长 丝状真菌的生长，首先是孢子的萌发，产生一个短的芽管。然后以此为中心，向各个方向均等的长出菌丝。菌丝的生长是以顶端生长方式进行菌丝的生长是以顶端生长方式进行的的。在菌丝体的生长过程中产生繁茂的分枝，而构成真菌的菌落。所以分枝现象也是真菌生长过程中不可缺少的环节。一、丝状真菌生长的测定一、丝状真菌生长的测定丝状菌的生长，主要表现在菌丝的延长和干重的增加（一）菌丝生长速率的测定（一）菌丝生长速率的测定 将待测菌株点接于培养基平板的中心，或U形管中，待菌丝生长一定时间后，将平板或U形管置于显微镜下，每隔一段时间用目镜测微尺测定某根菌丝的长度，根据时间和菌丝
35、延长的长度作一条生长曲线，并求出生长速度（mm/h）。菌丝生长的测定0:0045:2217:046:361:40（二）菌落生长速率的测定（二）菌落生长速率的测定 将待测菌株点接于培养基平板的中心，每隔一段时间测量菌落的半径和面积测量菌落的半径和面积，直到菌落长满平板为止。以时间和菌落半径或面积作图，得到生长曲线。在一定范围内，生长量和时间成正比。（三）（三）菌丝干重测定法菌丝干重测定法 这是测定菌丝生长总量的方法。将菌种接种到液体培养基内振荡培养，经过一定时间后，收集菌丝并洗涤，然后置于80100烘箱烘干至恒重，测定菌丝重量。也可测定在固体培养基上生长的菌丝。菌丝在固体培养基上生长一定时间后，
36、加热使琼脂融化，滤出菌丝，用热水洗涤，再烘干测定重量。二、真菌菌落的分化二、真菌菌落的分化真菌孢子吸水膨胀，伸出芽管，芽管进一步长成菌丝。当主菌丝形成初级分枝后，就开始了线性生长期。初级菌丝再产生二级分枝，二级分枝又产生三级分枝，依次类推。分枝产生在上一级菌丝的两侧，每一个分枝都有特殊的角度,所有的分支（初级的、次级的、三级菌丝）都是按照向顶顺序性产生的，即最年轻的菌丝离顶点最近。在整个系统中，每个分支通过顶端延伸生长并按照向顶顺序产生相同的侧向分支，产生的所有的菌丝就叫做菌丝体。成熟的菌落至少可分为三个不同的形态区域成熟的菌落至少可分为三个不同的形态区域1.1.扩展区扩展区 又称边沿生长区又
37、称边沿生长区，由基内菌丝构成，无气生菌丝由基内菌丝构成，无气生菌丝。尽管随着菌丝的生长菌落直径不断扩大，但成熟菌落的边沿生长区的宽度几乎保持恒定。只有只有扩展扩展区区的生长才会促使菌落的径向生长的生长才会促使菌落的径向生长。2.2.生产区生产区 有气生菌丝，其宽度大体上也是恒定的。该区的菌丝其原生质充分液泡化，并有糖原和脂的积累。随着分支的形成，菌丝逐渐变细，径向生长较少。3.3.结实区结实区 气生菌丝的一部分或全部分化为无性或有性的繁殖结构。该区占菌落的大部分该区占菌落的大部分。随着菌落直径的增加，菌落中心老化，菌丝发生自溶。三、真菌菌落径向扩展曲线三、真菌菌落径向扩展曲线分为四个时期分为四
38、个时期：（1 1）延滞期：即从接种到菌丝开始出现生长这段时间）延滞期：即从接种到菌丝开始出现生长这段时间（2 2）指数期：菌落以指数速率作径向生长；）指数期：菌落以指数速率作径向生长；（3 3）减速期：是指数期末和线性期初之间的一段时间）减速期：是指数期末和线性期初之间的一段时间（4 4）线性期：此期菌落以恒定的速率作径向生长线性期：此期菌落以恒定的速率作径向生长。指。指数期和减速期持续的时间比较短，数期和减速期持续的时间比较短，菌落的径向扩展主要菌落的径向扩展主要在线性期。在线性期。真菌菌落的径向生长与菌落边沿生长区的宽度有关。真菌菌落的径向生长与菌落边沿生长区的宽度有关。径向生长速率是边沿
39、生长区宽度的函数。径向生长速率是边沿生长区宽度的函数。四、液体培养条件下的菌丝生长曲线四、液体培养条件下的菌丝生长曲线1.1.延滞期延滞期 造成生长延滞的原因有两种：一是孢子萌发前的真正的延滞期，另一种是生长已开始但无法测量。2.2.迅速生长期迅速生长期 此时菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间成直线关系立方根与时间成直线关系。菌丝的繁殖不以几何倍数增加，故而没有对数生长期。3.衰退期衰退期 真菌生长进入衰退期的标志是菌丝干重的下降衰退期的标志是菌丝干重的下降。一般是在一短期内失重很快，以后不再变化。处于衰退期的菌丝细胞，除顶端幼龄细胞的原生质比较稠密均匀外，大多数细胞都出现大的空泡。空泡。但有
