1、1Chapter 2 The production of Enzyme by Fermentation of Microorganism微生物发酵产酶2酶的生产方法酶的生产方法v 提取分离法提取分离法 血液中提取SOD；木瓜中提取木瓜蛋白酶；动物胰脏中提取胰蛋白酶。来源：器官、组织、细胞。受到生物资源、地理环境、气候条件的影响。生物合成法生物合成法 微生物发酵产酶；（枯草芽孢杆菌生产淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶；曲霉产糖化酶等）植物细胞培养产酶；动物细胞培养产酶。v 化学合成法化学合成法 成本昂贵，效果不好。一般只用于实验室研究3 定义：利用微生物的生命活动，获得所需的酶的技术过程。利用微生物产酶主
2、要原因：微生物种类繁多，分布广泛。微生物种类繁多，分布广泛。可以根据不同的需求从环境中筛选出相应的微生物。繁殖迅速、代谢能力强。繁殖迅速、代谢能力强。短时间内可获取大量细胞和酶类。微生物发酵产酶4章节内容章节内容一、酶生物合成调节理论三、酶的发酵工艺条件及控制四、酶生产过程的动力学二、产酶微生物5一、酶生物合成调节理论一、酶生物合成调节理论 生物体对千变万化的环境采取的一种适应性策略。遵循节约、经济、实用的原则。组成型酶（组成型酶（Constitutive enzyme）：）：生物细胞中合成的酶的量比较恒定，这些酶的合成速率变化不大。调节型酶（调节型酶（Regulated enzyme）：）：
3、生物细胞中合成的酶的含量变化很大，其合成速率明显受到环境因素的影响。了解生物体的合成调节模式，有利于在酶了解生物体的合成调节模式，有利于在酶的生产采取相应的措施以提高酶产量。的生产采取相应的措施以提高酶产量。6调节酶生物合成的方式主要有：转录水平的调节 转录产物的加工调节 翻译水平的调节 翻译产物的加工调节 酶降解的调节 转录水平的调节是原核生物最常用也最实用的一种调节方式。直接在源头决定产物是否表达。7原核生物的调节理论原核生物的调节理论 3.反馈抑制作用反馈抑制作用2.分解代谢物的阻遏作用分解代谢物的阻遏作用1.酶合成的诱导作用酶合成的诱导作用生物体采用何种调节模式都存在一定的生物学意义8
4、1.酶合成的诱导作用酶合成的诱导作用 加入某些物质，能够使酶的生物合成开始或加入某些物质，能够使酶的生物合成开始或者加速进行的现象称之为酶的诱导作用。者加速进行的现象称之为酶的诱导作用。乳糖操纵子理论（Jocob&Monod,1960）9实验现象：实验现象：已知与分解利用乳糖相关的酶类有：-半乳糖苷酶(lacZ)、-半乳糖苷透过酶(lacY)和-半乳糖乙酰化酶(lacA)。1.大肠杆菌生长在葡萄糖培养基上时，细胞内上述三种酶基本不合成；2.大肠杆菌生长在以乳糖为唯一碳源培养基上时，三种酶都大量合成，达到细胞总蛋白量的6%7%左右；3.当再次换回葡萄糖培养基时，三种酶又基本消失；经济性原则：经济
5、性原则：有需要，才合成！有需要，才合成！10乳糖操纵子（Jocob&Monod,1960）在原核生物细胞中，多数基因是按照功能相关性而组成基因群共同存在。单个基因群在同一同一操纵体系操纵体系下进行表达和调节。对基因表达进行统一控制的完整单元称为操纵子。一个操纵子包括结构基因、调节基因、操结构基因、调节基因、操纵基因和启动基因纵基因和启动基因等。regulatorpromoteroperatorStructual gene理论支撑11乳糖操纵子模型 无乳糖存在的情况下无乳糖存在的情况下，阻遏蛋白与操纵基因结合，阻碍RNA聚合酶与启动基因的正常结合，转录关闭。乳糖存在的情况下，乳糖存在的情况下，乳
6、糖在-半乳糖苷酶的作用下生成别乳糖，与阻遏蛋白结合改变其结构，使之从操纵基因上解离；RNA聚合酶与启动基因结合，开启转录。12 在乳糖操纵子中，除阻遏状态（乳糖诱导）与阻遏状态下（无乳糖诱导）的-半乳糖苷酶的酶产量比例约为1000:1。正常情况下，细胞会本底产生极少量本底产生极少量(15个个)-半乳糖苷酶和透过酶。半乳糖苷酶和透过酶。用于监测环境中是否存在乳糖，监测到便可将乳糖生成别乳糖进行诱导作用，而打开结构基因的表达。在没有-半乳糖苷酶(lacZ)、-半乳糖苷透过酶(lacY)的情况下，细胞怎样进行乳糖的吸收利用？13 与分解代谢相关的酶分解代谢相关的酶常采用这种调节模式，目的就是避免浪费
