1、2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作1 分子生物学实验分子生物学实验 三峡大学化学与生命科学学院三峡大学化学与生命科学学院 湖北省生物学实验教学示范中心湖北省生物学实验教学示范中心 2010 2010年年1010月月2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作2实实验验内内容容 实验一实验一 实验准备及培养基的制备与灭菌实验准备及培养基的制备与灭菌实验二实验二 质粒质粒DNADNA的提取的提取实验三实验三 质粒质粒DNADNA的酶切和检测的酶切和检测实验四实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化大肠杆菌感受态细胞的制备及转化实验五实验五 DNADNA重组（连接反应）重组（连接反应）实验六
2、实验六 植物植物DNADNA的提取及琼脂糖凝胶电泳检测的提取及琼脂糖凝胶电泳检测实验七实验七 PCRPCR基因扩增基因扩增22022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作31.实验准备：器皿清洗、试剂配制、灭菌分装、取用保存2.离心机的使用打开离心机电源开关，进入待机状态。选择合适的转头离心管平衡误差应在0.1克以内。选择离心参数：主要掌握离心机、微量移液器及高压灭菌锅的使用机及实验操作注意事项实验一实验一 实验准备及培养基制备与灭菌实验准备及培养基制备与灭菌【实验目的实验目的】2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作4将平衡好的离心管对称放入转头内。盖好转头盖子拧紧螺丝。按下离心机盖门，如
3、盖门未盖牢，离心机将不能启动。按START键，开始离心。离心开始后（特别是高速离心时）应等离心速度达到所设的速度时才能离开，一旦发现离心机有异常（如不平衡而导致机器明显震动，或噪音很大），应立即按STOP键，必要时直接按电源开关切断电源，停止继续离心，并找出原因。机器如发现故障，请及时与有关人员联系。使用结束后请清洁转头和离心机腔，不要关闭离心机盖，利于湿气蒸发。使用结束后必须登记，注明使用情况。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作52022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作63 3.移液器的使用移液器的使用o移液器是生化与分子生物学实验室常用的小件精密设备，移液器能否正确是用，直接
4、关系到实验的准确性与重复性，同时关系到移液器的使用寿命。o移液器由联系可调的机械装置和可替换的吸头组成，不同型号的移液器吸头有所不同，实验室常用的移液器根据最大吸用量有20ul,200ul,1ml等规格。o微量移液器的操作步骤：将微量移液器装上吸头（不同规格的移液器用不同的吸头）将微量移液器按钮轻轻压至第一停点；2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作7垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液样面下几毫米，千万不要将吸嘴直接插到液体底部；缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样液。否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部，或吸入体积减少；等一秒钟后将吸嘴提离液面平稳地把按钮压到第一停点，再把按钮压至
5、第二停点以排出剩余液体；提起微量移液器，使吸嘴在容器壁擦过；然后按吸嘴弹射器除去吸嘴。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作82022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作9量液操作注意事项a.连续可调移液器的取用体积调节要轻缓，严禁超过最大或最小量程；连续可调移液器的取用体积调节要轻缓，严禁超过最大或最小量程；b.b.在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置，平时不用时置在移液器吸头中含有液体时禁止将移液器水平放置，平时不用时置移液器于架上；移液器于架上；c.c.吸取液体时，动作应轻缓，防止液体随气流进入移液器的上部；吸取液体时，动作应轻缓，防止液体随气流进入移液器的上部；d.d.在
6、吸取不同的液体时，要更换吸头；在吸取不同的液体时，要更换吸头；e.e.移液器要进行定期校准，一般由专业人员来进行。移液器要进行定期校准，一般由专业人员来进行。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作104.手提式高压蒸气灭菌锅的使用及注意事项首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。架相平为宜。切物忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅切物忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。烧干而引起炸裂事故。放入内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸放入内层锅，并装入待灭菌物品