40、些菌丝发生自溶自溶，释放出细胞物质。菌丝自溶的程度与菌种的遗传特性和培养条件有关。（一）菌丝顶端的结构（一）菌丝顶端的结构微管微丝网大液泡小液泡线粒体菌丝壁类高尔基体微丝细胞核横隔孔顶端亚顶端基部菌丝的结构五、菌丝体的顶端生长五、菌丝体的顶端生长顶端区域聚集有大量的顶端区域聚集有大量的分泌泡分泌泡，表明这一部位，表明这一部位为细胞的生长区域，细为细胞的生长区域，细胞壁的扩张也发生在此胞壁的扩张也发生在此处。顶端区域含有大量处。顶端区域含有大量的分泌泡，但如高尔基的分泌泡，但如高尔基体，线粒体以及绝大部体，线粒体以及绝大部分内质网都被排除在这分内质网都被排除在这一区域之外，所以人们一区域之外，所
41、以人们称这一区域为称这一区域为“分泌泡分泌泡富集区富集区”。（二）丝状真菌顶端生长机制（二）丝状真菌顶端生长机制 菌丝顶端生长以细胞壁的合成和伸长与膨压或细胞骨架所产生的扩张力的作用之间的动态平衡动态平衡为特征，这包括了细胞壁物质的局部沉积与交联,原生质持续的向顶端迁移，细胞器极性分布的维持，微丝骨架系统性的调节等一系列的生理过程。菌丝的顶端生长在很大程度上与细胞壁性质有关。当菌丝进行顶端生长时，菌丝顶端细胞壁必须维持一定的可塑性可塑性，以便新的细胞壁物质加入，使壁不断向前延伸，但同时又必须具有一定的刚性刚性，以抵抗胞内膨压，防止原生质从菌丝顶端喷出。1 1、定向分泌定向分泌 定向分泌是顶端生
42、长过程中的中心问题。真菌细胞壁的形成本质上说就是定向分泌的结果，所以顶端生长也可以说是细胞中分泌系统极性分布的产物。2 2、顶体顶体(Spitzenkorper)的作用的作用 顶体是在高等真菌生长中的菌丝顶端发现的，在光学显微镜下表现为一块相对较暗的结构，而在电子显微镜下发现，顶体是由菌丝顶端聚集并分布于微顶体是由菌丝顶端聚集并分布于微丝网络状结构中的分泌囊泡所构成的。丝网络状结构中的分泌囊泡所构成的。由于其特殊的定位，人们认为顶体在菌丝伸长过程中起到了组织组织并决定分泌泡运输方向的作用并决定分泌泡运输方向的作用。顶体似乎是一个高度特化的分配中心，在这里，分泌泡被聚集并运送到分泌泡被聚集并运送
43、到细胞表面。细胞表面。微管与微丝微管与微丝同时都能在顶体中找到，顶体具有微顶体具有微管组织中心管组织中心(MTOC)功能功能。一直以来微管都被认微管都被认为是囊泡长距离运输的为是囊泡长距离运输的，那么位于顶体中的MTOC就可以用来解释顶体的囊泡聚集功能。由于分泌囊泡聚集于顶体部位，并在这里被输送到细胞表面，因而顶体被认为是菌丝顶端生长过程中的囊泡供应中心囊泡供应中心(VSC)。因此很可能顶体位置的移动以及由顶体释放出来的含有壁物质的囊泡量的变化共同决定了菌丝的形态建成，这一假设已为Bracker 和Coworkers的试验所证实。研究表明，菌丝顶端并不是以一定的速率匀速生长，而是经常表现为脉冲
44、式的伸长脉冲式的伸长。另外，Johns等人也对菌丝顶端的向外的作用力进行了监测，发现作用力作用力有波动现象有波动现象，并推测这种波动可能反映了菌丝内部膨内部膨压的微弱变化压的微弱变化，或者表现了细胞壁硬化及软化的脉细胞壁硬化及软化的脉冲性交替冲性交替。顶体为分泌泡的聚集部位，但是人们也确实发现菌丝上存在内吞作用，这一膜的内在化过程也为顶体提供了原料，所以，顶体不仅仅是收集分泌泡的部位，同时在内吞膜的重复利用方面也起到了重要的作用。3 3、细胞骨架的作用细胞骨架的作用 近年来许多研究都确立了细胞骨架在菌丝形态建成中的重要中心地位，微丝、微管骨架以及两者的相关蛋白都得到了较为深入的研究。微丝及微管