7、避免浪费。比如半乳糖操纵子、阿拉伯糖操纵子等。在相关酶的生产中可以考虑加入酶的诱导物，从而提高酶产量。14原核生物的调节理论原核生物的调节理论 3.反馈抑制作用反馈抑制作用2.分解代谢物的阻遏作用分解代谢物的阻遏作用1.酶合成的诱导作用酶合成的诱导作用152.分解代谢物的阻遏作用分解代谢物的阻遏作用 指一些物质经过分解代谢产生的物质会阻遏某些酶生物合成的现象；当培养基中含有多种能源物质（比如同时存在葡萄糖和乳糖）时，微生物首先利用易于分解利用的能源物质（葡萄糖），而这种首先被利用的物质的分解可以阻碍微生物对另外一种能源物质的利用。葡萄糖效应（二次生长现象）葡萄糖效应（二次生长现象）16实验现象
8、：实验现象：细菌在只有葡萄糖的培养基中生长的时候，可以利用葡萄糖。细菌在以乳糖为单一碳源乳糖为单一碳源的培养基中生长的时候，可以利用乳糖。细菌在葡萄糖和乳糖培养基中生长的时候，只利用葡萄糖，而不利用乳糖！只利用葡萄糖，而不利用乳糖！二次生长现象二次生长现象17葡萄糖效应理论葡萄糖效应理论 乳糖操纵子的启动基因内，除RNA聚合酶结合位点外，还有一个称为CAP-cAMP复合物的结合位点。理论支撑 其中，cAMP 是环腺苷酸，CAP是称为cAMP受体蛋白，当CAP与cAMP结合为复合物后结合到CAP-cAMP结合位点，激活启动基因，使RNA 聚合酶在启动子处能解开DNA双链。18 细胞内细胞内分解葡
9、萄糖的酶类属于组成酶分解葡萄糖的酶类属于组成酶，当同时，当同时存在葡萄糖和乳糖时，细胞能够优先分解葡萄糖，存在葡萄糖和乳糖时，细胞能够优先分解葡萄糖，其中产生了阻碍乳糖操纵子转录的因子，其中产生了阻碍乳糖操纵子转录的因子，这种阻遏这种阻遏因子与因子与cAMP-CAP的结的结合有关。合有关。所以乳糖结构基因要表达，除了RNA聚合酶能够结合在启动子上，还需要cAMP-CAP在结合位点上的结合。19葡萄糖效应模型 只要外界存在葡萄糖，细胞会优先并迅速分解葡萄糖产生大量ATP；AMP的浓度ATP产生因此降低，使体内cAMP转化为AMP，进而降低cAMP浓度；同时腺苷酸环化酶的活性受到抑制。最终结果：c
10、AMP浓度不足，无法形成CAP-cAMP复合物，转录关闭。ATP AMP cAMP20 凡是在降解过程中能被转化成葡萄糖或糖酵解途径中的其他中间产物的糖代谢（乳糖、半乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等）中，其有关酶都是由这种cAMP-CAP诱导控制的。即只要有葡萄糖存在，这些操纵子就不会表达。21原核生物的调节理论原核生物的调节理论 3.反馈抑制作用反馈抑制作用2.分解代谢物的阻遏作用分解代谢物的阻遏作用1.酶合成的诱导作用酶合成的诱导作用 对于多数与分解代谢相关的酶类分解代谢相关的酶类，微生物采用诱导和分解代谢物阻遏调节，目的是为了不没有必要的蛋白，避免浪费，提高自身环境适应力。乳糖操纵子223.反馈
11、抑制作用反馈抑制作用 酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使酶的生物合成受到阻遏的现象。色氨酸反馈阻遏色氨酸反馈阻遏-（阻遏型操纵子、衰减子）（阻遏型操纵子、衰减子）-色氨酸作为色氨酸合成代谢的代谢终产物会反过来抑制色氨酸合成代谢中的一系列酶！23色氨酸阻遏型操纵子色氨酸阻遏型操纵子 无色氨酸时，阻遏蛋白无活性，RNA聚合酶起始转录。当存在色氨酸时，色氨酸作为共阻遏物与调节蛋白TrpR结合，进而通过构象改变，TrpR与启动子结合而阻止RNA聚合酶结合，基因关闭。241.色氨酸操纵子阻遏蛋白的阻遏效率比较低色氨酸操纵子阻遏蛋白的阻遏效率比较低 对色氨酸操纵子阻遏蛋白进行对色氨酸操纵子阻遏蛋白进行
12、体外实验体外实验，研究表明此阻碍蛋白在无，研究表明此阻碍蛋白在无色氨酸与有色氨酸的情况下的色氨酸合成酶的表达量仅相差色氨酸与有色氨酸的情况下的色氨酸合成酶的表达量仅相差70倍倍（乳糖（乳糖操纵子阻遏蛋白为操纵子阻遏蛋白为1000倍）。倍）。2.实际产酶分析结果与体外实验不一样实际产酶分析结果与体外实验不一样 实际产酶情况发现，在高浓度实际产酶情况发现，在高浓度Trp和低浓度和低浓度Trp的情况下色氨酸合成的情况下色氨酸合成酶的表达量相差约酶的表达量相差约600倍，与理论抑制程度的倍，与理论抑制程度的70倍多出来近倍多出来近10倍。倍。衰减子衰减子But多出来的抑制效果必然存在其他的调节系统？为
13、什么要多这多出来的抑制效果必然存在其他的调节系统？为什么要多这样一个调节系统呢？样一个调节系统呢？衰减子衰减子 是一种广泛存在于原核生物是一种广泛存在于原核生物合成途径酶类合成途径酶类（氨（氨基酸合成酶，核苷酸合成酶等），由基酸合成酶，核苷酸合成酶等），由翻译水平和转翻译水平和转录水平录水平共同搭配而成的细微调节模式共同搭配而成的细微调节模式。25R P O leading seq.E D C B A调节基因操纵基因结 构 基 因终止子信号终止子信号终止子信号终止子信号高色氨酸时高色氨酸时低色氨酸时低色氨酸时实验结果UGA基因分析基因分析trp E基因基因(E)操纵基因操纵基因(O)终止子终止