7、。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸气流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，气流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称加盖，并将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺旋松紧一致，务使漏气。的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺旋松紧一致，务使漏气。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作11 用电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的空气。待冷空用电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除锅内的空气
8、。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸气压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用本实验用0.11MPa,121.5,20min0.11MPa,121.5,20min灭菌。灭菌。灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽，才能灭菌的主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须完全排尽，才能关上排气阀，维持所需压力。关上排气阀，维持所需压力。灭菌所需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的灭菌所
9、需时间到后，切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至压力降至“0 0”时，打开排气阀，旋松螺栓。打开盖子，取出灭菌物时，打开排气阀，旋松螺栓。打开盖子，取出灭菌物品。品。o压力一定要降到压力一定要降到“0 0”时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因时，才能打开排气阀，开盖取物。否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出瓶口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤使用者口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤使用者。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作12将取出的灭菌培养基放入将取出的灭
10、菌培养基放入3737温箱培养温箱培养2424小时，经检查若无杂小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。菌生长，即可待用。5.5.实验室安全与卫生实验室安全与卫生6.6.分组：分组：5 5人一大组，人一大组，2 23人一小组，一个实验桌人一小组，一个实验桌1 1套移液枪套移液枪7.7.准备：准备：每组蓝枪头和黄枪头各每组蓝枪头和黄枪头各1 1盒，全班另加盒，全班另加2 2包，包，EPEP管管1 1盒或盒或1 1包，包，30ml30ml离心离心管管1212个，培养皿个，培养皿1010个，全班个，全班1000ml1000ml的的LBLB培养基培养基8.8.实验报告与成绩评定实验报告与成绩评定平时成绩平时
11、成绩5050：考勤，实验操作，实验结果，预习报告：考勤，实验操作，实验结果，预习报告考核成绩考核成绩5050 ：实验报告：实验报告2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作13【思考题思考题】1.高压蒸气灭菌之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低到“0”时才能打开排气阀，开盖取物？2.移液操作应注意哪些事项？2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作14【LBLB培养基的制备及灭菌培养基的制备及灭菌】【实验目的实验目的】通过对LB培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。【实验原理实验原理】2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作15LBLB培养基培养基o是是
12、一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基培养基，有时又称为普通培养培养基基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。o琼脂在常用浓度下96时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作16LBLB培养基培养基o 由于这种培养基培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微
13、碱性，以利于细菌的生长繁殖 LB固体培养基培养基的配方如下：胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 琼脂 1520g 水 1000mL pH 7.02022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作17【试剂试剂】酵母提取物，蛋白胨，酵母提取物，蛋白胨，NaCl，琼脂；，琼脂；mol/L NaOH，1mol/L HCl；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（试纸（pH 5.59.0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