45、在菌丝中分别起着不同的作用，这些作用对于菌丝的形态建成都是至关重要的。（1）微丝骨架）微丝骨架 微丝在生长中的菌丝顶端都是普遍存在的，虽然不同的物种微丝结构有所不同。在微丝的功能研究方面Torralba等用Cytochalasin A证实了在构巢曲霉中，微丝骨架对于菌丝的正常极性生长，菌丝顶端形状的维持以及酶的极性分泌都是至关重要的。微丝的抑制剂Latrunculin B也能抑制水霉菌丝的顶端生长。Heath等研究发现，在水霉中，在新的菌丝形成之前，相应部位已经有了微丝的组装，因而推断微丝参与了极性生长的建立，并在顶端的形态建成中起着重要的作用。另外，Harris等通过分子途径也证明构巢曲霉芽
46、管的正常萌发依赖于微丝骨架的完整性。（2）微管骨架）微管骨架(Microtubular Cytoskeleton)最新的研究表明，具有完整功能的微管骨架对于细胞正常生长速率的维持，核正常的定位以及规则的形态建成都是必要的。Inoue等的研究表明动力蛋白动力蛋白(dynein)重链在囊泡运输到菌丝顶端的过程以及菌丝顶端的形态构建中起着重要的作用。驱动蛋白驱动蛋白(Kinesin)的突变同样也会引起菌丝生长缓慢，菌丝直径以及顶体的减小。4 4 膨压的作用膨压的作用 长期以来，人们普遍认为菌丝顶端生长动力的来源是胞内膨压胞内膨压。菌丝内部胞质的浓度与外界相比较高，在渗透作用下，外界水分具有进入胞内的
47、趋势，水分内流导致的细胞壁膨胀被相对坚硬的细胞壁阻挡后，菌丝内部便产生正向的膨压正向的膨压。由于菌丝顶端细胞壁的可塑性较大，膨压作用可能推动了菌丝顶端壁的膨压作用可能推动了菌丝顶端壁的伸长，最终导致发生顶端生长伸长，最终导致发生顶端生长。最近在对水霉的研究中发现，菌丝生长、原生质流动需要膨压，但膨压大小与菌丝生长速率并非总成正比关系。因此，人们认为菌丝顶端生长动力的另一来源可能是微丝骨架，在正常膨压条件下，这一压力可以忽略，但当膨压为零，壁可塑性增大时，微丝产生的压力就能有效的推动菌丝顶端向前生长。5 5 CaCa2+2+浓度梯度的作用浓度梯度的作用 在所有具有顶端生长的细胞中都存在有一个顶端
48、高的Ca2+浓度梯度，这一浓度梯度必定参与了顶端生长的调节。在菌丝中，人们发现，改改变变Ca2+浓度会影响微丝的数量以及分布，微丝总浓度会影响微丝的数量以及分布，微丝总是指向是指向Ca2+高度集中的地方高度集中的地方。Ca2+除了可以直接作用于微丝使其解聚，也能间接的通过依赖Ca2+/CaM的磷酸酶系统及依赖Ca2+的激酶作用于微丝。除了微丝的结构，其运输功能也受到Ca2+的调节。Ca2+可能直接作用于微丝，也可能通过作用于依赖Ca2+的肌球蛋白(myosin)，调节肌球蛋白的活性从而达到对微丝功能的调节。Ca2+影响细胞骨架系统的组装，影响细胞骨架系统的组装，但细胞骨架也能影响离子通道在空间
49、上的分布，离子通道极性分布的维持可能就是由细胞骨架所控制的。同时，囊泡和细胞膜囊泡和细胞膜融合，以及囊泡内含物的释放在范围广泛的细胞系统融合，以及囊泡内含物的释放在范围广泛的细胞系统中都是中都是Ca2+依赖的过程依赖的过程，菌丝顶端普遍存在局部的高Ca2+浓度，其作用之一可能就是提供了一个囊泡分泌所必需的环境。另外，Ca2+有可能通过与壁上的大分子物质之间的相互交联，增加细胞壁刚性，H+则可能导致壁上Ca2+的解离使细胞壁具有一定的可塑性，它们共同调节着菌丝顶端细胞壁刚性和可塑性之间的平衡，以抵抗细胞膨压维持菌丝的生长。6.钙调素（钙调素（CaM）在顶端生长中的作用在顶端生长中的作用（1）Ca
50、M的一般特点及功能的一般特点及功能 CaM是作为一种耐热的脑环核苷酸磷酸二脂酶的激活剂，它是普遍存在于真核细胞内，由148个氨基酸残基组成的小分子（MW16.7KD）酸性蛋白质，耐热，结构和功能高度保守，无组织和种属特异性。CaM含有4个同源性Ca2+结合位点。X-射线晶体衍射分析发现，每个结合位点都有基本的“EF hand”结构。细胞内有20多种受CaM调节的酶，如腺苷酸环化酶、钙依赖性磷酸二脂酶、Ca2+-ATPase、钙依赖性蛋白磷酸酶和钙离子、CaM依赖的蛋白激酶（CaMKs）等。CaM对钙离子的亲和力与细胞内游离钙离子的浓度对钙离子的亲和力与细胞内游离钙离子的浓度密切相关。当细胞内钙