14、子S.D序列序列可翻译可翻译14 个氨基酸的前导肽个氨基酸的前导肽翻译层面转录层面前导肽特点1：编码区含有重复Trp26前导肽前导肽终终止止子子1-2/3-41/2-3/41-2/3-41/2-3/4123412343-4：终：终止子止子UGA1234UGAR P O leading seq.E D C B A调节基因操纵基因结 构 基 因终止子信号终止子信号终止子信号终止子信号UGA特点2：转录出RNA序列可形成双双互补结构，其中3-4互补将形成终止子结构终止子结构前导肽前导肽27 在原核生物中，在原核生物中，翻译和转录是同时进行的，翻译和转录是同时进行的，为衰减子为衰减子的两者搭配调控提供
15、可能。的两者搭配调控提供可能。色氨酸衰减子工作原理前导肽前导肽 当当trp-tRNA供给不足，核糖体在重复供给不足，核糖体在重复trp序列序列(序列序列1的中间位置上的中间位置上)上停止。上停止。当当trp-tRNA供给充足，核糖体顺利通过重复供给充足，核糖体顺利通过重复trp序列序列在在UGA（核糖体占据序列（核糖体占据序列1和部分序列和部分序列2）处停止。处停止。前导肽翻译的过程中，重复的前导肽翻译的过程中，重复的Trp密码子迫使核糖体在密码子迫使核糖体在此处合成减慢；决定核糖体前进的因素是外界此处合成减慢；决定核糖体前进的因素是外界Trp-tRNATrp的的供给量。供给量。序列序列1结合
16、核糖体；结合核糖体；2-3配对；配对；4独立独立-无终止信号，转录继续无终止信号，转录继续核糖体停留在序列核糖体停留在序列1和和2的连接（的连接（UGA）处，占据部分）处，占据部分1和和2的序列；的序列；序列序列3-4配对，形成终止信号配对，形成终止信号 -转录终止。转录终止。RNA聚合酶RNA聚合酶28trp-trpUGAUGAtrp-trp终止子终止子29色氨酸反馈阻遏调节分析（阻遏操纵子色氨酸反馈阻遏调节分析（阻遏操纵子+衰减子）衰减子）阻遏操纵子：阻遏操纵子：共阻遏物为共阻遏物为Trp，在有，在有Trp和没有和没有Trp的情的情况下阻遏效率约为况下阻遏效率约为70倍倍。仍允许部分仍允许
17、部分RNA聚合酶通过操聚合酶通过操纵位点继续转录。纵位点继续转录。衰减子：衰减子：共阻遏物为共阻遏物为Trp-tRNA，在，在Trp-tRNA充足和充足和Trp-tRNA缺乏的情况下阻遏效率约为缺乏的情况下阻遏效率约为10倍倍。RNA聚合酶聚合酶转录出前导链之后，根据转录出前导链之后，根据Trp-tRNA是否充足决定后续相关合是否充足决定后续相关合成酶的基因的转录是否继续。成酶的基因的转录是否继续。两种作用模式共同决定了两种作用模式共同决定了色氨酸合成酶反馈抑制效率为色氨酸合成酶反馈抑制效率为700倍。倍。外界适当的外界适当的Trp量是保证量是保证Trp-tRNAtrp充足的必需条件，充足的必
18、需条件，但不是充分条件。但不是充分条件。30 无无 Trp，阻遏操纵子，支持转录；衰减子，支持转录。有有Trp少量，而却未达到合成前导肽所需要少量，而却未达到合成前导肽所需要的的Trp-tRNA的量。的量。阻遏操纵子发挥70倍阻遏；而衰减子依然支持转录。当有大量当有大量Trp存在存在，Trp和Trp-tRNA都充足。两者共同发挥作用，达到最大阻遏效率700倍。阻遏操纵子阻遏操纵子+衰减子的调节结果衰减子的调节结果通常是体外添加Trp通常是体内合成Trp这种调节保证了细胞内总是具有一定浓度的这种调节保证了细胞内总是具有一定浓度的Trp，是细胞自给自足的基础。，是细胞自给自足的基础。31 色氨酸合
19、成酶的调节是一种逐渐过渡的模式，有别色氨酸合成酶的调节是一种逐渐过渡的模式，有别于乳糖操纵子的非开即关。于乳糖操纵子的非开即关。乳糖分解调节色氨酸合成调节逐逐渐渐过过渡渡音量调节器10倍抑制70倍抑制无Trp少Trp多Trp非非开开即即关关有乳糖无乳糖电灯开关1000倍抑制32衰减子模型普遍存在于氨基酸和核苷酸的合成调节当中衰减子模型普遍存在于氨基酸和核苷酸的合成调节当中ThrhispheLeuWhy&How33原核生物的调节理论原核生物的调节理论 3.反馈抑制作用反馈抑制作用2.分解代谢物的阻遏作用分解代谢物的阻遏作用1.酶合成的诱导作用酶合成的诱导作用乳糖操纵子模型葡萄糖效应色氨酸阻遏型操