14、2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作18【培养基配制培养基配制】LBLB液体培养基：配制每升培养基，应在液体培养基：配制每升培养基，应在950ml950ml去离子水中加入去离子水中加入 胰蛋白胨胰蛋白胨 10g10g 酵母提取物酵母提取物 5g5g NaClNaCl 10g 10g摇动容器直至完全溶解，加入摇动容器直至完全溶解，加入200200l 5mol/L NaOH调节调节pH至至7.0，定容定容1L1L。LBLB固体培养基：每升培养基加入固体培养基：每升培养基加入1515克琼脂，克琼脂，0.11MPa,121.5,20min灭菌。灭菌。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作
15、19【操作步骤操作步骤】1称量 按培养基培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一药品，瓶盖也不要盖错。2溶化 在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基培养基，将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作20【操作步骤操作步骤】
16、3调pH 在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基培养基中逐滴加入1mol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/L HCl进行调节。注意pH值不要调过头，以避免回调，否则，将会影响培养基培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行（使用方法，可参考有关说明书）。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作21【操作步骤操作步骤】4 4分装分装按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。分装过按实验要求，可将配制的培养基分装入试管内或三角烧瓶内。
17、分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。污染。(1)(1)液体分装分装高度以试管高度的液体分装分装高度以试管高度的1/41/4左右为宜。左右为宜。(2)(2)固体分装分装试管，其装量不超过管高的固体分装分装试管，其装量不超过管高的1/51/5，灭菌后制成斜面，灭菌后制成斜面，分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜(3)(3)半固体分装试管一般以试管高度的半固体分装试管一般以试管高度的1/31/3为宜，灭菌后垂直待凝。为宜，灭菌后垂直待凝。2022-11-21
18、三峡大学李晓玲编写与制作22【操作步骤操作步骤】5加塞加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。6包扎包扎加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防加塞后，将全部试管用麻绳捆扎好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活养基
19、名称、组别、日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、日期。日期。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作23【操作步骤操作步骤】7灭菌灭菌 将上述培养基以将上述培养基以1.1kg/cm2，121，20分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及分钟高压蒸汽灭菌。如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入冰箱内暂存。时灭菌，则应放入冰箱内暂存。8搁置斜面搁置斜面 将灭菌的试管培养基冷至将灭菌的试管培养基冷至50左右，将试管棉塞端搁在玻棒上，搁置的斜面长度左右，将试管棉塞端搁在玻棒上
20、，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。以不超过试管总长的一半为宜。9无菌检查无菌检查 将灭菌的培养基放入将灭菌的培养基放入37的温室中培养的温室中培养2448小时，以检查灭菌是否彻底。小时，以检查灭菌是否彻底。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作24【思考题思考题】1.培养基配制好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？2.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作25实验二实验二 质粒质粒DNADNA的提取的提取【实验目的与意义实验目的与意义】质粒质粒DNADNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技的提取
21、是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法。术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法。碱裂解法：此方法适用于小量质粒碱裂解法：此方法适用于小量质粒DNADNA的提取，提取的质粒的提取，提取的质粒DNADNA可直接用于酶切、可直接用于酶切、PCRPCR扩增、银染序列。扩增、银染序列。通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒DNADNA。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作26【实验原理实验原理】碱变性抽提质粒碱变性抽提质粒DNADNA是基于染色体是基于染色体DNADNA与质与质粒粒DNADNA的变性与复性的