20、纵子、衰减子或有或无，需要才合成确保一定有，但要控制量生物体对于不同的营养物是区别对待的生物体对于不同的营养物是区别对待的要想提高某酶要想提高某酶的产量，我们的产量，我们或许能够或许能够34章节内容章节内容一、酶生物合成调节理论三、酶的发酵工艺条件及控制四、酶生产过程的动力学二、产酶微生物351.对酶生产菌的要求对酶生产菌的要求产酶量高，产酶量高，最基本，最重要的条件。最基本，最重要的条件。产酶稳定，产酶稳定，传代过程中不易发生变异、退化。传代过程中不易发生变异、退化。最好是胞外酶，最好是胞外酶，方便发酵产物的纯化。方便发酵产物的纯化。不是致病菌，不产生毒素不是致病菌，不产生毒素等有毒代谢物。
21、等有毒代谢物。酶作为天然提取物可以认为是安全的，但在酶分离纯化中可酶作为天然提取物可以认为是安全的，但在酶分离纯化中可能会带入一些致病素，所以要对产酶微生物进行安全检查，尤其能会带入一些致病素，所以要对产酶微生物进行安全检查，尤其是在医药和食品用酶特别重要。是在医药和食品用酶特别重要。用于食品工业的微生物（枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、用于食品工业的微生物（枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、黑曲霉、乳酸菌等）已经有了充分的安全记录，可以直接采用；其他非致乳酸菌等）已经有了充分的安全记录，可以直接采用；其他非致病性的微生物需要做一个短期的毒性试验；对于非常见的微生物病性的微生物需要做一个短期的毒性试验；
22、对于非常见的微生物则需要做广泛的毒性试验，包括慢性中毒试验。则需要做广泛的毒性试验，包括慢性中毒试验。容易培养，营养要求低容易培养，营养要求低362.如何获取产酶微生物如何获取产酶微生物 生产菌可以从菌种保藏中心和有关研究部门获取，但主要还是从自然界进行筛选。但主要还是从自然界进行筛选。2.1 取样：由微生物的分布规律决定取样：由微生物的分布规律决定 从富含该酶作用底物的场所取样从富含该酶作用底物的场所取样（筛选蛋白酶产生菌从堆放鱼、肉、虾等蛋白质的地方采样、或者从肉食动物的粪便中采集；在堆积腐烂纤维素的地方筛选产纤维素酶的菌）大多数产酶菌生长条件接近于酶活性的最适条件大多数产酶菌生长条件接近
23、于酶活性的最适条件（温泉中分离耐热的降解淀粉的假单胞菌；海洋中分离可产耐盐耐压的酶的生产菌）取样取样筛选筛选改良改良37富集培养：富集培养：在采集的样品中加入某些物质，使特定微生物在采集的样品中加入某些物质，使特定微生物繁殖成优势菌，而方便在分离纯化中被分离。繁殖成优势菌，而方便在分离纯化中被分离。富集不同种类的微生物（细菌、霉菌、放线菌）富集不同种类的微生物（细菌、霉菌、放线菌）肉汁琼脂培养基培养细菌；察氏培养基培养霉菌；高氏培养基培养放线菌。如有必要，可辅助添加一些药剂以提高分离效率。如细菌培养中加入制菌霉素以抑制霉菌；霉菌培养中加入青霉素或链霉素以抑制细菌。富集不同生长性质的微生物富集不
24、同生长性质的微生物 酸性或碱性培养基；高浓度无机盐培养基；高温或低温条件培养；加入苯酚，抗生素；微生物作用底物等2.2 筛选筛选（富集（富集 初筛初筛 复筛）复筛）所需微生物在混杂体系中的比例通过富集得到提高所需微生物在混杂体系中的比例通过富集得到提高38在培养基中分别添加一定浓度的在培养基中分别添加一定浓度的酸性、中性、碱性酪蛋白酸性、中性、碱性酪蛋白，并，并添加一定量的添加一定量的三氯乙酸三氯乙酸作为蛋白沉淀剂，这样培养基呈现乳白作为蛋白沉淀剂，这样培养基呈现乳白色；色；产蛋白酶菌分泌蛋白酶至培养基，在菌落周围形成产蛋白酶菌分泌蛋白酶至培养基，在菌落周围形成透明的蛋白水解圈透明的蛋白水解圈
25、 水解圈越大，产酶能力越强。水解圈越大，产酶能力越强。初筛：初筛：从富集培养物中初步筛选得到单个目标菌株的过程。从富集培养物中初步筛选得到单个目标菌株的过程。利用平板来分离纯化所需菌。通常通过添加酶的底物和相利用平板来分离纯化所需菌。通常通过添加酶的底物和相应指示剂来制备应指示剂来制备鉴别平板鉴别平板或通过或通过筛选平板筛选平板筛选。筛选。例例1：蛋白酶菌株筛选蛋白酶菌株筛选例例2：淀粉酶菌株筛选淀粉酶菌株筛选通过初筛获得了具有产酶能力的纯种微生物通过初筛获得了具有产酶能力的纯种微生物39复筛：复筛：通过初筛获得了单个的具有产酶能力的微生物，但其在实际发酵中的产酶性能如何？在初筛的基础上选出在
26、初筛的基础上选出用于发酵生产用于发酵生产的高产菌。的高产菌。一般用接近于生产的培养条件对初筛菌株逐个做摇瓶一般用接近于生产的培养条件对初筛菌株逐个做摇瓶培养试验，最终选出一个或两个产酶能力最强的菌株。培养试验，最终选出一个或两个产酶能力最强的菌株。40产酶微生物的筛选过程采集样品富集培养初筛复筛很多很多目标菌比目标菌比例提高例提高3040株株23株株获取可能含有目标菌的样品使目标菌在混杂体系中比例增大，提高筛选几率平板筛选，初步筛选出产酶菌摇瓶培养，筛选出适于发酵生产的高产菌41菌种改良：菌种改良：自然界分离到的野生菌株产酶能力一般都不高，很少能直接适用于工业化生产，所以需要对野生菌株进行改良