22、差异而达到分离的目的变性与复性的差异而达到分离的目的。的。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作27细菌裂解的方法细菌裂解的方法o碱裂解法：碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS0.2molNaOH+1%SDSo煮沸裂解法煮沸裂解法:沸水煮沸沸水煮沸4040秒秒oSDSSDS裂解法：裂解法：10%SDS,10%SDS,一般用于一般用于 质粒大量提取质粒大量提取。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作28DNADNA抽提原理抽提原理oDNADNA是具有一定结构的物质，一些特是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致殊的环境会导致DNADNA的变性，如加热、的变性，如加热、极端极端
23、pHpH值、有机溶剂、尿素、酰胺试值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使剂等，而适宜的环境又可以使DNADNA复复性。性。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作29DNADNA抽提原理抽提原理o SDSSDS是一种阴离子表面活性剂，既可使细菌细胞裂解，又可使一是一种阴离子表面活性剂，既可使细菌细胞裂解，又可使一些蛋白质变性，因此用些蛋白质变性，因此用SDSSDS处理细菌，会导致细菌细胞壁的破裂，从而处理细菌，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒使质粒DNADNA以及基因组以及基因组DNADNA从细胞中同时释放出来。从细胞中同时释放出来。释放出来的释放出来的DNADNA在强碱性
24、（在强碱性（NaOHNaOH）条件下发生变性。再用酸性乙酸钾）条件下发生变性。再用酸性乙酸钾来中和，使溶液处于中性，质粒来中和，使溶液处于中性，质粒DNADNA将迅速复性，而基因组将迅速复性，而基因组DNADNA因分子较因分子较大，难以复性。大，难以复性。离心后，质粒离心后，质粒DNADNA将在上清中，而基因组将在上清中，而基因组DNADNA则与细胞碎片一起沉淀则与细胞碎片一起沉淀至离心管底部。通过这种方法即可将质粒至离心管底部。通过这种方法即可将质粒DNADNA从细菌中提取出来。从细菌中提取出来。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作30【仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂】（一）仪器（
25、一）仪器1.1.恒温培养箱恒温培养箱2.2.台式离心机台式离心机3.3.恒温摇床恒温摇床4.4.高压灭菌锅高压灭菌锅（二）材料（二）材料1.1.葡萄糖葡萄糖2.2.三羟甲基氨基甲烷（三羟甲基氨基甲烷（TrisTris)3.3.乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTA)EDTA)4.4.氢氧化钠氢氧化钠5.5.十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDS)SDS)6.6.乙酸钾乙酸钾 7.7.冰乙酸冰乙酸 8.8.氯仿氯仿2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作31【仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂】9 9.乙酸乙酸10.10.胰胰RNARNA酶酶11.11.氨卞青霉素氨卞青霉素12.12.蔗糖蔗糖1
26、3.13.溴酚蓝溴酚蓝14.14.酚酚15.815.8羟基喹啉羟基喹啉16.16.巯基乙醇巯基乙醇17.17.盐酸盐酸18.18.含含pUC19pUC19质粒的大肠杆菌质粒的大肠杆菌19.EcoR19.EcoR酶酶20.20.吸头、小指管吸头、小指管2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作32【仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂】（三）试剂三）试剂1.1.溶液溶液50mmol/L50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，10mmol/L EDTA10mmol/L EDTA，25mM 25mM Tris-HClTris-HCl pH8.0 pH8.0。2.2.溶液溶液 0.4mol/L 0.4mol/L
27、 NaOHNaOH,2%SDS,2%SDS，用前等体积混合，用前等体积混合3.3.溶液溶液60mL60mL的的5mol/L 5mol/L KAcKAc11.5ml11.5ml冰乙酸冰乙酸28.5mL H2O28.5mL H2O4.TE4.TE缓冲液或水（缓冲液或水（+20g/ml+20g/ml RNaseRNase ）:10mmol/L10mmol/L，Tris-HClTris-HCl pH8.0 pH8.01mmol/L1mmol/L，EDTA pH8.0EDTA pH8.02022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作33【仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂】5.705.70乙醇（放乙醇（放-