27、。目前工业上使用的菌株几乎都是经过选育过了的菌株。常用改良方法有：1.紫外诱变2.原生质体融合技术3.DNA重组 DNA Shuffling 通过改良，-淀粉酶的活力已经达到10000U/mL，是20世纪50年代的50倍42筛选热点与新技术筛选热点与新技术1.极端微生物 2.不可培养微生物 自然界中仅有很少一部分的微生物可以在实验室纯培养，另有95%以上的菌株是不能利用纯培养的，称为不可培养微生物(VBNC，viable but non culturable)。这是生物资源的巨大宝库，如何获取这些微生物的资源？如何获取这些微生物的资源？宏基因组策宏基因组策略略(Metagenome)43基因文
28、库的建立细胞A提取总DNA核酸酶处理成小片段把小片段与基因载体连接，导入宿主体中，使稳定遗传。其总和称为细胞A的基因文库每个平板得到的纯培养菌都含有一段细胞A的DNA小片段基因仓库宏基因组策略宏基因组策略环境样品（土壤或水样等）443.常见的产酶微生物 目前工业主要用酶：蛋白酶占59%、糖化酶13%、-淀粉酶5%、葡萄糖异构酶6%、果胶酶3、脂肪酶3%、其他医药与分析研究用酶占10%。主要用于生产的微生物：细菌：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌放线菌：链霉菌霉菌：曲霉、根霉45(1)大肠杆菌大肠杆菌(Escherich coli)大肠杆菌产酶一般都属于菌产酶一般都属于胞内酶胞内酶，所以通常需要经过细胞破
29、碎才可分离；由于遗传背景清楚，常作为基因工程菌的宿主。由于遗传背景清楚，常作为基因工程菌的宿主。限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、核酸外切酶等的主要来源。工业生产青霉素酰化酶、-半乳糖苷酶、谷氨酸脱羧酶和天冬酰胺酶等；46(2)枯草杆菌枯草杆菌（Bacillus subtilis）枯草芽孢杆菌是工业上应用最广泛的工业上应用最广泛的产酶微生物之一，所生产的-淀粉酶和蛋白酶等都是胞外胞外酶酶；主要生产-淀粉酶，蛋白酶，淀粉酶，蛋白酶，-葡聚糖酶，碱性磷酸酶等；枯草杆菌BF7658 是国内用于生产-淀粉酶的主要菌株。47(3)放线菌放线菌 放线菌是具有分支状菌丝的单细胞原核微生物，常用于
30、酶发酵生产的放线菌主要是链霉菌链霉菌。主要应用：链霉菌是生产葡萄糖异构酶的主要微生物。还可以用于生产青霉素酰化酶、纤维素酶等。48(4)曲霉曲霉(Aspergillus)主要应用：蛋白酶、淀粉酶、果胶酶等。(5)根霉根霉(Rhizopus)主要应用：淀粉酶、纤维素酶、果胶酶、脂肪酶等；49本章内容本章内容一、酶生物合成基本理论三、酶的发酵工艺条件及控制三、酶的发酵工艺条件及控制四、酶生产过程的动力学二、产酶微生物50酶发酵生产的工艺流程活 化扩大培养保藏菌种培养基培养基 发酵产发酵产物物发酵生产发酵生产 种子菌液种子菌液51 活化：把处于休眠状态的菌株唤醒，使其活化：把处于休眠状态的菌株唤醒，
31、使其恢恢复生命活性；复生命活性；扩大培养（种子菌液）：活化好的菌体经过扩大培养（种子菌液）：活化好的菌体经过扩大培养获得扩大培养获得下一级发酵罐所需的接种量下一级发酵罐所需的接种量；扩大培养的培养基要与发酵罐中的培养基扩大培养的培养基要与发酵罐中的培养基成分成分接近接近；N源丰富源丰富，利于细胞生长。，利于细胞生长。选用选用对数生长期对数生长期的菌液，活力最强，适应环境的菌液，活力最强，适应环境能力最强；菌龄过年轻发酵周期延长、菌龄过老导能力最强；菌龄过年轻发酵周期延长、菌龄过老导致生产力减弱。致生产力减弱。适中。过少，发酵周期延长；过大，菌体生长适中。过少，发酵周期延长；过大，菌体生长太快会
32、造成培养基粘稠，影响培养基溶氧量。一般太快会造成培养基粘稠，影响培养基溶氧量。一般为为1%10%较为适宜。较为适宜。BACK对制备种子菌液的要求：对制备种子菌液的要求：培养基培养基种龄种龄接种量接种量52培养基：培养基：培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养不同的微生物必须采用不同的培养条件；培养目的不同，原料的选择和配比不同；培养目的不同，原料的选择和配比不同；不同生长阶段，所要求的培养条件也有所差异。不同生长阶段，所要求的培养条件也有所差异。一般都包括一般都包括水、碳源、氮源、无机盐和生水、碳源、氮源、无机盐和生长因子长因子五大组分。五大组分。531.水水 水是细胞的主要组成部分；水