28、20-20冰箱中，用后即放回）冰箱中，用后即放回）6.6.胰胰RNARNA酶酶将将RNARNA酶溶于酶溶于10mmol/L 10mmol/L Tris-HCl(pHTris-HCl(pH 7.5)7.5)、15mmol/L 15mmol/L NaClNaCl中，配成中，配成10mg/ml10mg/ml的浓度，于的浓度，于100100加热加热15min,15min,缓慢冷却至室温，保存于缓慢冷却至室温，保存于2020。7.7.凝胶加样缓冲液（凝胶加样缓冲液（6 6）4040蔗糖、蔗糖、0.250.25溴酚蓝溴酚蓝2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作34质粒质粒(plasmid)(plas
29、mid)2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作35polylinker2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作36 质粒的结构质粒的结构 2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作372022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作38【操作步骤操作步骤】一、菌种的活化一、菌种的活化1.用接种环挑取 1 环冷冻保存的含质粒 DNA 大肠杆菌工程菌（本实验是 含人 Bcl-2 重组质粒的 DH5），划线接种于含有 Amp 的 LB 固体培养基平板上，37 倒置培养约 12h(过夜)。2.用接种针或消毒牙签从新活化的E.coli DH5菌平板上挑取一单菌落，接种于2ml LB液体培养中，3
30、7振荡培养12h左右，直至对数生长期。3.取0.5ml菌液转接于50ml LB液体培养基中，37振荡扩大培养23h（OD600nm 0.5，细胞数 108）。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作39二、提取步骤二、提取步骤1.1.将将2ml2ml含相应抗生素（含相应抗生素（Amp:50g/ml)de LBAmp:50g/ml)de LB培养基加入到试管中，培养基加入到试管中，接入上述的含接入上述的含pUC19pUC19质粒的大肠杆菌，质粒的大肠杆菌，3737培养过夜。培养过夜。2.2.取取2.0ml2.0ml培养液在培养液在44、4000rpm4000rpm离心离心2min2min，吸
31、去培养液，使细胞，吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥，沉淀尽可能干燥，3.3.加加100l100l的溶液的溶液I I，使菌体充分悬浮，室温静置，使菌体充分悬浮，室温静置10min10min。4.4.加加200l200l新配置的溶液新配置的溶液IIII，温和上下颠倒，温和上下颠倒2-32-3次，冰浴静置次，冰浴静置5min5min。5.5.加加150l150l的溶液的溶液IIIIII，上下颠倒混匀数次，冰浴静置，上下颠倒混匀数次，冰浴静置15min15min。6.46.4，12000 rpm12000 rpm离心离心15min15min。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作407.7.取上
32、清转至另一离心管中，加等体积（取上清转至另一离心管中，加等体积（400l400l）的酚：氯仿（的酚：氯仿（1 1：1 1），充分混匀，室温，），充分混匀，室温，12000rpm12000rpm离心离心5min5min。吸上清液至另一离心管中。吸上清液至另一离心管中。8.8.向上清液中加入向上清液中加入2 2倍体积（约倍体积（约1ml1ml）预冷的无水乙）预冷的无水乙醇，混匀后，室温放置醇，混匀后，室温放置5 510min10min。12000rpm12000rpm离心离心5min5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。吸干液体。9.9.加加
33、1 ml 1 ml 预冷的预冷的70%70%乙醇，乙醇，44，12000rpm12000rpm离心离心5min5min，洗涤沉淀。，洗涤沉淀。10.10.弃上清，沉淀自然干燥后，加弃上清，沉淀自然干燥后，加20l TE20l TE缓冲液缓冲液溶解沉淀。溶解沉淀。11.11.加加2l 10 mg/ml2l 10 mg/ml的的RNaseARNaseA酶，酶，-20-20保存。保存。402022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作41产品序列号及组成产品序列号及组成K2200-50(50 次次)K2200-250(250次次)KarrotenTM DNA Mini Column502502ml C
34、ollection Tube50250Buffer K1(Cell resuspension solution)15 ml 75 mlBuffer K2(Cell Lysis solution)15 ml75 ml Buffer K3(Neutralization solution)20 ml100 mlBuffer KB(Column balance solution)30 ml 150 mlBuffer KW(Wash solution)使用前加入使用前加入70%乙醇乙醇40ml使用前加入使用前加入70%乙醇乙醇200 ml Buffer KE(Elution solution)5 ml
35、25 ml Karroten Plasmid DNA Extraction kit 质粒质粒DNA提取试剂盒提取试剂盒组成组成 2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作42Karroten Plasmid DNA Extraction kit 质粒质粒DNA提取试剂盒提取试剂盒 1.将带有目的质粒的将带有目的质粒的E.coli 接种于裝有接种于裝有5 ml LB/适当适当抗生素的抗生素的10-20 ml 的培养管中，的培养管中，37搖床培养搖床培养20-24h，以扩增质粒。用一个，以扩增质粒。用一个10-20 ml 培养管或培养管或培养瓶，其体积至少有培养液的培养瓶，其体积至少有培养液的3