33、是细胞的主要组成部分；水是细胞内生化反应的介质；水是细胞内生化反应的介质；作为营养物质和代谢产物的良好溶剂；作为营养物质和代谢产物的良好溶剂；水的比热高，热传导性好，避免细胞内温水的比热高，热传导性好，避免细胞内温度发生骤变。度发生骤变。542.碳源碳源碳是微生物细胞需要量最大的元素碳是微生物细胞需要量最大的元素作用：作用：提供碳素；提供碳素；碳源物质代谢产生碳源物质代谢产生ATP供能供能种类来源：种类来源：有简单的无机含碳有简单的无机含碳化合物化合物(CO2、NaHCO3)；复杂的有；复杂的有机物机物(糖、烃类、醇等糖、烃类、醇等)；生物大分子；生物大分子(蛋白质、氨基酸和核蛋白质、氨基酸和
34、核酸酸)；复杂的天然含碳物（牛肉膏、蛋白胨、花生饼粉）等；复杂的天然含碳物（牛肉膏、蛋白胨、花生饼粉）等55 根据不同的微生物特性选择特定的根据不同的微生物特性选择特定的C源营养物。异养型源营养物。异养型微生物，糖类是最好的微生物，糖类是最好的C源，源，Glu最为通用。最为通用。根据酶调节理论（合成诱导作用、分解物代谢阻遏作根据酶调节理论（合成诱导作用、分解物代谢阻遏作用），对所产酶的特性做出了解并调整碳源成分。用），对所产酶的特性做出了解并调整碳源成分。生产应用：生产应用：563.氮源氮源氮氮是微生物细胞需求量仅次于碳的元素。是微生物细胞需求量仅次于碳的元素。作用：作用：提供氮素，蛋白质和核
35、酸的主要元素提供氮素，蛋白质和核酸的主要元素种类来源：种类来源：有机氮源有机氮源主要是各种蛋白质及其水解产物，如蛋白胨，主要是各种蛋白质及其水解产物，如蛋白胨，酵母膏，牛肉膏，豆饼粉，花生饼粉等；酵母膏，牛肉膏，豆饼粉，花生饼粉等；无机氮源无机氮源是各种是各种含氮的无机化合物，主要是铵盐（如硫酸铵，磷酸铵，硝含氮的无机化合物，主要是铵盐（如硫酸铵，磷酸铵，硝酸铵等）和硝酸盐；酸铵等）和硝酸盐；57 碳氮比一般是指培养基中碳元素与氮元素之比。碳氮比一般是指培养基中碳元素与氮元素之比。生产应用生产应用(C/N)：扩大培养中，扩大培养中，N源含量要求较高源含量要求较高发酵生产中，一般把培养基的发酵生
36、产中，一般把培养基的N源适当下调。源适当下调。一般而言：一般而言：N源含量较高源含量较高（C/N低）有低）有利于微生物的利于微生物的生长和繁殖生长和繁殖；反之，；反之，N源含量较低源含量较低（C/N高）微生物生长高）微生物生长不会特别旺盛而不会特别旺盛而利于代谢产物的积累利于代谢产物的积累。584.无机盐无机盐 微生物除了需要微生物除了需要C源、源、N源外，还需要源外，还需要P、S、K、Ca、Mg、Cu等元素，它们大多都是以无机盐的形式提供的。等元素，它们大多都是以无机盐的形式提供的。作用：作用：P和和S分别是核酸和含硫氨基酸的组成成分；分别是核酸和含硫氨基酸的组成成分；Fe、Mg、Cu、Zn
37、等作为许多酶的激活剂；等作为许多酶的激活剂；Na和和K具有调节细胞渗透压的作用，磷酸盐组成缓冲具有调节细胞渗透压的作用，磷酸盐组成缓冲剂可保持微生物在生长过程中的剂可保持微生物在生长过程中的pH稳定。稳定。59种类来源：种类来源：无无机元素是通过在培养基中添加无机盐来提供的，采机元素是通过在培养基中添加无机盐来提供的，采用添加水溶性的硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐或硝酸盐等；用添加水溶性的硫酸盐、磷酸盐、盐酸盐或硝酸盐等；一般微量元素在配制培养基所使用的水中已经足量，一般微量元素在配制培养基所使用的水中已经足量，无需特意添加。无需特意添加。605.生长因子生长因子 生长因子是指微生物生长需求量很少，但
38、却自身不能生长因子是指微生物生长需求量很少，但却自身不能合成的或者合成量不够的有机化合物。分为维生素、氨基合成的或者合成量不够的有机化合物。分为维生素、氨基酸和嘌呤嘧啶三大类。酸和嘌呤嘧啶三大类。作用：作用：氨基酸是蛋白质的组分；氨基酸是蛋白质的组分；嘌呤、嘧啶是核酸和某些辅酶或辅基的组分；嘌呤、嘧啶是核酸和某些辅酶或辅基的组分；维生素主要起辅酶作用（维生素主要起辅酶作用（B1硫胺素为脱羧酶的辅基、硫胺素为脱羧酶的辅基、烟酸为烟酸为NAD和和NADP的前体，脱的前体，脱H酶的辅酶等）。酶的辅酶等）。61种类来源：种类来源：酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、麦芽汁、米曲汁等天然培酵母膏、蛋白胨、牛肉膏、麦