36、-4 倍。倍。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作432.取一取一KarrotenTM Mini Column 柱裝在一柱裝在一个个2 ml 收集试管上收集试管上(已备已备)。加入。加入500 l Buffer KB平衡液至柱子內，室温下平衡液至柱子內，室温下10,000 rpm 离心离心1 min，使平衡液完全流，使平衡液完全流过柱子。弃去收集管中的平衡液过柱子。弃去收集管中的平衡液.（保留（保留空的收集管，继续往下使用）。特别注空的收集管，继续往下使用）。特别注意：柱子不平衡，将导致质粒产意：柱子不平衡，将导致质粒产率和纯度的减少。率和纯度的减少。2022-11-21三峡大学李晓玲
37、编写与制作443.取取1.55.0 ml 的菌液，于室温下的菌液，于室温下12,000 rpm 离心离心3min 以沉淀菌体。以沉淀菌体。4.倒出或吸出培养基。往沉淀中加入倒出或吸出培养基。往沉淀中加入250 l Buffer K1，振荡使细胞完全悬浮。细胞沉淀的完全重悬对于获振荡使细胞完全悬浮。细胞沉淀的完全重悬对于获得高产量是十分重要的。得高产量是十分重要的。5.往重悬混和液中加入往重悬混和液中加入250 l Buffer K2，轻轻颠倒混，轻轻颠倒混匀匀5-10 次。室温静置次。室温静置2-5 分钟。避免剧烈混和裂解分钟。避免剧烈混和裂解液，否则会使染色体液，否则会使染色体DNA 断裂而
38、使得到的质粒纯断裂而使得到的质粒纯度降低。裂解反应不要超过度降低。裂解反应不要超过5 min。（当使用完。（当使用完Buffer K2以后，须盖紧其瓶盖保存好，避免与空以后，须盖紧其瓶盖保存好，避免与空气中的气中的CO2 反应。）反应。）2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作456.往上述混和液中加入往上述混和液中加入350 l Buffer K3(可以预冷至可以预冷至4，也，也可以在常温可以在常温)，并温和地上下颠倒离心管，并温和地上下颠倒离心管10-20 混匀，直至形混匀，直至形成白色絮狀沉淀。成白色絮狀沉淀。7.在在4，12000 rpm 离心离心10 min,或者在常温或者在常温
39、12000 rpm 离心离心3-4 min.(提高离提高离心速度和时间有利于沉淀贴壁更加紧密，但是常温长时间的离心会造成质心速度和时间有利于沉淀贴壁更加紧密，但是常温长时间的离心会造成质粒粒DNA 降解降解)8.小心将细胞离心的上清液转至已平衡的柱子內，室温下小心将细胞离心的上清液转至已平衡的柱子內，室温下10,000 rpm 离心离心1 min，使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中的过滤液使裂解液完全流过柱子。弃去收集管中的过滤液.9.把柱子重新装入把柱子重新装入2ml 收集管中，加入收集管中，加入700 l Buffer KW(用用70%乙醇溶解乙醇溶解)至至柱子，室温柱子，室温10,000
40、 rpm 离心离心1min，弃去洗涤液。，弃去洗涤液。注意：冻干的注意：冻干的Buffer KW在使用之前必须按标签的提示用在使用之前必须按标签的提示用70%乙醇溶解。乙醇溶解。如果如果 Buffer KW 在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。在使用之前是置于冰箱中的，须将其拿出置于室温下。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作4610.（可选）重复用700 l 70%乙醇（室温）洗涤柱子。室温下10,000 rpm离心1min。注意：这一步对需要提取细胞转染用途的质粒来说是必要的。其它的分子生物学实验不需要。11.弃收集管中的滤液，将空柱子套回2ml收集管内收集管。室温下,
41、13,000 rpm离心2 min以甩干柱子基质残余的液体。（注意：省去这一步将导致残留乙醇于质粒中）。12.把柱子装在一个干凈的1.5 ml离心管上，加入30-50 l（具体取决于预期的终产物浓度，如果需要高浓度，可以用15 l）的Buffer KE(可用灭过菌的超纯水或TE缓冲液代替)到柱基质膜的中央，室温放置0.5-1min,13,000 rpm离心1min以洗脱DNA。第一次洗脱可以洗出80%左右的结合DNA。如果再洗脱一次的话，可以把残余的DNA洗脱出来(不推荐)2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作47常见问题常见问题可能原因可能原因对策对策DNA 产量低产量低细胞在加入细胞
42、在加入Buffer K2 前前未完全打散未完全打散保证完全重悬细胞保证完全重悬细胞细胞裂解不好细胞裂解不好适当增加适当增加Buffer k2 的作用时的作用时间。间。Buffer K2 没有盖紧没有盖紧考虑更换新配制考虑更换新配制K2，成份：，成份：0.2M NaOH，1%SDS。纯化柱未平衡纯化柱未平衡使用前平衡使用前平衡Buffer K2 出现沉出现沉淀淀一般出现在低温时一般出现在低温时 可以水浴提高温度溶解可以水浴提高温度溶解产物出现高分子质产物出现高分子质量量DNA 污染物污染物加入加入Buffer K2 后过度混后过度混匀细胞裂解液匀细胞裂解液加入溶液后不要涡旋或剧烈地加入溶液后不要
43、涡旋或剧烈地混匀混匀裂解时间太长裂解时间太长适当缩短裂解时间适当缩短裂解时间产物不能酶切产物不能酶切乙醇没有完全从柱子上乙醇没有完全从柱子上去除掉去除掉在洗脱前甩干柱子在洗脱前甩干柱子2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作48【思考题思考题】1.1.在质粒在质粒DNADNA提取过程中，提取过程中，Buffer K1Buffer K2 Buffer K3各起什么作用？各起什么作用？2.2.碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNADNA的原理是什么？的原理是什么？3.3.分离基因组分离基因组DNADNA和质粒和质粒DNADNA有哪些不同之处？有哪些不同之处？4.4.在在Buffer KE中为什
44、么要加入中为什么要加入EDTAEDTA？【实验安排实验安排】一个上午一个上午2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作49溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA(pH8.0);葡萄糖增稠，使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部；EDTA 抑制DNase的活性。这一步溶液中还可以加入RNase，不受EDTA影响，并且可以在后续步骤中被除去。其实作用不大，葡萄糖可用水来代替。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作50实验三实验三 质粒质粒DNADNA的酶切和检测的酶切和检测 【实验目的实验目的】通过本实验学习琼脂糖
45、凝胶电泳检测DNA的方法和技术 【实验原理实验原理】DNADNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNADNA分分子在高于等电点的子在高于等电点的pHpH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNADNA几乎具有等量的几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强在一定的电场强度下，度下，DNADNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，
46、即分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNADNA分子本身的大小分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的和构型。具有不同的相对分子质量的DNADNA片断泳动速度不一样，可进行片断泳动速度不一样，可进行分离。分离。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作51【实验原理实验原理】DNADNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNADNA，也可分离相对分子质，也可分离相对分子质量相同，但构型不同的量相同，但构型不同的DNADNA分子。如上次实验提取的分子。如上
47、次实验提取的pUC19pUC19质粒，质粒，有有3 3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalentlyDNA(covalently closed closed circular DNA,circular DNA,简称简称CCCDNA),CCCDNA),开环质粒开环质粒DNA,DNA,即共价闭合环状质粒即共价闭合环状质粒DNA1DNA1条链断裂（条链断裂（open circular DNA,open circular DNA,简称简称OCDNA),OCDNA),线状质粒线状质粒DNA,DNA,即即共价闭合环状质粒共价闭合环状质粒DNA2DNA2条链发生
48、断裂（条链发生断裂（linear DNA,linear DNA,简称简称LDNA)LDNA)。这这3 3种构型的质粒种构型的质粒DNADNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈后呈3 3条带，超螺旋质粒条带，超螺旋质粒DNADNA泳动最快，其次为线状泳动最快，其次为线状DNADNA，最慢的为，最慢的为开环质粒开环质粒DNADNA。2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作52影响琼脂糖电泳迁移的主要因素影响琼脂糖电泳迁移的主要因素o DNADNA的大小的大小o DNADNA的构象的构象o 琼脂糖浓度琼脂糖浓度o 缓冲液缓冲液2022-11-21三峡
49、大学李晓玲编写与制作53【仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂】（一）仪器（一）仪器1.1.恒温培养箱恒温培养箱2.2.琼脂糖凝胶电泳系统琼脂糖凝胶电泳系统3.3.台式离心机台式离心机4.4.高压灭菌锅高压灭菌锅 5.5.凝胶成像系统凝胶成像系统（二）材料二）材料1.1.三羟甲基氨基甲烷（三羟甲基氨基甲烷（TrisTris)2.2.乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTA)3.EDTA)3.溴化乙锭溴化乙锭 4.4.硼酸硼酸5.5.溴酚兰溴酚兰 6.6.蔗糖蔗糖7.7.琼脂糖琼脂糖 8.DNA marker 9.pUC198.DNA marker 9.pUC19质粒质粒2022-11-21三峡大学李晓
50、玲编写与制作54【仪器、材料与试剂仪器、材料与试剂】（三）试剂（三）试剂1.51.5TBE(5TBE(5倍体积的倍体积的TBETBE贮存液贮存液)配配1000ml 1000ml 5 5TBE:TBE:TrisTris 54g 54g硼酸硼酸 27.5g27.5g0.5 mol/L EDTA 20ml0.5 mol/L EDTA 20mlpH8.0pH8.02.2.凝胶加样缓冲液（凝胶加样缓冲液（6 6）溴酚蓝溴酚蓝 0.250.25蔗糖蔗糖 40403.3.琼脂糖琼脂糖4.EB 0.54.EB 0.5g/ml 5.g/ml 5.EcoREcoR酶酶2022-11-21三峡大学李晓玲编写与制作5