39、芽汁、米曲汁等天然培养基中本身含有各种生长因子。养基中本身含有各种生长因子。多数真菌、放线菌和细菌是可以自身合成生长因子的，多数真菌、放线菌和细菌是可以自身合成生长因子的，所以在培养基的配制中是不需要另外加入生长因子的；所以在培养基的配制中是不需要另外加入生长因子的；但一些生长因子合成能力较差的细菌（如乳酸菌），需要但一些生长因子合成能力较差的细菌（如乳酸菌），需要额外加入一些维生素、氨基酸等作为补充。额外加入一些维生素、氨基酸等作为补充。62请指出培养基中的营养成分请指出培养基中的营养成分牛肉膏蛋白胨培养基：（细菌）牛肉膏蛋白胨培养基：（细菌）牛肉膏、蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、NaCl察氏培养
40、基察氏培养基：（霉菌）：（霉菌）蔗糖蔗糖、硝酸钠、硝酸钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸镁、氯化钾、氯化钾、硫酸亚铁硫酸亚铁 高氏培养基：（放线菌）高氏培养基：（放线菌）淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫淀粉、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁酸亚铁 生长因子？生长因子？63 发酵生产考虑：发酵生产考虑：工业生产中考虑更多的是如何低成本工业生产中考虑更多的是如何低成本获取高价值，所以在培养基选材方面主要以低成本的原料为主。获取高价值，所以在培养基选材方面主要以低成本的原料为主。产酶角度考虑：产酶角度考虑：培养基是否有利于酶的产生。培养基是否有利于酶的产生。BACK产酶
41、培养基的一般原则：产酶培养基的一般原则：培养基配方：培养基配方：查找文献查找文献 优化和改进。优化和改进。64发酵条件的控制发酵条件的控制1.pH值值2.温度温度3.溶氧量溶氧量4.泡沫泡沫5.基质浓度基质浓度651.pH值值pH对发酵的影响：对发酵的影响：不同微生物的生长最适不同微生物的生长最适pH值不同（细菌、放线菌、值不同（细菌、放线菌、霉菌）。霉菌）。改变细胞内酶的活性；改变细胞内酶的活性；影响细胞膜的透性；影响细胞膜的透性；影响培养基营养成分解离状态。影响培养基营养成分解离状态。产酶产酶pH通常与这个酶的最适反应通常与这个酶的最适反应pH一致，一致，可以通过控制可以通过控制pH来来控
42、制不同酶的产量；此外，也受到菌体自身生长的影响。控制不同酶的产量；此外，也受到菌体自身生长的影响。66影响影响pH变化的因素：变化的因素：发酵过程中发酵过程中pH的变化主要是由细胞产酸产碱代谢反应的变化主要是由细胞产酸产碱代谢反应的综合结果：的综合结果：pH下降：下降：碳源氧化不完全，使有机酸大量积累；碳源氧化不完全，使有机酸大量积累；生理酸性盐（如硫酸氨）中的氨被菌体利用后，残留生理酸性盐（如硫酸氨）中的氨被菌体利用后，残留的硫酸根离子会导致发酵液。的硫酸根离子会导致发酵液。pH上升：上升：培养基中蛋白质和含氮有机物被水解后放出氨。培养基中蛋白质和含氮有机物被水解后放出氨。67控制控制pH值
43、：值：调整培养基的组分，尤其是产酸产碱组分的配比，使调整培养基的组分，尤其是产酸产碱组分的配比，使pH变化处于一个适当的范围。变化处于一个适当的范围。调节能力比较有限。调节能力比较有限。加入加入pH缓冲液，或发酵过程补加酸或碱的方法直接调节缓冲液，或发酵过程补加酸或碱的方法直接调节pH。补料有调节补料有调节pH和添加营养物双重作用，是较为常用的方法。和添加营养物双重作用，是较为常用的方法。（如补（如补充生理酸性物质硫酸氨充生理酸性物质硫酸氨(NH4)2SO4和碱性物质氨水来调节和碱性物质氨水来调节pH）682.温度温度温度对发酵的影响：温度对发酵的影响：不同微生物的生长最适温度不同（枯草芽孢杆
44、菌、不同微生物的生长最适温度不同（枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、霉菌）大肠杆菌、霉菌）改变细胞内酶的活性；改变细胞内酶的活性；影响发酵液的物理性质（如粘稠度），影响溶氧量。影响发酵液的物理性质（如粘稠度），影响溶氧量。最适产酶温度一般都低于最适生长温度；最适产酶温度一般都低于最适生长温度；在较低温度下，酶在较低温度下，酶的的mRNA稳定性提高，延长细胞产稳定性提高，延长细胞产酶时间。酶时间。69 酶的发酵中，可以在不同生长阶段控制不同的温度以提酶的发酵中，可以在不同生长阶段控制不同的温度以提升酶的产量。升酶的产量。用枯草芽胞杆菌用枯草芽胞杆菌AS1.3398生产中性蛋白酶生产中性蛋白酶 温度控制温度
45、控制 发酵时间发酵时间 发酵单位发酵单位 变温变温 0-4h 30-30 4-8h 32-40(2/h)8-12h 40-32(2/h)12h后后 30-32 26.5h 7100u/ml 恒温恒温 30-32 27h 4275u/ml70温度的控制：温度的控制：热水升温、冷水降温热水升温、冷水降温影响温度变化的因素：影响温度变化的因素：发酵设备器搅拌过程中产生的热量发酵设备器搅拌过程中产生的热量 微生物代谢过程产生的热量微生物代谢过程产生的热量713.溶氧量溶氧量溶氧量对发酵的影响：溶氧量对发酵的影响：培养过程中细胞一般只能利用溶解在发酵液中的氧气。培养过程中细胞一般只能利用溶解在发酵液中的
46、氧气。各种微生物对发酵液中的溶氧浓度有个最低要求，各种微生物对发酵液中的溶氧浓度有个最低要求，这个溶氧浓度称为这个溶氧浓度称为“临界氧浓度临界氧浓度”。低于这个浓度，影响微生物生长和产酶；低于这个浓度，影响微生物生长和产酶；溶氧量过高，一方面造成浪费，另一方面会抑制某些酶的生物溶氧量过高，一方面造成浪费，另一方面会抑制某些酶的生物合成。合成。发酵过程中溶氧无需达到饱和，只要求超过发酵过程中溶氧无需达到饱和，只要求超过“临界临界氧浓度氧浓度”。724.泡沫泡沫泡沫的产生：泡沫的产生：酶的发酵过程中会产生较多的泡沫，主要是由培养酶的发酵过程中会产生较多的泡沫，主要是由培养基中天然蛋白质原料含量较高
47、，而且强烈的通气搅拌所基中天然蛋白质原料含量较高，而且强烈的通气搅拌所导致。导致。泡沫的影响：泡沫的影响：阻碍阻碍CO2的排除，影响氧的溶解；的排除，影响氧的溶解；溢罐，导致浪费原料，引起染菌；溢罐，导致浪费原料，引起染菌；装液量减少，降低发酵罐的利用率。装液量减少，降低发酵罐的利用率。泡沫的控制：泡沫的控制：减少或补料添加容易起泡的原料，采用一些消泡剂。减少或补料添加容易起泡的原料，采用一些消泡剂。735.基质浓度基质浓度基质浓度的影响：基质浓度的影响：培养基营养成分过低，影响微生物生长和产酶；培养基营养成分过低，影响微生物生长和产酶；培培养基过于丰富，微生物生长过旺，导致发酵液粘稠改变养基
48、过于丰富，微生物生长过旺，导致发酵液粘稠改变溶氧量。溶氧量。菌体花费大量能量维持生存环境，而对产酶的能量支出大大降低。高浓度基质引起碳分解代谢物阻遏现象。高浓度基质引起碳分解代谢物阻遏现象。例：例：葡萄糖氧化酶发酵中，低浓度葡萄糖诱导该酶产生，而高浓度又有分解代谢物阻遏作用。降低葡萄糖用量，从8%降低至6%，补加2%氨基乙酸，部分解除阻遏作用，提高酶活26%74基质浓度的控制基质浓度的控制 补料补料 在发酵培养的过程中，间歇或连续的补加在发酵培养的过程中，间歇或连续的补加新鲜培养基的方法。新鲜培养基的方法。一方面，可以避免某种营养成分由于初始浓度过高一方面，可以避免某种营养成分由于初始浓度过高
49、而出现底物阻遏现象。而出现底物阻遏现象。另一方面，可以避免发酵中一次投料过多造成细胞另一方面，可以避免发酵中一次投料过多造成细胞大量生长所引起的溶解氧不足、发酵液粘稠等影响。大量生长所引起的溶解氧不足、发酵液粘稠等影响。75提高酶产量的措施提高酶产量的措施1.添加诱导物添加诱导物 对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的对于诱导酶的发酵生产，在发酵过程中的某个适宜的时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。时机，添加适宜的诱导物，可以显著提高酶的产量。例如，乳糖诱导例如，乳糖诱导-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶等。酶等。762.控制阻遏物浓度控制阻遏物
50、浓度阻遏物控制分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种阻遏物控制分为产物阻遏和分解代谢物阻遏两种 控制葡萄糖效应的方法：控制葡萄糖效应的方法：利用其他难利用的利用其他难利用的C源，源，如淀粉；分次流加如淀粉；分次流加C源；添加环腺苷酸。源；添加环腺苷酸。控制产物阻遏的方法：控制产物阻遏的方法：从培养基中去除终产物；从培养基中去除终产物；或加入某个抑制因子，阻断代谢途径限制末端产物积或加入某个抑制因子，阻断代谢途径限制末端产物积累，如组氨酸合成酶生产中加入累，如组氨酸合成酶生产中加入-噻唑丙氨酸。噻唑丙氨酸。773.添加表面活性剂添加表面活性剂 添加诱导物或降低阻遏物浓度存在成本问题（某些诱添加诱导物或
